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下载所得到的文件列表亚临界水对酪蛋白及其与乳糖体系结构和性质的影响.pdf
文档介绍：
本论文采用亚临界水对酪蛋白进行改性,分析其理化性质、结构和体外消
化活性的变化。同时采用亚临界水对牛奶中两种主要单体酪蛋白--LA)
体系进行处理,-LA 体系的美拉德反应(MR)进程、美拉
德反应产物(MRPs)的理化性质和结构的影响。
(1)随着亚临界水处理时间的延长,酪蛋白溶液的相对粘度下降而其褐变
程度逐渐增大。在 120℃亚临界水处理 20min 时酪蛋白的溶解度最大、乳化性
最高,处理 40min 时的起泡性最强,分别比未处理的酪蛋白溶液提高了 8.73%、
23.59%和 55.91%。然而,长时间的亚临界水处理反而会降低酪蛋白的溶解度、
乳化性和乳化稳定性等功能性质。
(2)经过亚临界水处理的酪蛋白,其自由巯基含量显著增加,α-螺旋结
构含量降低,无规则卷曲含量增加。分析得出亚临界水处理增加了蛋白质分子
柔性。酪蛋白溶液的颗粒大小在亚临界水处理过程中呈现先降后升的过程,而
其分子的表面疏水性却有相反的变化趋势。酪蛋白红外光谱(FT-IR)的变化以
及内源性荧光强度的降低,表明亚临界水能显著改变酪蛋白的三级结构。
亚临界水下酪蛋白的理化性质及结构的相关性分析结果表明,酪蛋白的各
个理化性质之间及其结构之间或多或少存在一定的相关性,酪蛋白的理化性质
和结构是一个综合影响的结果。
(3)对酪蛋白的体外消化过程进行研究,发现酪蛋白分子逐渐降解为一系
列的连续的具有较低分子质量的多肽。亚临界水处理能有效提高酪蛋白的体外
肠胃消化活性,提高了酪蛋白在机体内的消化和吸收。与未经亚临界水处理的
酪蛋白相比,亚临界水处理后的酪蛋白在胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的初始阶段,
氮释放量均急剧增大,之后增速变缓,但显著高于未处理的酪蛋白。
对酪蛋白水解度的研究表明,经过胃蛋白酶消化后的酪蛋白的胰蛋白酶的
消化程度急剧增大,分析其原因是酪蛋白经胃蛋白酶消化后暴露了大量的胰蛋
白酶作用位点,更容易被胰蛋白酶消化,从而使其水解度急剧增大。采用亚临
界水处理改变了酪蛋白结构,暴露出更多原本位于蛋白质分子内部的胃蛋白酶
结合位点,有效加快了胃蛋白酶的酶解效率。
(4)以酪蛋白-乳糖体系为研究对象,对亚临界水处理下该反应体系的美
拉德反应进程及美拉德反应产物的紫外-可见吸收光谱、红外光谱、荧光光谱等
光谱学特性,抗氧化性以及抑菌活性进行了研究。结果表明,亚临界水下反应
体系的 pH 下降、酪蛋白中赖氨酸、精氨酸含量显著降低。亚临界水能促进反
应体系的美拉德反应进程,使酪蛋白与乳糖发生共价交联,产生高分子聚合物。
通过对 MRPs 的还原力、DPPH 自由基清除能力和总抗氧化能力的测定,结果
发现:亚临界水处理可以有效提高 MRPs 的抗氧化能力。MRPs 的褐变程度与
抗氧化性相关性分析结果表明,两者具有较好的线性关系。通过对美拉德反应
产物的抑菌活性的研究,-LA 体系产生的 MRPs 对大肠杆
菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均未出现明显的抑菌作用。
关键词:亚临界水;酪蛋白;酪蛋白-乳糖体系;结构;功能性质;相关性分析
This research adopted subcritical water as the modified technology, then
analyzed the physicochemical properties, structure and activity in vitro digestion of
casein after subcritical water treatment. At the same time, the casein-lactose system
(CN-LA) consist the main monomer of milk was treated by subcritical water (SW) at
different times. The Maillard reaction (MR) process -LA, phychemical
properties and structure of the Maillard reaction products (MRPs) were determined.
The results were as follows:
(1)With the extension time of subcritical water treatment, the relative viscosity
of casein solution decreased gradually, while its degree of browning increased. When
the temperature of subcritical water up to 120℃, the solubility was reached to the
highest ater 20min treatment, the strongest foaming capacity of the casein solution
was obtained at 40min and the maximum emulsifying activity was obtained at 20min.
There were 8.73%, 55.91% and 23.59% improved than untreated samples,
respectively. Adopted an appropriate subcritical water condition could be helpful to
the functional properties of casein. However, the solubility, foaming capacity and
emulsifying activity of the casein woud be reduced under the prolonged treatment of
subcritical water.
(2)After subcritical water treatment, the content of free sulfhydryl group of
casein was increased significantly, the content of α-helix was decreased rapidly, and
the content of unorder was increased s1
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公开/公告号：CNA
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【说明书】：
技术领域本发明涉及根据由生物体内的荧光物质产生的荧光的强度，测定上述荧光物质的量的测定装置。背景技术近年来，伴随着饮食生活的欧美化，生活习惯病患者增加，医学上的社会问题日益严重。现在，日本的糖尿病患者为800万人，如果包括其后备军，据说会上升到2000万人。糖尿病的三大并发症为“视网膜病、肾病、神经系统病变”，而且糖尿病也是动脉硬化的主要原因，甚至可能导致心脏疾病、脑部疾病。糖尿病由于饮食习惯及生活习惯的紊乱、由肥胖带来的来自脂肪细胞的分泌物的影响、氧化应激，胰脏的功能下降导致控制血糖值的胰岛素不足或效力降低而发病。如果患上糖尿病，则表现出排尿的次数和量增加、口渴等症状，若仅是这些则没有是得病的自觉症状，因而大部分是通过医院等的检查发现的。这是“无声”的糖尿病患者多的原因。在医院等处，出现由并发症引发的异常症状后，病情大多已经发展，不容易痊愈。特别是，并发症多为难以治疗的疾病，因而需要与其它生活习惯病同样地重视预防。为了进行预防，不可缺少早期发现以及治疗效果判定，存在大量以此为目的的糖尿病的检查。在血液中存在异常量的糖质、脂质的环境下，如果出现氧化应激，则蛋白质与糖质或脂质发生反应，生成AGEs(AdvancedGlycationEndproducts：晚期糖基化终末产物)。AGEs是通过蛋白质的非酶糖基化反应(美拉德反应)形成的最终产物，呈黄褐色，是发出荧光的物质，具有与附近存在的蛋白质结合形成交联的性质。据说该AGEs会沉着并侵入到血管壁，与作为免疫系统的一部分的巨噬细胞作用，放出作为蛋白质的一种的细胞活素，引发炎症或引起动脉硬化。在糖尿病的情况下，伴随血糖的上升，AGEs也增加，因此通过监测AGEs，能够早期发现糖尿病或把握发展状况。作为像这样通过监测AGEs来筛查真正糖尿病的方法，提出了例如在专利文献1中记载的方法。在该方法中，对前膊的皮肤照射激发光，测定来自与皮肤胶原蛋白结合的AGEs的荧光光谱，通过将测定的荧光光谱与预先决定的模型进行比较来监测AGEs。由此，不侵入身体就能获取AGEs的数据。此外，专利文献2中记载有根据受光部接收的受光强度，确定被验体与接收被验体发射的荧光的受光部的相对位置的最佳位置的检测装置。此外，在专利文献3中记载有戴在耳朵上监测AGEs的装置。通过令耳朵等人体中比较小的部位为测定对象部位，能够使装置小型化。此外，虽然不是监测AGEs的装置，但作为令人体中比较小的部位为测定对象部位的测定装置的例子，可以举出专利文献4～6所记载的技术。它们是以指尖为测定对象部位，测定血中氧饱和度或脉搏的装置。现有技术文献专利文献专利文献1：日本公开专利公报“特表号公报(日公表)”专利文献2：日本公开专利公报“特开号公报(日公开)”专利文献3：日本公开专利公报“特开号公报(日公开)”专利文献4：日本公开专利公报“特开号公报(日公开)”专利文献5：日本公开专利公报“特开号公报(日公开)”专利文献6：日本公开专利公报“特开号公报(日公开)”发明内容发明要解决的技术问题在专利文献1记载的方案中，令作为测定对象部位的前膊置于放置台来检测AGEs。然而，在如专利文献1的记载那样将测定对象部位载置于放置台来测定荧光光谱时，前膊没有被固定，因此存在所测定的荧光光谱的强度(荧光强度)不稳定的问题。与此相对，在专利文献2～6记载的方案中，被验体、耳朵、手指等测定对象部位都某种程度上被固定。不过，该固定对于固定测定对象部位来说并不充分，仍存在荧光强度等的测定结果不稳定的问题。本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于实现能够得到稳定的测定结果的测定装置。解决技术问题的技术手段为了解决上述的技术问题，本发明的一个方式的测定装置，其根据由对生物体的测定对象部位照射的激发光激发的上述生物体内的荧光物质所产生的荧光的强度，测定上述蛍光物质的量，该测定装置包括：载置上述测定对象部位的载置部；夹持部，其与上述载置部相对，与上述载置部一起夹持上述测定对象部位；设置在上述载置部和上述夹持部中的任一者，出射上述激发光的出射部；设置在上述载置部和上述夹持部中的任一者，接收上述荧光的受光部；和固定力供给部，其将能够固定上述测定对象部位与上述受光部的相对位置关系的力经由上述夹持部供给到上述测定对象部位。由测定对象部位产生的荧光的强度依赖于存在荧光物质的测定对象部位的血管位置与受光部的距离。因此，当测定对象部位没有被充分固定时，由于测定对象部位的弹性等，上述血管位置与受光部的距离变化，荧光的强度不稳定。这里，根据上述的结构，能够使固定上述测定对象部位与上述受光部的相对位置关系的力经由上述夹持部被供给到测定对象部位。即，由固定力供给部产生的力被传递到夹持部，传递到夹持部的力被供给至测定对象部位。由此，测定对象部位的血管位置与受光部的距离被固定，能够抑制该距离随着时间的经过而变化，能够使所测定的荧光的强度稳定化。即，能够得到稳定的测定结果。此外，本发明的一个方式的测定装置中，也可以为：上述载置部和上述夹持部具有在夹持上述测定对象部位的状态下彼此相对的相对面，上述受光部从上述载置部或上述夹持部的相对面突出。根据上述的结构，由于受光部从相对面突出，因此能够将受光部的前端强力按在测定对象部位。即，测定对象部位按压在面积小于相对面的受光部的前端。由此，在从固定力供给部供给的力为一定的情况下，被供给到测定对象部位的每单位面积的力(圧力)变大。换言之，为了得到能够固定测定对象部位与受光部的相对位置关系的力，能够使得从固定力供给部供给的力与受光部没有突出的结构相比小。因此，即使令由固定力供给部供给的力更小，也能够使测定的荧光的强度稳定化。此外，本发明的一个方式的测定装置中，也可以为：还包括在上述受光部的周围形成的外缘部，上述外缘部具有与上述测定对象部位接触的外缘接触面。根据上述的结构，在受光部的周围形成有外缘部。由此，在受光部从相对面突出的结构中，与不具有外缘部的结构相比，与测定对象部位接触的面积扩大。因此，与不具有外缘部的结构相比，能够缓和在测定对象部位可能产生的疼痛。此外，测定对象部位按住面积小于相对面的外缘接触面。由此，在从固定力供给部供给的力为一定的情况下，与不具备外缘部且受光部不突出的结构相比，被供给到测定对象部位的圧力变大。换言之，为了得到能够固定测定对象部位与受光部的相对位置关系的力，能够使从固定力供给部供给的力与不具备外缘部且受光部不突出的结构相比小。因此，即使使由固定力供给部供给的力更小，也能够使所测定的荧光的强度稳定化。此外，本发明的一个方式的测定装置中，也可以为：上述受光部具有接收上述荧光的受光面，上述受光面位于比上述外缘接触面更靠里侧的位置，从而形成有凹部。根据上述的结构，受光部的受光面位于比外缘接触面靠里侧的位置。由此，在测定时测定对象部位与受光面不接触，因此能够将接收荧光的受光面维持为清洁的状态。此外，本发明的一个方式的测定装置中，也可以为：配置有相对于上述外缘接触面能够装卸的透光性部件。根据上述的结构，测定时，测定对象部位与透光性部件接触，因此测定对象部位与受光部的受光面不接触。因此，能够维持受光面的清洁的状态。此外，透光性部件能够装卸，因此在使用测定装置的用户变更时能够更换透光性部件。因此，能够实现卫生方面的提高。此外，本发明的一个方式的测定装置中，也可以为：在上述凹部内的侧面还设置有将入射的上述荧光反射的镜面部。根据上述的结构，测定对象部位与接收荧光的受光面由凹部分离。因此，有可能由于从测定对象部位发出的荧光被凹部内的侧面吸收，到达受光面的荧光的强度变弱。此处，根据上述结构，在凹部内的侧面设置有镜面部，因此由镜面部反射荧光。因此，能够在抑制从测定对象部位发出的荧光的强度变弱的状态下使荧光射入到受光面，因此能够高效地使荧光集中。此外，本发明的一个方式的测定装置中，也可以为，还包括：固定力传感器，其测定由上述固定力供给部施加的力的值；和固定力控制部，其根据上述固定力传感器的测定结果，控制上述固定力供给部，使得上述固定力供给部施加的力为规定的值以上。根据上述的结构，根据固定力传感器的测定结果，控制固定力供给部，使得施加于测定对象部位的力为规定的值以上。即，仅令上述规定的值为使得不发生荧光强度的经时变化的值，就能够使荧光强度稳定。此外，本发明的一个方式的测定装置中，也可以为：上述测定对象部位为指尖。
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美拉德反应体系的光谱特性、抗氧化活性及评价方法
美拉德反应(MR)是食品原料中的糖与氨基酸、肽、蛋白质等物质在热加工和贮藏过程中自然发生的一种非酶褐变，是食品化学中最复杂的反应过程。研究表明MR对食品的风味和色泽等感官品质起关键作用；美拉德反应产物(MRPs)是具有抗氧化活性的天然产物，在食品加工和贮藏过程中实现积累。食品体系的pH、水分活度、物料种类和比例、加热温度和时间等因素影响了MR机制、途径、产物种类等。目前，国外对MR的机制、动力学、产物性质、与人体健康的关系等方面做了深入的研究，但是国内很少对MR进行系统研究。赖氨酸是食品中对热敏感的氨基酸，极易发生MR，赖氨酸的MRPs广泛的存在于各种食品体系中。本文制备了赖氨酸的美拉德反应模拟体系和反应产物，分析了体系的光谱特性、产物的抗氧化活性、挥发性物质种类等；根据分析结果建立了美拉德反应过程中抗氧化评价方法，液态乳中美拉德反应程度的评价方法；以鳕鱼皮蛋白质为原料，探讨了制备肉香味的MR的可行性。
1．制备了不同pH、加热不同时间的赖氨酸-葡萄糖简单MR模型体系，分析了体系的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。结果表明，中性和酸性介质中，反应速率较碱性介质要慢；产物种类相对较少；颜色物质的分子量相对较低，且结构相对简单；碱性介质的颜色物质表现出典型的高分子量类黑素的可见吸收光谱特征，以及典型的糖基化终产物荧光光谱特征。中性和酸性介质中，反应体系的OD220nm、ODE94nm和OD360nm与时间显著线性相关(P＜0.001)；碱性介质中，体系的OD220nm、OD294nm在60min出现折点，增长速率减缓，表明环化、聚合等反应开始占据主要地位，反应进入终极阶段。
以小麦蛋白质复合酶水解产物为原料，配以还原糖和L-半胱氨酸，制备了产生肉香味的实际MR生产体系。分析了不同温度-时间组合下体系的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，结果发现，体系的紫外光吸收和荧光强度对MR程度的表征具有一致性。提示，采用简单的紫外-可见和荧光分光光度法可对复杂的MR产香过程进行实时检测，评价反应程度，优化工艺参数。
2．乳品中赖氨酸含量丰富，热加工时极易发生MR，使赖氨酸不能被人体消化利用，降低乳蛋白质的营养价值。乳品受热程度的有效评价是分析乳品品质的可靠方法之一。现有的乳品受热程度的评价方法比较费时、费力、且耗资较高。本文根据赖氨酸．葡萄糖MR体系以及产生肉香味的小麦蛋白反应体系中紫外-可见吸收光谱分析结果，即，中性和酸性介质中，反应体系的OD220nm、OD294nm与时间显著线性相关(P＜0.001)，提示可用分光光度法评价乳品受热程度。以酪蛋白-乳糖为原料，建立液态乳模拟体系，以乳工业常规处理温度对体系加热，分析样品的紫外-可见吸收光谱，发现样品在290nm～300nm左右有特征吸收峰。引入参数OD'max，即1g蛋白质mL-1溶液在290nm～300nm最大光吸收强度，发现OD'max与加热时间线性相关，表明参数OD'max可以评价样品的受热程度。OD’max较糠氨酸含量评价方法具有更大的适用范围，测定过程简便、快速，所需仪器是生产和研究单位常规分析设备。应用本文所建立的方法对34中商品液态乳进行了评价，结果表明OD'max能够快速、有效的区分产品的受热程度。
3．制备了不同pH、加热不同时间的赖氨酸-葡萄糖MRPs，分析了产物的抗氧化活性，特别是对铜离子的螯合作用。结果显示，赖氨酸．葡萄糖MRPs具有一定的还原能力、DPPH自由基清除能力和铜离子螯合能力。碱性介质产物活性显著高于中性和酸性介质(P＜0.05)；加热时间延长，产物抗氧化作用增强。一些小分子中间体对螯合铜离子有贡献，螯合铜离子使小分子物质发生电子重排，并使产物损失部分的还原能力和自由基清除能力。提示，赖氨酸MRPs的抗氧化作用是多方面的，部分铜离子螯合位点对还原能力和自由基清除能力有贡献。结合美拉德反应的光谱特性，建议了一种实际食品体系中美拉德反应过程中产物抗氧化活性快速、简便的评价方法。
4．MRPs中挥发性物质是热加工食品香味的主要来源之一。通过溶剂萃取-GC-MS联用仪分析了不同pH、加热不同时间的赖氨酸-葡萄糖MRPs中挥发性物质种类和相对含量。经NIST02质谱图库可鉴定的挥发物种类最多有26种，包括醛、酮、呋喃、吡喃、吡啶、吡嗪和吡咯类等各种食品风味物质。体系pH对产物种类具有决定性作用：碱性介质产物种类多于中性和酸性介质；碱性环境中主要是吡嗪类物质，中性和酸性环境主要是呋喃类物质，特别是酸性介质时几乎全部是呋喃衍生物。结果从理论上提示制备肉香味MR需在酸性环境进行，利于含硫致香物质的产生和积累。本文以鳕鱼皮蛋白质的复合酶深度水解产物为原料，对上述理论知识进行了简单应用，设计了产生肉香味的美拉德反应，产物香味丰满。通过SPME-GC-MS联用仪分析，鉴定出大量对香味有贡献的呋喃类、噻吩类、硫醇类、芳香族化合物、脂肪族和脂环族化合物及其他一些含氮的杂环化合物等物质。
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图3-5 葡萄糖与卵白蛋白羰胺缩合反应示意图
Fig.3-5 Illustration of reaction of OVA with Glucose
美拉德反应是氨基化合物与羰基化合物在一定的条件下发生缩合（即羰胺反应），在随后的反应过程中发生一系列的化学反应变化，最终生成褐色物质的过程[53]。一般来讲，美拉德反应过程分为两个阶段——初级阶段与高级阶段。初级阶段从还原糖的还原末端与蛋白游离氨基发生羰胺缩合开始，随后形成希夫碱等一些重要的小分子中间产物，然后经过Amadori分子重排形成N取代的1-氨基-1-脱氧-2酮糖。高级阶段从N取代的1-氨基-1-脱氧-2酮糖分子内C3和C4之间共价键的断裂开始，根据不同的反应条件经过三条反应路线，最终形成黑精的过程[42]。
当蛋白分子侧链上的游离氨基与还原糖的醛基末端发生脱水缩合后，卵白蛋白分子链上的氨基从游离态转变为结合态，因此，通过TNBS法[44]测定游离氨基数量变化可以确定还原糖与卵白蛋白的接枝率。
3.3.1反应时间对卵白蛋白接枝率的影响
图3-6 还原糖与卵白蛋白在50℃、相对湿度51.4%干热接枝率变化图
Fig.3-6 Grafting percentage of OVA with Sugar during the incubation of 50℃ and RH:51.4% 由于还原糖修饰的卵白蛋白在50℃、相对湿度51.4%的干热条件下溶解度损失较少，而在其它条件下由葡萄糖修饰的卵白蛋白溶解度极低，无法精确测定游离氨基含量。因此，我们选择在该条件下测定样品接枝率随反应时间变化趋势，在下文中一般也是以此条件下的样品做详细分析讨论。由图3-6可以看出：卵白蛋白与还原糖的接枝率在反
3结果与讨论
应前10天内呈现快速升高的趋势，在之后的10-25天中，升高的趋势逐渐趋于平缓。这可能因为在反应初期，还原糖优先与卵白蛋白分子表面氨基结合，使还原糖与卵白蛋白的接枝率出现了快速的上升的趋势。随着干热反应的持续进行，蛋白分子结构发生轻微的变化，在温度与湿度的双重作用下，蛋白分子链轻微的伸展，使得原来包埋于分子内部的氨基基团缓慢的暴露于分子表面，这样的一个过程使得蛋白与还原糖接枝率上升速率较为缓慢。
在图3-6中还可以看出：葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖与卵白蛋白的接枝率呈依次下降的趋势，这可能因为还原糖分子量越大，对其醛基末端与蛋白游离氨基发生的羰胺反应造成的空间位阻也就越大[49]。
3.3.2反应温度及湿度对卵白蛋白接枝率的影响
糖基化卵白蛋白在50℃干热第10天
糖基化卵白蛋白在60℃干热第10天
接枝率随相对湿度变化图
接枝率随相对湿度变化图
Fig.3-7 Changes on grafting of glycated
Fig.3-8 Changes on grafting of glycated
OVA incubated at three relative humility levels
OVA incubated at three relative humility levels for 10days at heating temperature of 50℃
for 10days at heating temperature of 60℃ 还原糖与卵白蛋白在70℃的干热条件下溶解度很低，测定结果误差较大，因此选择50℃和60℃下的两组样品来比较温度与湿度对还原糖与蛋白接枝率的影响。
图3-7与3-8为还原糖与卵白蛋白在不同条件下的接枝率变化图，从图中可以看出：还原糖与卵白蛋白的接枝率随相对湿度的提高呈现明显升高趋势，而且在50℃下升高的幅度比60℃时升高的幅度大。这说明相对湿度的不断提高对还原糖与卵白蛋白的接枝具有一定的促进作用，并随温度的升高这种促进作用呈逐渐减弱的趋势。一方面相对湿度的提高，可以使还原糖与蛋白表面氨基的反应速度加快；另一方面相对湿度的提高，有助于蛋白分子链的展开，从而使内部的氨基基团较快的暴露于分子表面。
江南大学硕士学位论文
3.4 荧光测定
J. E. Hodge等人发现美拉德反应高级阶段具有明显的荧光特性，该荧光体系是在激发波长为347nm，发射波长为450nm下有较强吸收[42]。 该荧光体系不同于蛋白质色氨酸残基的荧光光谱（λex=290nm，λem=336nm）。这说明美拉德高级反应的荧光特性并非来自蛋白质，而是自于美拉德反应过程中的小分子中间产物。Pongor等人[62]对美拉德高级反应的荧光性物质进行了研究，指出美拉德高级反应产生的许多小分子化合物具有较强的荧光性，但是大多数并不稳定，只有2-(2-糠酰)-4(5)-(2-呋喃)-1H-咪唑被鉴定出具有较强并且稳定的荧光性。因此，通过对OVA样品溶液的荧光性检测可以对美拉德高级反应进行的程度进行初步的判断[50-51]。
3.4.1不同温度下卵白蛋白荧光强度随干热时间的变化
图3-9 50℃、RH 51.4%时样品荧光强度与接枝率随时间变化曲线
Fig.3-9 Fluorescence and grafting percentage of glycated OVA incubated at 50℃ and RH 51.4%
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