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引物合成常见问题解析
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Q1.引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 (1)
去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH； (2)
耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应； (3)
封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应； (4)
氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。 Q2.引物合成后如何处理？ 切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。 纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。 定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。 储存：分装抽干。 Q3.需要什么级别的引物？ 根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
引物长度要求
纯度级别要求
一般PCR扩增
诊断PCR扩增
HEPD, PAGE
20base左右
亚克隆，点突变等
根据实验要求定
HEPD, PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）
根据实验要求定
根据实验要求定
根据实验要求定
PAGE, HPLC
Q4.引物的质量是不是跟序列有关？ 四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者，国内公司一般都做不了20个G以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。 鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d（G）都能得到同样的非常好的结果。 Q5.需要合成多少OD数？ 根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。 Q6.如何计算引物的浓度？ 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算： V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量 引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。 Q7.如何计算引物的Tm值？ 引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。 长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size＊ ＊公式中，Size =引物长度。 Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？ 非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns-62. NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。 常规碱基分子量
Molecular Weight
常规修饰基团分子量
5’-Biotin
3’-TAMARA
5’-(6 FAM)
3’-Dabsyl
3’-(6 FAM)
3’-Amino Modifier C3
3’-Amino Modifier C7
3’-Thiol Modifier C3
Q9.如何溶解引物？ 干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。 Q10.如何保存引物？ 引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。 干
粉：运输时常温运输，-20℃可以保存一年。 储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃可以保存半年。 工作液：常规使用，4℃保存，也可-20℃保存，但应避免反复冻融。 修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。 Q11.最长可以合成多长的引物？ 我们合成过100base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。 Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高? 主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。 Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？ 连接反应需要引物的5'磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。 Q14.为什么引物的OD260/OD280小于1.5？ 需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3
Q15.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？ 通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。 Q16.如何检测引物的纯度？ 实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。 Q17.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？ 如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
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qPCR 引物篇（4）-------BioTNT 引物筛选/primer 浓度的说明
BioTNT 关于引物浓度的使用说明 引物primers &分为以下三种： 1、合成的干粉引物： 合成的干粉引物，浓度一般为2OD； 是以O.D.260单位来计量的。1 O.D.260值系指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，于260nm波长下的吸光度为1A260。 1 O.D.260 值相当于33ug的oligo (国际统一标准),而每个碱基的平均分子量一般以330道尔顿进行计算。客户可根据此数据和oligo的分子量得到摩尔数以计算溶液浓度。分子量计算公式如下:MW=(A碱基数×312) + (C碱基数×288) + (G碱基数×328) + (T碱基数×303)-61摩尔数的计算公式如下:nmol数 = & O.D.值×33(ug)÷1000MW 例: 序列GTTGAGTGCTGGGCGTAG, OD260值为2, 加1000ul消毒双蒸水溶解: A= 2 & & &C= 2 & & G= 9 & & T= 5 & & & &MW = (2×312) + (2×288) + (9×328) + (5×303) -61=5606 & & & & 质量数 = 2×33ug= 66ug & & & nmol数 = 66×=11.77 nmol ● Oligo 呈干粉状黏附在试管壁上,打开时极易散失,所以开试管前应先离心,然后小心打开管盖.配液时请加入适量双蒸水溶解,充分振荡5-10分钟。 ● 本核苷酸的5’和 3’端均为羟基，若需加连磷酸基团，则需另外处理。● 如对oligo进电泳分析，请用含7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳和1倍TBE缓冲液，不可使用琼酯糖电泳。为了防止加样时的扩散和二级结构影响，上样前需用饱和尿素处理。 & &● -20℃以下长期保存。
举例：引物合成单上标注10nmol；可以用100ul的水复溶，得到100umol/l浓度的储存液； 2、部分实验室使用的引物工作液浓度： 部分实验室习惯将引物工作浓度定为10umol/l; 即在干粉引物复溶后的储存浓度100umol/l的基础上稀释10倍，得到10umol/l的工作浓度；进行PCR 反应时，通常在10ul 体系中加入0.2ul上游引物，0.2ul的下游引物，得到200nmol/l的终浓度；或者在10ul 体系中加入0.4ul 上游引物，0.4ul的下游引物，得到400nmol/l的终浓度；优点：引物工作浓度较高，可以作为储存浓度；缺点：使用时加样体积过小，容易产生较大的加样系统误差； 3、BioTNT 引物筛选提供的引物浓度： BioTNT 为了方便客户使用，提供的引物浓度为2umol/l， 在终反应体系里是10*的浓度，即20ul 体系中，上游引物加入2ul，下游引物加入2ul。
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新手提问：1个od的引物一般能做几次PCR?
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一般试剂公司寄回来的引物,你先用TE或水稀释成100uM的浓度,（看说明就可以了）,然后工作浓度你需要再稀释10倍,按25 ul体系的话,你一般就可以加1微升就可以了,如果你的基因不够量大的话,为了报证PCR出来的条带比较清晰的话,你可以稍微加一点的量,如1.5 ul在25 ul体系,体系扩大了,就再加量就行,
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很多次，具体来说，如果你的引物长度在22-28之间的话，可能需要45-50微升左右TE或水稀释成100uM的浓度，然后再稀释成工作液，保守估计得450 ul，按25 ul体系的话，需要1ul引物，这样就能做450次，要是50微升体系，能做225次。
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金華市婺城區健康人群麻疹抗體水平監測
中國計劃免疫 2000年第1期第6卷 短篇報道
作者：傅桂芳 黃子達 趙小娟 季春富
單位：金華市衛生防疫站，浙江 金華 321000
分類號：R511.1 文獻標識碼：B
文章編號：X（40－01▲
為了解健康人群麻疹抗體水平，我們于1998年11月在金華市婺城區，分東、西、南、北、中隨機抽取仙橋、秋濱、乾西、羅店、城中5個鄉（鎮、街道）的257人，采用微量血凝抑制（HI）試驗監測麻疹抗體，現將結果簡報如下。
1 麻疹HI抗體陽性率和幾何平均滴度（GMT）
共監測健康人血清257份，麻疹HI抗體陽性（≥1∶2）238人，陽性率92.61％；GMT為1∶8.21。
2 不同性別麻疹HI抗體陽性率和GMT（表1）
本次監測男性健康人血清131人，麻疹HI抗體陽性121人，陽性率92.37％，GMT為1∶7.82；監測女性126人，抗體陽性117人，陽性率92.86％，GMT為1∶8.64。男女性別之間麻疹HI抗體陽性率、GMT的差異均無顯著的統計學意義（χ2＝0.0226，P＞0.05；t＝0.7327，P＞0.05）。
表1 金華市婺城區不同性別健康人群麻疹抗體陽性率和GMT
率（％）
HI抗體（1∶）
（1∶）
3 不同鄉麻疹HI抗體陽性率和GMT（表2） 本次監測的5個鄉中，麻疹HI抗體陽性率為89.36％～100.00％。GMT為1∶5.08～1∶11.39。5個鄉麻疹HI抗體陽性率之間差異無顯著的統計學意義（x2＝5.64，P＞0.05）。但城中麻疹HI抗體GMT明顯低于羅店（t＝2.5066，P＜0.05），極明顯地低于乾西、秋濱、仙橋3個鄉（t＝3.1422，t＝3.1931，t＝5.1257，P＜0.01）。
表2 金華市婺城區不同鄉健康人群麻疹抗體陽性率和GMT
率（％）
HI抗體（1∶）
（1∶）
4 不同年齡麻疹HI抗體陽性率和GMT（表3） 本次監測的4個年齡組中，麻疹HI抗體陽性率為84.91％～97.44％，GMT為1∶5.36～1∶9.92。30～50歲組麻疹HI抗體陽性率與其它3個年齡組的差異有顯著的統計學意義（χ2＝8.7674，P＜0.05）。
表3 金華市婺城區不同年齡健康人群麻疹抗體陽性率和GMT
率（％）
HI抗體（1∶）
（1∶）
本次監測結果表明，抗體滴度1∶2～1∶8的高達60.08％，1∶16～1∶64的僅占39.92％。隨著易感者的積累，人口流動頻繁，當有病原體輸入時，仍有可能出現散在病例或局部大年齡組人群的麻疹暴發。
在監測人群中，麻疹抗體滴度以7～14歲組最高，這可能與目前實行的麻疹疫苗8月齡初免、7周歲再免疫的程序有關。再免疫可使免疫力下降者的麻疹抗體滴度上升。同時，給漏種者一個免疫機會，從而提高人群免疫水平。■
收稿日期：
日期：日 - 來自[]欄目
汕頭市區人群麻疹抗體水平及麻疹疫苗強化免疫血清學效果監測
中國計劃免疫 2000年第1期第6卷 論著
作者：郭昕東 吳榕生 李雪華 蔡仿潺 詹幼芳 謝云 江寧華
單位：郭昕東 蔡仿潺 詹幼芳 謝云 江寧華（汕頭市衛生防疫站，廣東 汕頭 515031）；吳榕生（汕頭市龍湖區衛生防疫站，廣東 汕頭 515041）；李雪華（汕頭市升平區衛生防疫站，廣東 汕頭 515021）
關鍵詞：麻疹疫苗；免疫效果；IgG抗體；監測
摘 要：為了解汕頭市麻疹疫苗（MV）強化免疫的效果和人群麻疹抗體水平，在2個區隨機抽取767名0～39歲健康人，應用酶聯免疫吸附試驗檢測麻疹IgG抗體。結果顯示：767人中抗體陽性595人，陽性率77.57％，幾何平均滴度（GMT）1：783。以1～12歲兒童抗體陽性率高（85.71％～98.44％），GMT則從6歲開始下降至中低等水平，抗體陽性率有隨年齡增長而下降的趨勢。觀察MV初種8～12月齡兒童94人，免疫成功率為96.81％；MV復種5～7歲兒童93人，免疫成功率61.29％；免疫后抗體GMT分別比免疫前提高28.4倍和3.1倍。不論是初種或復種，免疫前抗體處于中低等水平者其免疫成功率顯著高于免疫前高抗體水平者。
分類號：R511.1；R186 文獻標識碼：A
文章編號：X（2-03
Surveillance of Measles Antibody Level in Healthy Population and Observation on Serological Efficacy of Primary and Supplementary Immunization of Measles Vaccine in Shantou City
GUO Xin-dong, WU Rong-sheng, LI Xue-hua, et al.
（Shantuo Epidemic Prevention Station of Guangdong Province, Shantuo 515031, China.）
Abstract：This paper reported the results of measles antibody detection in 767 persons aged 0～39 years old in Shatuo city. The overall antibody positive rate was 77.57% and the antibody geometric mean titres (GMT) was 1:783. Seropositive rate of 1-12 years old age groups were the highest (85.71%～98.44%) than the other groups. After the age of 6, antibody GMT was shown to be middle and low level. The seropositive rate of measles antibody dropped along with the growth of age. 94 persons aged 0 year and 93 persons aged 5-7 years randomly selected from 767 persons were observed after vaccinating measles vaccine. The immune successful rate of them was 96.81% and 61.29% respectively. The GMT increased by 28.4 times and 3.1 times respectively. Whether basic immunization or reimmunization, there was a negative relationship between immunization successful rate and the measles antibody titer prior to immunization.
Key words：M V A Surveillance▲
我國實施兒童計劃免疫以來，麻疹疫苗（MV）在防制麻疹中已取得顯著的成效。為更有效地防制麻疹，根據衛生部《加速麻疹控制規劃指南》提出的策略，各地先后開展了MV強化免疫活動。為了解我市MV強化免疫效果和人群麻疹抗體水平，1998年底在落實廣東省布置的MV強化免疫活動中，進行了血清學監測，結果報告如下。
材料和方法
1 血清標本的采集
在MV強化免疫活動前，選取我市的升平、龍湖區，隨機對0～39歲部分健康人群進行靜脈采血，分離血清待檢。MV強化免疫后30～35天，在上列采血對象，已接受MV強化免疫的8～12月齡及5～7歲兒童，進行免疫后采血，與免疫前采集的血清同時進行麻疹IgG抗體檢測。
本次觀察對象使用的MV為蘭州生物制品研究所生產的凍干麻疹減毒活疫苗，批號：971202，有效期至日，省衛生防疫站抽查MV滴度為3.125 logTCID50／ml，每人皮下注射0.2ml。
3 實驗試劑及方法
病毒抗原、對照抗原及酶標記抗人IgG等檢測試劑由中國預防醫學科學院病毒學研究所提供。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測麻疹IgG抗體。
4 檢測結果判斷
麻疹IgG抗體滴度＜1：200為陰性，≥1:200為陽性。免疫后抗體陰性轉為陽性或免疫后抗體滴度比免疫前呈≥4倍升高為免疫成功。抗體水平劃分為3個水平：1:200為低抗體水平，1：800為中抗體水平，≥1：3 200為高抗體水平。
1 人群麻疹血清抗體水平
本次檢測的767人中，麻疹IgG抗體陽性595人，抗體陽性率77.57％，幾何平均滴度（GMT）1：783。其中8月齡未接受過MV免疫的兒童144人，抗體陽性率21.53％（31／144），GMT 1：119。1歲以上檢測623人，抗體陽性564人，抗體陽性率90.53％，GMT 1：1 209，其中1～12歲抗體陽性率較高（85.71％～98.44％），但抗體GMT從6歲開始下降至中低水平。人群抗體陽性率有隨年齡增長而下降的趨勢（χ2＝4.96，P＜0.05）（表1）。
表1 人群麻疹抗體水平調查結果
抗 體 滴 度 （1：）
（％）
（1：）
2 免疫成功率
兩次血清標本均符合實驗室要求的8月齡～兒童94人，初免成功率96.81％（91／94）；5～7歲兒童93人，復種免疫成功率61.29％（57／93）。不論是初種或復種，免疫前中低抗體水平者免疫成功率均顯著高于免疫前高抗體者，其差別均有極顯著的統計學意義（χ2＝32.66和24.74，P＜0.001）（表2）表2 MV初種及復種前后血清IgG抗體變化
免疫后抗體滴度（1：）
抗體滴度（1：）
GMT（1：）
＊為免疫前抗體GMT。3 免疫前后血清IgG抗體水平變化情況
初種免疫成功率觀察的94人中，免疫前抗體GMT1：126，免疫后上升到1：3 574；復種觀察的93人中，免疫前抗體GMT1：1 624，免疫后上升到1：5 042。免疫后抗體水平分別是免疫前的28.4倍和3.1倍。5～7歲復種MV前抗體水平＜1：200的3人中（均有初種的確切記錄），復種后仍有1人未出現抗體陽轉，提示復種仍不成功。
我國自70年代末開始實施兒童計劃免疫至今，計劃免疫工作已基本走上了科學化、規范化的軌道，特別是80年代后期的冷鏈裝備和兒童免疫程序的制定及實施，有效地保證了MV的接種效果。MV接種的推廣，使我國麻疹的發病率逐年下降。但是，近幾年由于易感人群的積累等各種因素的影響，麻疹的發病有所回升，麻疹局部暴發的報導也屢見不鮮。根據楊志偉、吳承民等〔1、2〕分析，我國除了麻疹發病率有所回升外，學齡前兒童發生麻疹的比例也見升高，給當前麻疹的防制工作提出了新的挑戰。為此，我省1998年修改了MV免疫程序，將7歲復種改在4歲完成，并在1998年底開展了全省性的MV強化免疫活動。結合這次活動，我們進行了人群免疫水平監測，結果顯示，我市市區兒童麻疹抗體陽性率雖然普遍較高，但抗體GMT從6歲開始降至中水平以下，說明我省修改MV復種程序的必要性。
根據有關資料報導，嬰兒胎傳抗體下降很快，一般在未到8月齡抗體陽性率就降至0～16.5％〔3～5〕，我們這次對144名8月齡～從未接受過免疫的兒童進行抗體監測，嬰兒胎傳抗體陽性率為21.53％，GMT 1：119。從嬰兒胎傳抗體下降情況及人群麻疹免疫水平監測結果可見，嚴格按照現行兒童免疫程序，及時進行MV的初種和復種是非常重要的。
本次對MV的初種和復種血清學效果觀察，結果顯示，國產MV不論是初種還是復種，均能獲得理想的免疫效果。這一結果，一方面證明了當前我國生產的MV具有良好的免疫原性，另一方面也說明了MV強化免疫的積極作用。
目前，我們對麻疹的免疫預防工作多數著眼于兒童，不論是MV初種還是強化免疫，受保護的重點均是以兒童為主。但當前麻疹的發病在一些地區大年齡兒童以至成人也見增多，我市市區人群麻疹抗體水平的監測，也提示大年齡兒童及成人的麻疹抗體僅達到中低水平，低水平的人群難以防御麻疹病毒的侵襲，他們仍有可能是麻疹的易感者。因此，如何提高大年齡兒童以至成人的麻疹免疫水平，防止麻疹在這部分人群中暴發或流行，也是當前麻疹防制工作中不能忽視的部分。對此，我們認為，可以考慮在開展MV強化免疫的同時，有針對性地將強化免疫范圍擴大到某些特定地區的成人，如流動人口集居地、學校及常規免疫工作薄弱地區，以提高整個人群麻疹的抗體水平。這樣從減少成人麻疹的發生及至減少兒童麻疹的發生都有積極的作用。■
作者簡介：郭昕東（1955－），男，廣東省潮安縣人，廣東省汕頭市衛生防疫站主管醫師，主要從事計劃免疫監測和管理。
參考文獻：
［1］ 楊志偉，張興錄，張建，等.我國麻疹流行現狀分析［J］.中國計劃免疫，）：14～18.
［2］ 吳承民.回顧麻疹流行史，論當今控制策略［J］.中國計劃免疫，）：181～183.
［3］ 楊宏徽，朱田鳳，楊進，等.母嬰麻疹血凝抑制抗體關系的研究［J］.中國計劃免疫，）：19～24.
［4］ 姚惠銘，沈明飛，何金觀，等.奉賢縣產婦與嬰兒麻疹免疫水平監測及當前麻疹控制對策［J］.中國計劃免疫，）：72～75.
［5］ 陳麗娟，辜蔭華，和京果，等.疫苗時代麻疹母傳抗體追蹤觀察及北京市麻疹控制策略的分析［J］.中國計劃免疫，）：8～13.
收稿日期：
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檢測麻疹IgM抗體對診斷麻疹的意義和麻疹IgM陽性病例的臨床表現
中國計劃免疫 2000年第2期第6卷 論著
作者：伍稚梅 李秀珠 徐天強 張金芳 許琪
單位：上海市疾病預防控制中心，上海 200031
關鍵詞：麻疹IgM；陽性率；臨床表現
摘要：分析了年456例采集血標本的麻疹確診病例和83例采集雙份血標本的麻疹確診病例的麻疹IgM抗體陽性率。發病后4～21天陽性率分別為92.86％和95.06％，而發病后1～3天和22～42天的麻疹IgM陽性率顯著較低。病例的同一份血清檢測麻疹和風疹兩種IgM抗體，說明麻疹陽性和風疹陽性互不干擾，各具特異性。分析270份麻疹IgM陽性的病例臨床表現，不同年齡組和有無免疫史的表現有極顯著差別。檢測麻疹IgM抗體具有高度特異性、敏感性和早期診斷的意義。
中圖分類號：R511.1 文獻標識碼：A
文章編號：X（85-03
The Diagnotic Significance of Measles IgM Antibody Detection by Capture ELISA and the Clinical Manifestations of Cases Showing Positive Measles IgM
WU Zhi-mei, LI Xiu-zhu, XU Tian-qiang, et al.
Shanghai Center for Disease Prevention and Control, Shanghai 20031, China.
Abstract: Analyzing 456 confirmed measles cases and 83 two serum samples of them, the measles IgM positive rate in the period of fourth to twentieth day of disease onset was 92.86% and 95.06%, but that was much more lower at 1st-3rd day and 22th-42th day of the disease onset. Analyzing 270 measles cases with positive measles IgM， the clinical manifestations appeared significantly different between different age groups and different history of immunity. Detection of measles IgM antibody is proved to be a good method for measles early diagnosis with specificity, sensitivity and speediness.
Key words: Measles IgM P Clinical manifestations
上海市對麻疹報告病例檢測麻疹IgM抗體已有10年，本文企圖探討檢測麻疹IgM抗體診斷麻疹的意義和麻疹IgM抗體陽性病例的臨床表現。
對象和方法
1 麻疹病例 接到傳染病報告后進行流行病學個案調查，并在急性期和恢復期檢測麻疹IgM、風疹IgM和麻疹血凝抑制（HI）抗體。麻疹IgM陽性者，或麻疹IgM陰性而HI抗體≥4倍增長者為麻疹病例。包括外來人口麻疹病例。
2 麻疹臨床表現 由各區、縣衛生防疫站計劃免疫專業人員到病家按統一的麻疹流行病學個案調查表進行調查，記錄臨床表現并參閱病人的門診或住院病歷，對病人訪視2～3次。
3 檢測方法 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）捕捉法檢測麻疹IgM抗體，以P／N值≥2.1為陽性。試劑盒由中國藥品生物制品檢定所或中國預防醫學科學院病毒學研究所供應。HI抗體檢測采用常規微量檢測方法，血凝素由上海生物制品研究所或中國藥品生物制品檢定所供應。
結 果
1 發病后不同天數麻疹IgM抗體陽性率
以發熱第1天作為發病日期，分析年456例麻疹確診病例（若麻疹IgM陰性，必有HI抗體≥4倍增長），不同病程麻疹IgM抗體陽性率有極顯著的差別（表1）。4～21天陽性率波動于92.35％～93.87％，與第1～3天的陽性率73.33％的差異有極顯著的統計學意義（μ＝88.63，P＜0.01），與第22天以后的陽性率84.62％～50.00％的差異亦有極顯著的統計學意義（μ＝3.4，P＜0.01）。
又分析年具有雙份血清的麻疹確診病例83例，第1份血清和第2份血清麻疹IgM抗體陽性率的差別有極顯著的統計學意義（μ＝62.55，P＜0.01），以發病后8～14天陽性率最高為97.50％；4～7天陽性率91.67％，29～42天陽性率46.29％～55.17％（表2）。雙份血清中第1份陽性、第2份陰性者占55.42％；第1、2份均陽性者29例，占34.93％；第1份陰性、第2份陽性者占9.65％。
表1 上海市年麻疹發病后不同天數的IgM抗體陽性率
采血距發病天數
陽性率（％）
表2 上海市年麻疹病例雙份血清標本的IgM抗體陽性率采血距發病天數
第1份血標本
第2份血標本
陽性率（％）
2 麻疹IgM抗體和風疹IgM抗體的關系
年臨床疑似麻疹860例，每例第1份血清同時檢測麻疹IgM和風疹IgM抗體。其中麻疹IgM 抗體陽性444例，陽性率51.63％；風疹IgM抗體陽性7例，陽性率0.81％；麻疹IgM陽性者無風疹IgM陽性；風疹IgM陽性者無麻疹IgM陽性；風疹IgM抗體陽性者結合臨床表現確診風疹。
年本市有風疹流行，臨床診斷風疹并發心肌炎或腦炎而送血標本102例，風疹IgM抗體陽性85例，陽性率83.33％。同時檢測麻疹IgM抗體，無陽性者。
3 麻疹IgM抗體陽性病例的臨床表現
分析年270例麻疹IgM抗體陽性病例的臨床表現：平均發熱4.63天，最高體溫＞38.5℃的高熱率97.70％；出疹由面部→胸部→軀干→四肢→手心腳心的順序占99.26％，皮疹從出現至全身出齊平均4.60天；柯氏斑在病程中能見率61.11％，有咳嗽者93.33％，有結合膜炎者79.26％，有卡他鼻炎者80.74％，并發肺炎率1.48％，未見其它并發癥。
不同年齡麻疹病例的臨床表現有極顯著差別（P＜0.01）。≥15歲的成人高熱率和有咳嗽率高；＜1歲嬰兒，柯氏斑、卡他鼻炎、結合膜炎、咳嗽癥狀的出現率高，有肺炎并發者的年齡是＜1歲和1～2歲者（表3）。
表3 上海市年麻疹IgM抗體陽性病例不同年齡的臨床表現
（歲）
＞38.5℃
身出齊
色素斑
表4 上海市年麻疹IgM抗體陽性病例不同免疫史的臨床表現
（歲）
＞38.5℃
身出齊
色素斑
對比有免疫史（初免8月齡，部分人4歲再免疫）和無免疫史（包括中學生或成人幼時免疫史不詳）兩組的臨床表現，有極顯著差別（μ＝11.07，P＜0.01）。有免疫史者無并發肺炎，柯氏班和卡他鼻炎出現較少（表4）。討 論
1982年Pederson I R介紹抗體捕捉ELISA法檢測麻疹IgM抗體。1986年郭可謇推薦此法檢測麻疹IgM抗體為一種理想而實用的診斷方法〔1〕。我市從1986年起在戴斌的建議下建立了檢測麻疹和風疹IgM抗體的方法，開始對疑似麻疹做監測工作。從本文資料中看出，檢測麻疹IgM抗體方法具有高度特異性，陽性者和麻疹臨床表現符合，和風疹IgM抗體同時檢測可以區別麻疹和風疹。
麻疹病人檢測麻疹IgM抗體陽性率在發病后不同天數有極顯著差別，發病（發熱）后第4～21天陽性率最高，發病初期1～3天和恢復期第4、5周陽性率僅為73％～50％，此結果和郭可謇〔1〕和戴斌〔2〕的報告接近。對麻疹病人采雙份血清標本，以第1份在發病后4～8天，第2份在發病后9～21天最好，單份血清標本可作早期診斷，雙份血清標本可提高陽性率。
不同年齡的麻疹病人臨床表現有差別，不同免疫史麻疹病人臨床表現也有差別，但應肯定大多數麻疹病人臨床表現仍是可以識別，而麻疹病人中的成人、大年齡青少年及注射過麻疹疫苗者麻疹IgM抗體陽性率也很高。
為消除麻疹，世界衛生組織美洲區要求每例疑似麻疹都采血檢測麻疹IgM抗體，并以此作為確診的主要條件〔3〕。衛生部在《加速麻疹控制規劃指南》中指出：“所有疑似病例都應進行實驗室診斷，………推薦的麻疹實驗室診斷方法是檢測血液中是否有麻疹IgM抗體存在。”通過上海資料，我們認為檢測麻疹IgM抗體，具有特異性、敏感性、早期診斷的價值，值得在消除、控制麻疹的工作中廣泛應用。
作者簡介：伍稚梅（1934－），女，浙江省瑞安市人，上海市疾病預防控制中心主任醫師。主要從事：傳染病的臨床和流行病學研究，重點是狂犬病、白喉、脊髓灰質炎、麻疹的免疫策略和預防措施。
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〔2〕 戴斌.麻疹疹斷與SIgM測定［J］.中國計劃免疫通訊，）：9～10.
〔3〕 WHO. Measles Eradication: Recommendations from a Meeting Cosponsored by the World Health Organization, the Pan American Health Organization, and CDC ［J］.MMWR, 1997, 46(RR-Ⅱ):1～19.
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血清和卵泡液中抗精子抗體對體外受精—胚胎移植的影響
免疫學雜志 2001年第1期第17卷 臨床免疫學
作者：宋蘭林 全松 陳東紅 閻宗合 邢福祺
單位：第一軍醫大學南方醫院婦產科，廣東 廣州 510515
關鍵詞：體外受精—胚胎移植；血清；卵泡液；抗精子抗體
摘 要：目的 評價女性抗精子抗體對體外受精—胚胎移植（IVF-ET）的影響。方法 采用ELISA法測定施行IVF-ET的婦女的血清和卵泡液中抗精子抗體（AsAb）。A組：血清AsAb陽性13例；B組：血清及卵泡液AsAb均陽性29例；C組：AsAb陰性158例。分析3組受精率、卵裂率、胚胎發育情況及臨床妊娠率和流產率的關系。結果 A、B組受精率、卵裂率明顯低于C組（P＜0.01）。移植日，A、B組Ⅰ—Ⅱ級胚胎率較C組低，IV級胚胎及2原核受精細胞增加（P＜0.05）。各組妊娠率及流產率無顯著差異（P＞0.05）。結論 AsAb對IVF和早期胚胎發育有損害，體外培養不能完全清除AsAb對IVF-ET的影響。
分類號：R321.2；R711.6 文獻標識碼：A
文章編號：（8-03
Effect of female antisperm antibodies in serum and follicular fluid on in vitro fertilization-embryo transfer
SONG Lan-lin（Department of Gynecologic and Obstetric，Nanfang Hospital， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China）
QUAN Song（Department of Gynecologic and Obstetric，Nanfang Hospital， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China）
CHEN Dong-hong（Department of Gynecologic and Obstetric，Nanfang Hospital， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China）
YAN Zong-he（Department of Gynecologic and Obstetric，Nanfang Hospital， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China）
XING Fu-qi（Department of Gynecologic and Obstetric，Nanfang Hospital， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China）
Abstract：Objective To evaluate the effect of female antisperm antibodies （AsAb） on in vitro fertilization-embryo transfer（IVF-ET）. Methods Concentration of AsAb of serum and follicular fluid in women undergoing IVF-ET was measured with ELISA. Group A：13 women with AsAb positive in serum， Group B： 29 women with AsAb positive in serum and follicular fluid， Group C： 158 women with AsAb negative. The IVF rate， cleavage rate， early embryonic development as well as clinical pregnancy and abortion rate were analyzed and compared among the three groups respectively.Results The IVF rate and cleavage rate in group A and B decreased significantly as compared with group C （P＜0.01） . On the day of embryo transfer，Ⅰ—Ⅱgrade embryo rate in group A and B were significantly lower than that in group C.However，gradeⅣand 2PN embryo rates increased significantly as compared with group C （P＜0.05）. There were no significant difference in pregnancy and abortion rates among the three groups （P＞0.05）.Conclusion AsAb may exert a detrimental effect on IVF and early embryonic development， which can not be overcome completely by improving in vitro culture.
Keywords：in vitro fertilization-embryo transfer；serum；follicular fluid；antisperm antibodies
作者簡介：宋蘭林（1962－），女， 浙江溫州市人，主管技師，大專，從事生殖和細胞遺傳學研究。 Tel：（020）；E-mail： 參考文獻：
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收稿日期：日
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出版日期：日
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HIV－1整合酶單鏈抗體在大腸桿菌中的表達、純化與鑒定
細胞與分子免疫學雜志 1999年第1期第0卷 論著
作者：張健慧 宋曉國 孟莉 馮玉英 韓保光 凌世淦 馬賢凱
單位：張健慧 宋曉國 孟莉 馮玉英 韓保光 凌世淦 馬賢凱(軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京100850）
關鍵詞：人類免疫缺陷病毒；整合酶；單鏈抗體
摘要 將具有HIV－1整合酶結合活性的單鏈抗體重組噬菌體感染HB2151大腸桿菌，經IPTG誘導，在周質腔萃取物及培養基上清中，均檢測到有較特異與整合酶結合的可溶性單鏈抗體的表達。利用HiTrapAnti?Etag柱對單鏈抗體進行了親和層析純化。Western－blot結果初步表明，單鏈抗體不僅可與整合酶的單體反應，而且也可與其二聚體結合。提示：研制的單鏈抗體可用于對HIV－1整合酶活性影響的研究。
中國圖書資料分類號 Q78
Expression, purification and identification of single chain fragments variable(ScFv) antibody against HIV－1 integrase(IN)
Zhang Jianhui, Song Xiaoguo, Meng Li, Feng Yuying, Han Baoguang, Ling Shigan, Ma Xiankai (Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)
Keywords
HIV integrase ScFv
Abstract E. coli HB2151 was infected with recombinant HIV－1 integrase binding ScFv phages. After induced by IPTG, expression of soluble ScFv characterized by specific binding to IN protein was detected in the bacteria periplasm and supernatant of culture medium. Using HiTrap Anti－E tag column, the ScFv was purified by affinity chromatography. The preliminary results of Western－blot showed that the ScFv could bind to both oligomer and dimer of IN protein. It was indicated that the ScFv could be used for study its possible role in inhibiting IN activities.
目前，AIDS的治療尚無特效療法。因病毒基因突變致機體迅速產生的抗藥性，要求不斷研制作用于HIV多個靶位的新制劑。HIV整合酶（integrase,IN)為HIVpol基因3＇端編碼的Mr為32000的蛋白質，它介導的病毒cDNA與宿主細胞染色體DNA的整合過程為HIV復制的基本步驟，因此，IN為治療AIDS的理想靶位之一〔1〕。為探索AIDS治療的新途徑，我們研制了HIV－1IN的噬菌體單鏈可變區抗體（single chain fragments variable,ScFv)。本研究將此ScFv在大腸桿菌中進行了可溶性表達與親和層析純化，并證明有較特異結合IN的活性。
1 材料和方法
1.1 材料 所用試劑均為AR或分子生物學純。重組HIV－1IN，由本實驗室制備。噬菌體單鏈可變區抗體：以重組IN免疫的Balb/c小鼠脾臟mRNA為來源，利用噬菌體表面呈現技術，獲得了ScFv重組噬菌體庫。經抗原親和富集，篩選出具有IN結合活性的單鏈噬菌體抗體，ScFvDNA序列分析表明，符合鼠的抗體序列，詳見參考文獻〔2〕。
1.2 方法
1.2.1 ScFv的可溶性表達 將與IN有結合活性的重組噬菌體感染培養至對數生長期的HB2151宿主菌（Pharmacia),30℃振搖1h。以感染菌涂布SOBAGN平板，30℃溫育過夜。挑取單個菌落以2×YT培養基于30℃培養過夜。將過夜培養物以1∶10接種于2×YTAG培養基中，37℃培養至A600值為0.8，更換為2×YTAI培養基，于30℃溫育20h～24h。
1.2.2大腸桿菌周質腔分泌物的萃取將過夜培養物以1500×g離心20min,菌體重懸于2％培養基體積的TES（0.2mol/LTris?HC1,0.5mmol/LEDTA,0.5mol/Lsucrose)中，再加入3.3％體積的1/5×TES混勻，置冰上40min,同上離心，以0.45μm濾膜過濾后，4℃保存。
1.2.3 培養基上清的硫酸銨沉淀 于培養基上清中，加入50％飽和度的硫酸銨，室溫攪拌1h,2500×g離心40min,沉淀重懸于PBS中，并以PBS反復透析24h。
1.2.4 ScFv的純化 由于ScFv的C端帶有13個氨基酸殘基的Etag肽，故利用HRP標記的鼠抗Tag IgG,用ELISA方法可檢測與IN結合的ScFv的表達情況，并可用HiTrapAnti-ETag親和層析柱對ScFv純化。
將1L培養菌的周質腔萃取物及經硫酸銨沉淀的培養基上清混合并超濾至10ml，上樣于已經結合緩沖液（0.2mol/LPB,pH7.0)平衡的HiTrapAnti－Etag親和層析柱（Pharmacia)上，樣品流速為5ml/min。先以結合緩沖液洗去雜蛋白后，再以洗脫緩沖液（1.0mol/L甘氨酸，pH3.0)洗脫結合在柱上的ScFv。將含有ScFv的組分立即以中和緩沖液（1.0mol/LTris,0.05％NaN3,pH8.2)調整至pH7.2,經紫外分光光度計定量后，4℃保存備用。
1.2.5 ELISA 純化的IN蛋白以0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至2μg/ml后包被酶聯板，37℃2h，用1％BSA4℃封閉過夜。加入以2％BSA稀釋的大腸桿菌周質腔萃取物或培養上清，室溫作用2h。洗滌后，加入稀釋的HRP標記的鼠抗ETagIgG,室溫繼續孵育1h～2h，洗滌后，OPD顯色10min，測A490nm值。
1.2.6 SDS－PAGE 參照文獻〔3〕進行。
1.2.7 Western?blot分析 ①ScFv表達產物的分析：將可溶性表達、純化的ScFv以SDS－PAGE分離后，轉移到硝酸纖維素膜上，加5％脫脂奶粉封閉過夜后，繼加鼠抗ETagIgG,室溫孵育2h，洗滌后用DAB底物顯色。②ScFv與IN結合活性的分析：純化的IN蛋白以SDS－PAGE分離后轉膜，同上封閉后，加入1∶100稀釋的純化ScFv，室溫作用2h，洗滌后加入HRP標記的鼠抗ETagIgG,同上孵育及顯色。
2 結果
2.1 ScFv的可溶性表達 克隆在pCANTAB5E噬菌粒（圖1）上的ScFv基因，其5＇端與基因3蛋白的分泌信號融合；3＇端通過ETagDNA片段與基因3結構基因融合。ETag與基因3間有一琥珀終止密碼子。在該終止密碼子非抑制表型HB2151大腸桿菌中，ScFv以游離形式表達，并在基因3信號肽介導下分泌到周質腔中進行折疊，形成功能性的ScFv。
圖1pCANTAB5E?ScFv表達質粒的結構（示意圖）
Fig 1 Construction of pCANTAB 5E-ScFv expression vector
我們將76個與IN有結合活性克隆的重組噬菌體進行了ScFv的可溶性表達。ELISA結果顯示，59個克隆的培養基上清及周質腔萃取物經1∶100稀釋后，均可檢出有IN結合活性的ScFv；而HB2151空菌的培養上清與周質腔萃取物均不與IN起反應。
根據測序結果，ScFv基因的全長為768bp(包括ScFv基因C端的ETagDNA片段），編碼256個氨基酸，經推算其表達產物的Mr為28000。由SDS－PAGE的結果（圖2）可見，ScFv的周質腔萃取物及培養上清經親和層析純化后，得到較純的Mr為28000的條帶，其下方還有兩條Mr較小的帶，推測可能為培養及純化過程中ScFv的降解產物。經Western－blot分析證實，Mr為28000的蛋白即為帶有E－Tag的ScFv；而其降解產物與Anti－ETag的結合活性較弱，僅見痕量的顯色帶。以Western－blot證實于上樣前的樣品中，也可測到明顯的Mr為28000的ScFv帶。
圖 2 ScFv的表達及其純化產物的Western－blot分析
Fig 2 Western－blot analysis of the expressed and purified ScFv
1:Protein relative molecular mass(Mr); 2:ScFv before purification (mixture of periplasmic extract and culture medium concentrated by (NH)2SO4 precipitation); 3:ScFv purified by HiTrap Anti－E T 4:Anti－E Tag binding characteristic of ScFv 23 loaded on lane 2; 5:Anti－E Tag binding characteristic of ScFv 23 loaded on lane 3
2.2 ScFv與IN蛋白的結合活性與特異性鑒定 如圖3所示，純化后的IN蛋白在SDS?PAGE分析時，除Mr為32000的帶外，在Mr約64000處還有1條很淺的蛋白帶，推測可能為IN蛋白的二聚體。以等量的標本上樣，經Western－blot分析鑒定證明，純化的ScFv不僅能與Mr為32000的IN蛋白結合，而且也可與微量存在的IN蛋白的二聚體起反應。
圖 3 ScFv與IN結合特性的Western－blot分析
Fig 3 Western－blot analysis of IN binding characteristic of ScFv
1:Protein relative molecular mass (Mr); 2:SDS? PAGE analysis of purified IN; 3: Western blot analysis of IN binding characteristic of purified ScFv
為鑒定ScFv與IN結合的特異性，我們分別以IN蛋白及等量的重組HIV穿膜蛋白（GP41）、重組HBV前S抗原（C/2)及人前列腺特異性抗原單克隆抗體（PSA）3種無關蛋白包被酶聯板，將1株純化的ScFv以BSA倍比稀釋后，同時進行ELISA檢測（圖4）。結果顯示，即使在較高稀釋濃度（1∶212）時，ScFv仍有結合IN蛋白的活性；僅在較高濃度（1∶23稀釋度以下）時，才顯示ScFv與GP41和C/2有輕微的交叉反應，而各濃度的ScFv與PSA蛋白均無反應。
圖4 ScFv與幾種蛋白的ELISA的反應性
Fig 4 Binding of the ScFv to various proteins showed by ELISA
3 討論
IN蛋白的難溶性是其晶體結構及活性位點的天然構象尚未完全明確，因而IN抑制物的發展及應用也受到了限制〔4，5〕。單鏈可變區抗體為近年來出現的基因工程小分子抗體，具有穿透性強、代謝快，對人體免疫原性弱等特點〔6〕。因此，研制IN特異性的ScFv，觀察其對IN生物學活性的影響，對發現新的IN抑制劑，探索AIDS治療的新途徑具有重要的意義。
以重組IN蛋白免疫的Balb/c小鼠mRNA為來源，我們利用噬菌體表面呈現技術，獲得了具有IN結合活性的ScFv重組噬菌體。經感染HB2151大腸桿菌，在周質腔及培養上清中，得到了可溶性表達的ScFv。將其以親和層析純化后證明，有較好的IN結合特異性。免疫印跡的結果初步表明，ScFv不僅可與IN蛋白的單體起反應，而且也可很好地與IN蛋白的二聚體結合。根據文獻報
道〔7〕，IN蛋白至少以二聚體的形式發揮其生物學功能。因此，和其二聚體結合是抑制IN活性的基礎，同時和IN單體結合也可能通過影響二聚體或多聚體的形成而發揮對IN的抑制作用。目前，我們正在設法提高ScFv的表達量及純化效率，鑒定ScFv的IN作用表位，觀察其體外對IN生物學活性的影響，從而探索其在AIDS治療中的作用。
作者簡介：張健慧，女，34歲，助理研究員，博士
北京市太平路27號，Tel.(010)
參考文獻
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(收稿 修回 ）
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崇左縣麻疹流行與健康人群抗體水平調查
中國計劃免疫 2000年第1期第6卷 論著
作者：劉明團 楊進業 楊春義 沈立萍 張世京 黃春光 謝信
單位：劉明團 楊進業 楊春義 沈立萍 黃春光（廣西壯族自治區衛生防疫站，南寧 530021）；張世京 謝信（崇左縣衛生防疫站，廣西壯族自治區 崇左縣 532200）
關鍵詞：麻疹；流行；IgG抗體
摘 要：月，崇左縣發生一起經流行病學、血清學和病毒學證實的麻疹流行。共報告316例病人，發病率為96.38／10萬。病例主要為學齡前兒童（109人）和中小學生（181人）。為查清本次麻疹暴發的原因，在該縣非流行區按分層整群抽樣的方法，抽取＜1歲～≥30歲健康人322人，用酶聯免疫吸附試驗檢測麻疹IgG抗體。結果抗體陽性率為61.80％，幾何平均滴度為1：327.15，部分人群抗體達不到控制流行的水平。提示該縣仍有發生麻疹流行的可能，應對14歲以下兒童普種MV，以形成免疫屏障。
分類號：R511.1 文獻標識碼：A
文章編號：X（20-03
Investigation on Relationship Between Antibody Levels Against Measles in Healthy Population and Measles Outbreak in Chongzuo County of Guangxi
LIU Ming-tuan, YANH Jin-ye, YANG Chun-yi, et al.
（Epdemic Prevention Sation of Guangxi Zhuangzu Autonomous Region, Guangxi, Nanning 530021, China.）
Abstract：A measles outbreak occurred in Chongzuo county in Guangxi in May-June 1998, with 316 cases reported and the incidence was 96.38/100,000. During this epidemic, serologic and virologic studies demonstrated that it was an outbreak of measles chief of preschool children (109 persons) and students of primary and middle schools(181 persons). 322 serum samples were collected from healthy population aged＜1 year-≥30 years old by stratified cluster-sampling method, and detected for IgG antibody by ELISA. The results showed an antibody positive rate of 61.80% and a GMT of 1:327.15, which did not reach the level for epidemic control. There still has possibility of outbreak, if once the wild measles virus is imported in. It is suggested that the immunization should be considered for children under age of 14, in order to control measles outbreaks.
Key words：M E S Surveillance▲
崇左縣位于廣西壯族自治區西南部，人口32萬,轄11個鄉108個村。月該縣發生一起經流行病學、血清學和病毒學調查證實的麻疹流行，疫情波及全縣11個鄉，報告麻疹病例316例，采取麻疹疫苗（MV）應急接種后，疫情迅速被控制。為了查明此次流行的原因，尋找防制對策，檢測了健康人群的麻疹抗體水平，現報告如下。
材料與方法
1 流行病學資料
對麻疹病人逐例進行個案調查，查閱衛生院的接種卡片，核實MV免疫史。根據《麻疹診斷標準及處理原則》（GB1）逐例核實診斷。
2 調查對象的選擇及血清抗體檢測
根據該縣麻疹的地域分布，選擇未發生麻疹的非流行區進行分層整群抽樣，共抽得322人為調查對象，按年齡分成6組：＜1歲、1～4歲、5～9歲、10～19歲、20～29歲和≥30歲，每人采血。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測IgG抗體，以抗體滴度≥1：200或P／N值≥2.1為陽性〔1〕。麻疹病人IgM抗體檢測，以抗體滴度P／N值≥2.1為陽性。試劑均由中國預防醫學科學院病毒學研究所提供。
1 流行強度
該縣麻疹發病率除1993年較高（67.79／10萬）外，其余年份均保持在15／10萬～20／10萬。本次流行共報告麻疹病人316例，發病率為96.38／10萬，病例分布在全縣11個鄉，尤以那隆、和平、城關3個鄉為多。
2 病例的性別和年齡分布
316例人中，男187例，女129例，男女性別之比為1.45：1。發病率以≤6歲兒童最高，為428.35／10萬（109／25 446）；其次為7～19歲中、小學生，為299.69／10萬（181／60 395）；≥20歲的僅26例。最小發病年齡為4月齡，最大35歲。
3 病人的免疫史
調查那隆鄉55例麻疹病人，≤6歲MV常規免疫率為56.25％（9／16）；≥7歲的常規免疫接種率為84.62％（33／39），兩者常規免疫接種率的差別有顯著的統計學意義（χ2＝8.50，P＜0.05）。
4 病人血清學和病毒學檢測
采集現癥病人血清7份，經用ELISA檢測，麻疹IgM抗體陽性5人，陽性率為71.43％。同時采集5份病人咽拭液，分離出病毒3株，細胞中和試驗鑒定為麻疹病毒，證實此次確是麻疹流行。
5 健康人群麻疹抗體水平
322人檢測了麻疹IgG抗體，陽性199人，陽性率61.80％，(GMT)為1：327.15。抗體陽性率和GMT最高的是≥30歲組，最低的是＜1歲組。各年齡組間抗體陽性率的差異有極顯著的統計學意義（χ2＝18.02，P＜0.01）（表1）。
表1 崇左縣不同年齡人群麻疹抗體水平
（歲）
血清抗體效價（1：）
（％）
（1：）
（％）
322人中，男性177人，抗體陽性104人，陽性率為58.43％，GMT為1：283.95；女性144人，抗性陽性95人，陽性率65.97％，GMT1：370.35。男女性別之間抗體陽性率和GMT均無顯著差異（χ2＝2.29，P＞0.05）；t＝1.46，P＞0.05）。
322人中，小學生105人，中學生67人，陽性率和GMT分別為51.43％（54／105）、82.09（55／67）和1：250.33、1：586.54，兩者之間有顯著性差異（χ2＝16.56，P＜0.01；t＝3.28，P＜0.01）。在農村和農場各檢測72和78人，麻疹IgG抗體陽性率和GMT分別為62.50％（45／72）、58.97％（46／78）和1：342.90、1：243.18，兩者的陽性率和GMT均無顯著性差異（χ2＝0.19，P＞0.05；t＝1.16，P＞0.05）。
6 健康人群抗體陽性與免疫史
統計了≤19歲217人的MV免疫史，其中≤9歲的126人，有免疫史的89人，抗體陽性47人，陽性率52.81％；未接種和免疫史不詳的37人，抗體陽性17人，陽性率45.95％。217人中，10～19歲91人，有免疫史的35人，抗體陽性27人，陽性率77.14％；未接種和免疫史不詳者56人，陽性39人，陽性率69.64％。討論
崇左縣1993年麻疹發病率為67.79／10萬，年麻疹發病率為15／10萬～20／10萬。雖然MV接種率不斷提高，達到86.11％～90.67％（年），但仍有一定數量的漏種、免疫失敗和免疫消退者，經過一定時間的積累，為麻疹的流行提供大量的易感者，加上鄉疫情報告系統不敏感，造成本次麻疹流行。
從本次麻疹患者的免疫史和健康人群抗體水平來看，≥7歲患者的常規免疫接種率為84.62％，而≤6歲患者的常規免疫接種率為56.25％。檢測5份＜4～7個月嬰兒血清抗體陰性，分析母親多數是通過MV免疫獲得保護抗體，抗體水平低或隨著時間推移抗體消失，使新生兒胎傳抗體低或無。從免疫效果分析，89例≤9歲有免疫史的兒童47例陽性，陽性率52.81％。造成此現象的原因可能是：①初免抗體陽轉后，由于復種不及時，抗體又陰轉。②接種質量差和冷鏈系統保存疫苗不當使疫苗滴度下降，免疫成功率低，導致小年齡組人群中大量為低抗體水平和陰性者，是麻疹野病毒侵襲的主要對象，這與小年齡麻疹發病多相一致。10～19歲（中小學生）麻疹抗體水平比≤9歲略高，與接種MV免疫成功率有關，也與自然感染有關，但仍有27.47％易感者及低抗體者。調查結果表明，本次流行發病年齡主要為≤6歲兒童，其次為7～19歲的中、小學生。說明MV常規免疫已不能保證在大年齡時不患麻疹；而小年齡兒童的發病仍以缺乏常規免疫為主。提示我們要控制麻疹流行，必須提高常規免疫接種率和免疫成功率，另一方面要提高麻疹監測的敏感性，對于高危人群要及時給予免疫。對崇左縣目前免疫現狀，應對≤14歲兒童進行一次MV普種。另考慮現行常規免疫8月齡提前2個月，即6月齡為初免，8月齡、1.5歲、4歲和7歲分別給予4次免疫〔2〕，以形成免疫屏障，控制麻疹流行。
男女性別之間抗體水平無明顯差別，顯示不同性別人群獲得免疫的機會是均等的。農村與農場之間麻疹抗體GMT和陽性率無明顯差別，但小學生與中學生之間抗體陽性率和GMT差異非常明顯。小學生多數來自于農村，自然感染麻疹機會較中學生少，也說明農村預防接種工作不夠扎實，冷鏈管理及接種技術都有待提高。因此有必要加強農村防保人員的培訓工作，確保高免疫覆蓋率和免疫成功率。
（本次調查統計學檢驗承蒙廣西壯族自治區衛生防疫站鐘革、趙鵬醫師協助，流行病學分析得到楊宏徽主任醫師指導，特此致謝）■
作者簡介：劉明團（1955－），男，廣西壯族自治區寧明縣人，廣西壯族自治區衛生防疫站主任技師，學士，研究病毒性疾病防治和分子生物學技術快速診斷方法。
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抗人血管生長素單鏈抗體可變區基因的定向克隆及序列分析
免疫學雜志 2001年第1期第17卷 短篇報道
作者：張宏斌 江悅華 王捷 楊太成 吳錦銀 李明
單位：張宏斌 江悅華 王捷 楊太成 吳錦銀（廣州軍區總醫院醫學實驗科，廣東 廣州 510010）；李明（第一軍醫大學熱帶醫學研究所，廣東 廣州 510515）
關鍵詞：血管生長素；抗體基因；測序
分類號：R392.11 文獻標識碼：B
文章編號：（2-02
Cloning and sequencing of variable region genes of the single strand antibody of anti-human angiogenin
ZHANG Hong-bin JIANG Yue-hua WANG Jie YANG Tai-cheng WU Jin-yin LI Ming基金項目：廣東省自然科學基金（960668）和軍隊自然科學基金（96D033）資助項目
作者簡介：張宏斌（1973－），男，陜西寶雞市人，碩士，主要從事腫瘤免疫學研究。 Tel：（020）；E-mail：zhangwater＠163．net
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修稿日期：日
出版日期：日
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人抗動物抗體及其對免疫分析的干擾
免疫學雜志 2001年第1期第17卷 綜述與講座
作者：楊朝國
單位：四川省衛生管理干部學院，四川 成都 610041
關鍵詞：人抗動物抗體；免疫分析；干擾
摘 要：人抗動物抗體可引起臨床不良反應，干擾動物源性抗體制劑治療或成像，干擾免疫分析而引起假性結果。臨床上可通過應用免疫抑制劑治療和人源性抗體、聚乙二醇處理的抗體或抗體Fab段制劑等方法防止人抗動物抗體應答形成；樣品預處理或分析技術的改進可消除人抗動物抗體對免疫分析的干擾。目前已設計出了多種分析技術檢測人抗動物抗體，并形成了檢測試劑盒，甚至床邊檢驗試劑。
分類號：R392.11 文獻標識碼：A
文章編號：（9-03
Human anti-animal antibody and the interference in immunological assays
YANG Zhao-guo（Sichuan Continuing Education College of Medical Sciences，Chengdu 640041，China）
Abstract：Human anti-animal antibody response may result in some adverse reaction interfere with antibodies from animal therapy or imaging，and cause both false-positive and false-negative test results in immunoassays Strategies to prevent the development of human anti-animal antibody responses include immunosuppressant therapy and the use of humanized，polyethylene glycolytated antibodies，or Fab fragment of antibody agents．Sample pretreatments or assay redesign can eliminate immunoassay interference caused by human anti-animal antibodies．Currently，several assays have been designed to detect human anti-animal antibodies．There are the assays available in kit form，even a simple point-of care test.
Keywords：Human Anti-animal Antibody；Immunological Assay；Interference
作者簡介：楊朝國（1964－），男，四川南充市人，副教授，大專，主要從事分子免疫學研究。參考文獻：
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