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我的转录因子是一个基因表达出来的，我想在细胞中研究，这个表达出来的转录因子对另一个基因的作用，是上调还是下调？
& &连接基因的载体上是不是应该有转录因子的结合位点呢？
& &想了很久，都没想出来，请问大侠们应该怎么做？
签到天数: 3 天[LV.2]偶尔看看I
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你可以做EMSA啊，看看那个基因上游序列会不会和这个转录因子结合，这是其一，其二你可以做酵母单杂，想看基因是上调还是下调表达，做瞬转，然后做western检测你目地基因的表达水平
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studying...................................................................
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这太简单了吧。
把转录因子基因型转回到生物体中，看它对基因表达有何影响，不就行了吗？
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生物秀举人
可以将被调控基因的promoter连到报告基因上检测转录因子是否影响启动子活性。。。对于预测特定结合位点的确定可以做emsa ，或对报告质粒做突变。。。可以用wb在蛋白水平上检测；rt在蛋白质水平上检测。。。检测时转录因子可以过表达和RNAi。。。。可以用chIP获得内源非artificial的证据。。。。。
从很多方面都能下手&&多看看文献就知道了
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生物秀举人
我想在细胞水平在做，应该怎么做呢？求赐教？？被调控基因和转录因子一起转染细胞吗？其中转录因子的超表达和干扰载体已经构建完毕，这样是不是可以通过WB检测蛋白水平，看是上调还是下调呢？
yanlichong
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生物秀举人
你说的这个是怎么做啊？没见过这种做法的，请赐教，谢谢！
该用户从未签到
我也在学习！互相交流。
该用户从未签到
有点高深了
该用户从未签到
可以先到NCBI上找到你的转录因子的基因的全长CDS编码框，构建他的真核表达载体，用他的引物在不同的细胞系的CDNA文库中跑一下PCR，最好转入到不表达这个转录因子的细胞中（如果都表达，那作个超表达也有参考价值），检测并确定其可以表达，同样将你的受其调控的基因构建成真核表达载体，一组与转录因子真和表达载体一起转到这个特定的细胞中去，另一组只转入你的受其调控的基因构建成真核表达载体，还有一组什么都不转做空白，分别提取RNA，做荧光定量PCR检测器表达量差异，如果结果好的话下一步可以做emsa，进一步证明此转录因子在目的基因的promoter上的结合情况。。
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩<meta name="dc.description" content="目的了解IER5蛋白经放射损伤后的表达变化，并筛选IER5蛋白在放射损伤后可能参与DNA损伤修复通路中的相互作用蛋白。
方法HeLa细胞经4 Gy γ射线照射后在不同时间点收集细胞，提取总蛋白质和细胞核蛋白行Western blot检验；构建3×Flag标签融合表达的IER5蛋白表达载体，转染人肾上皮细胞293T并照射，收集细胞行免疫沉淀富集IER5的结合蛋白，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离免疫共沉淀复合物，考马斯亮蓝染色观察差异条带并切胶酶解后行质谱分析，对可能相互作用蛋白结果进行Western blot验证。
结果IER5蛋白照后4 h表达逐渐增加，12 h至高峰，持续至48 h；细胞核内IER5蛋白表达也有增加趋势；质谱分析数据表明，照射组检测出374个蛋白，对照组检测出256个蛋白，两组比较差异蛋白41个，照射组中包括与DNA结合、代谢、损伤修复相关的10个蛋白；其中，与DNA损伤修复密切相关的1型聚ADP核糖基化聚合酶（PARP1）得到Western blot验证。
结论IER5是放射损伤相关蛋白，其可能参与DNA损伤修复通路。
<meta name="dc.description" xml:lang="en" content="ObjectiveTo investigate the expression of radiation-induced IER5 protein and screen its potential interaction proteins that may participate in DNA repair process.
MethodsHeLa cells were irradiated with 4 Gy ionizing radiation. IER5 protein expression in whole cell lysate and in nuclear fraction were detected by Western blot at different timepoints after irradiation. 3×Flag-IER5 pCMV plasmid was constrcuted and the Flag tagged-IER5 expression was verified by Western blot. 293T cells were transfected with 3×Flag-IER5 pCMV plasmid. After irradiation the cells were collected and proteins were extracted. The IER5 interaction proteins were purified using immunoprecipitation and separated by 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Then the binding proteins were cut from the gel and analyzed by Mass spectrometry.
ResultsThe expression of IER5 protein began to increase 4 hour post-irradiation and its peak level was observed at 12 hour post-irradiation, and it lasted until 48 hour after irradiation. The expression level of IER5 protein in whole cell lysate and nuclear fraction were both increased. With the mass spectrometry analysis, a total of 347 proteins and 256 proteins were identified in irradiated and non-irradiated groups, respectively. Fourty one differential proteins were obtained, where 10 proteins were associated with DNA metabolic process and DNA rapair in the irradiated group and the poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) protein was further confirmed by Western blot.
ConclusionsIER5 protein is an DNA damage related protein, and it may participate in DNA repair process.
宫颈癌细胞放射损伤后IER5蛋白表达及其相互作用蛋白的筛选和验证
&&&&2017, Vol. 37 Issue (4): 246-250
吴玉梅. 宫颈癌细胞放射损伤后IER5蛋白表达及其相互作用蛋白的筛选和验证[J]. 中华放射医学与防护杂志, ): 246-250, DOI: 10.3760/cma.j.issn.17.04.002.
宫颈癌细胞放射损伤后IER5蛋白表达及其相互作用蛋白的筛选和验证
1. 100006 北京 首都医科大学附属北京妇产医院;
2. 100850 北京 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 放射生物学北京市重点实验室
基金项目: 国家自然科学基金（）；北京市医院管理局临床医学发展专项经费（ZYLX201705）
通信作者: 吴玉梅, Email:
了解IER5蛋白经放射损伤后的表达变化，并筛选IER5蛋白在放射损伤后可能参与DNA损伤修复通路中的相互作用蛋白。
HeLa细胞经4 Gy γ射线照射后在不同时间点收集细胞，提取总蛋白质和细胞核蛋白行Western blot检验；构建3×Flag标签融合表达的IER5蛋白表达载体，转染人肾上皮细胞293T并照射，收集细胞行免疫沉淀富集IER5的结合蛋白，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离免疫共沉淀复合物，考马斯亮蓝染色观察差异条带并切胶酶解后行质谱分析，对可能相互作用蛋白结果进行Western blot验证。
IER5蛋白照后4 h表达逐渐增加，12 h至高峰，持续至48 h；细胞核内IER5蛋白表达也有增加趋势；质谱分析数据表明，照射组检测出374个蛋白，对照组检测出256个蛋白，两组比较差异蛋白41个，照射组中包括与DNA结合、代谢、损伤修复相关的10个蛋白；其中，与DNA损伤修复密切相关的1型聚ADP核糖基化聚合酶（PARP1）得到Western blot验证。
IER5是放射损伤相关蛋白，其可能参与DNA损伤修复通路。
宫颈癌&&&&
免疫共沉淀&&&&
质谱分析&&&&
Preliminary screening of novel IER5 interacting proteins after ionizing irradiation
Yu Xinping1,
Zhou Pingkun2,
1. Beijing Obstetric and Gynecological Hospital, Capital Medical University, Beijing 100006, C
2. Institute of Radiation Medicine, the Military Medical Sciences, Beijing Key Laboratory for Radiobiology, Beijing 100850, China
Fund programs: National Natural Science Foundation of China (); Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201705)
Corresponding author: Wu Yumei, Email:
[Abstract]
To investigate the expression of radiation-induced IER5 protein and screen its potential interaction proteins that may participate in DNA repair process.
HeLa cells were irradiated with 4 Gy ionizing radiation. IER5 protein expression in whole cell lysate and in nuclear fraction were detected by Western blot at different timepoints after irradiation. 3×Flag-IER5 pCMV plasmid was constrcuted and the Flag tagged-IER5 expression was verified by Western blot. 293T cells were transfected with 3×Flag-IER5 pCMV plasmid. After irradiation the cells were collected and proteins were extracted. The IER5 interaction proteins were purified using immunoprecipitation and separated by 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Then the binding proteins were cut from the gel and analyzed by Mass spectrometry.
The expression of IER5 protein began to increase 4 hour post-irradiation and its peak level was observed at 12 hour post-irradiation, and it lasted until 48 hour after irradiation. The expression level of IER5 protein in whole cell lysate and nuclear fraction were both increased. With the mass spectrometry analysis, a total of 347 proteins and 256 proteins were identified in irradiated and non-irradiated groups, respectively. Fourty one differential proteins were obtained, where 10 proteins were associated with DNA metabolic process and DNA rapair in the irradiated group and the poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) protein was further confirmed by Western blot.
Conclusions
IER5 protein is an DNA damage related protein, and it may participate in DNA repair process.
[Key words]
Cervical cancer&&&&
Immediate early response 5&&&&
Immuniprecipitation&&&&
Mass spectrometry&&&&
宫颈癌是女性第三大恶性肿瘤[]，其放射治疗中存在的放射不敏感，使宫颈癌治疗效果不令人满意，所以寻找宫颈癌放射敏感性靶标是近年来众多学者关注的热点问题。
IER5(immediate early response 5) 是早期反应基因之一，基因芯片结果发现放射损伤诱导其表达[], 是放射损伤暴露剂量相关的DNA损伤修复蛋白生物标记物[]。本研究组前期经实时定量PCR方法验证放射损伤后IER5基因在mRNA水平上表达发生变化[]。有文献报道，IER5在宫颈癌组织中较正常宫颈组织表达增加了89.3倍[]。IER5是否可作为宫颈癌治疗新靶标及其作用机制还有待进一步阐明。本研究拟在蛋白水平上验证IER5放射后变化，并筛选出IER5在放射损伤后的相互作用蛋白，为进一步研究放射损伤后的作用机制奠定基础。
材料与方法
1.主要试剂与仪器：ANTI-FLAG M2 Affinity Gel、Flag抗体、0.25%胰蛋白酶 (美国Sigma-aldrich公司)，Lipofectamine2000 (美国Invitrogen公司)，M-PER蛋白裂解液 (美国Thermo公司)，DMEM、胎牛血清 (美国Hyclone公司)，IP裂解液NETN100 (本实验室配置：Tris-HCL pH=8.0, 20 mmol/L，EDTA 1 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，NP40 0.5%)，蛋白酶抑制剂混合片剂cocktail (瑞士Roche公司)，IER5多克隆抗体 (美国Abcam公司)，proteinA/G plus-agarose、PARP1抗体、Histone H1抗体 (美国Santa Cruz公司)，GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠二抗、HRP标记的兔抗山羊二抗 (北京中杉金桥公司)，细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司)。
2.细胞培养：HeLa细胞及人肾上皮细胞293T (军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验室) 使用DMEM培养基培养，含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，置于5%CO2，37 ℃恒温培养箱。使用0.25%胰蛋白酶消化分离，进行传代。
3.细胞转染：取对数期293T、HeLa细胞转染，密度70%~90%，转染前换为双无培养基，100 mm培养皿转染8 μg质粒3×Flag\|IER5，质粒与脂质体 (质量：体积=1：2) 分别与双无培养基作用5 min，混合后继续作用20 min，加入培养皿中，十字摇匀，6 h后换正常培养基。转染36~48 h后照射并收集细胞，两种细胞均分别设照射组，将处理后未照射细胞分别设对照组。验证实验使用HeLa细胞。
4.细胞照射：采用军事医学科学院辐射中心60Co γ辐射源进行单次照射，照射总剂量4 Gy，吸收剂量率为91.54 cGy/min，源靶距为3 m。
5.免疫共沉淀：293T细胞转染36 h后进行4 Gy照射，照后1 h收集样品。预冷PBS洗2遍，PBS吹落混匀细胞，4 ℃，3 000 r/min，离心半径7 cm, 离心3 min，弃上清，每组加入NETN100裂解液6 ml+100×cocktail 60 μl冰上裂解15 min，4 ℃ 12 000 r/min，离心半径7 cm, 离心10 min，取上清，各留100 μl做细胞总蛋白input；于proteinA/G plus-agarose预吸附混悬1.5 h，4 ℃ 2 000 r/min，离心半径7 cm, 离心1 min，取上清，于anti-flag-beads混悬4 h，4 ℃ 2 000 r/min，离心半径7 cm, 离心1 min，弃上清，NETN100混悬清洗3×8 min，最后加100 μl NETN100，与6×上样缓冲液混匀后沸水煮10 min，-80 ℃保存。
6.免疫印迹 (Western blot)：HeLa细胞照后1、2、4、6、8、12、24、48 h收集细胞于离心管中，加入蛋白裂解液100 μl，冰上裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min，离心半径7 cm，离心10 min，取上清并测浓度；另取受照后0.5、2、8 h细胞，抽取细胞核内蛋白，方法参照试剂盒说明书。根据蛋白浓度电泳上样100 μg；质谱样品细胞总蛋白input及IP各取8 μl上样。10%SDS-PAGE胶恒压电泳，100 V电转膜90 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，孵育，PARP1抗体、Flag抗体、IER5抗体、GAPDH抗体、Histone H1抗体4 ℃过夜，TBST洗一抗，10 min×3次，室温孵育相应二抗1 h，TBST洗10 min×3次，化学发光法显影。
7.数据处理：蛋白定量分析使用Image J软件进行分析，所有实验独立重复至少3次，质谱鉴定的蛋白质用在线分析软件DAVID进行功能注释和分析。
1. HeLa细胞受照后IER5蛋白表达量的变化：结果显示，细胞受照后，IER5蛋白表达上调，于照后4 h蛋白水平开始增加，12 h蛋白水平至高峰，蛋白表达增至2倍，并持续至48 h，见。受照后，核内IER5蛋白有增多趋势，照后0.5 h核内IER5蛋白即有升高，见。
图 1 Western blot检测HeLa细胞4 Gy照射后不同时间点IER5蛋白的表达
Figure 1 Western blot analysis of IER5 protein expression in Hela cells after 4 Gy irradiation
图 2 Western blot检测HeLa细胞4 Gy照射后不同时间点细胞核内IER5蛋白表达
Figure 2 Western blot analysis of IER5 protein in the nucleus of HeLa cells after 4 Gy irradiation
2. Western blot检测转染3×Flag-IER5融合蛋白的表达：使用p-CMV载体构建3×Flag-IER5融合表达质粒，瞬时转染至HeLa细胞，48 h后Western blot检测结果见，3×Flag-IER5载体成功表达，标签抗体及目的抗体均能识别。
图 3 Western blot检测HeLa细胞3×Flag-IER5融合蛋白表达
Figure 3 Western blot analysis of 3×Flag-IER5 protein
3.质谱结果及筛选：免疫共沉淀复合物SDS-PAGE分离并染色后，条带切胶送质谱分析。分析质谱得出数据，照射组检测出374个蛋白，对照组检测出256个蛋白，两组间比较，匹配肽链数≥2的差异蛋白有41个。使用DAVID在线工具进行蛋白功能分类，照射组中与DNA结合、代谢、损伤修复相关的蛋白包括10个，见。
表 1(Table 1)
表 1 质谱分析联合DAVID在线分析软件筛选出与IER5相互作用蛋白
Table 1 MS and DAVID online datebase analysis of IER5 interacting proteins
蛋白质编号
蛋白质名称
相对分子质量
匹配肽链数目
gi|7582386
B淋巴细胞瘤2相关转录因子
gi|1806048
DNA解旋酶Ⅱ
聚ADP核糖基化聚合酶
核内不均一核糖核蛋白E1
gi|4503841
X射线交叉互补修复蛋白6
3-磷酸甘油醛脱氢酶
尿嘧啶DNA糖基化酶
gi|1575536
无义转录稳定调节因子
gi|5881961
外切核酸酶2
表 1 质谱分析联合DAVID在线分析软件筛选出与IER5相互作用蛋白
Table 1 MS and DAVID online datebase analysis of IER5 interacting proteins
4.质谱结果验证：根据质谱分析的结果，选择PARP1蛋白进行质谱样品验证，结果显示，PARP1与IER5在细胞发生放射损伤后存在明显的相互作用关系，对照组也同样检测到PARP1(考虑可能对照组PARP1蛋白量少而质谱未能检测出)，照射后相互作用蛋白增多。同时, 本实验也采用HeLa细胞重复了上述实验，验证了此结果，见。
图 4 Western blot检测IER5免疫共沉淀复合物中的PARP1蛋白
Figure 4 Western blot analysis of IER5 and PARP1 interaction
图 5 HeLa细胞验证IER5免疫共沉淀复合物中的PARP1蛋白
Figure 5 Analysis of IER5 and PARP1 interaction in HeLa cells
早期研究提示，IER5基因可能在肿瘤增殖或患者预后、细胞代谢、细胞有丝分裂中发挥重要的作用[-]。近年来的研究进一步表明，IER5基因作为DNA损伤相关基因，可作为接受放射损伤后剂量评估的生物标记物，但其参与的机制却未阐明。
本研究组前期通过RT-PCR方法验证了放射损伤后IER5基因在HeLa、AHH-1细胞mRNA水平随剂量、时间变化而波动，本实验以HeLa细胞作为研究对象，验证了IER5在蛋白水平上放射损伤后表达变化，其表达于照后4 h开始增加，12 h出现高峰，并持续至48 h，结果与前期研究结果一致。目前，DNA是公认的电离辐射主要靶目标，细胞受照后的大部分生物学改变理论上是与DNA损伤相关，通过一系列信号传导而进行DNA损伤修复、周期调控或者凋亡[]。有研究显示，IER5蛋白于细胞质和细胞核内均有分布[]，而本研究结果观察到，在放射损伤后IER5蛋白在细胞核内有增加趋势，所以推测放射损伤后细胞核内IER5蛋白发生变化，可能参与DNA损伤修复的某一过程，同时也指引了今后深入研究的方向。
本实验进一步采用免疫共沉淀方法富集到IER5相互作用蛋白，通过质谱分析及DAVID在线蛋白质功能注释，共筛选出10个与DNA代谢、损伤修复相关功能蛋白，比如B淋巴细胞瘤2相关转录因子参与Bcl-2家族蛋白转录调控[]，DNA解旋酶Ⅱ参与DNA解螺旋过程[]，核内不均一核糖核蛋白E1在DNA复制及调控转录翻译都有作用[]，X射线交叉互补修复蛋白6，即KU70蛋白，是DNA双链断裂非同源末端连接修复通路中的重要因子[]，尿嘧啶DNA糖基化酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶在细胞核内起尿嘧啶糖基化酶的作用[]，无义转录稳定调节因子和外切核酸酶2主要参与mRNA的调控[]，组蛋白H3是维持染色体结构重要的核蛋白[]。其中，最感兴趣的是PARP1蛋白，有研究证实，PARP1是催化多聚ADP核糖化的蛋白酶，在基因转录、DNA损伤修复、细胞凋亡等中起着重要的作用[]。更为通俗的理解是PARP1参与到细胞众多的应激应答过程中，在DNA损伤修复方面，PARP1主要在DNA单链断裂修复或碱基切除修复途径中发挥作用，但PARP1活性被抑制后会因DNA单链损伤未修复而后发生DNA复制，造成DNA双链损伤。尤其在BRCA1突变的肿瘤中更加明显，因无法对DNA双链断裂进行修复，其对PARP1抑制剂更为敏感，DNA损伤程度累积及异常的DNA末端连接，而导致细胞生长阻滞及凋亡[]。在女性恶性肿瘤前两位的乳腺癌及卵巢癌的治疗中，PARP1的抑制剂已成功用于临床[-]。本研究通过质谱分析并已初步验证IER5与PARP1存在相互作用，而且放射损伤后两者相互作用增强，因此，设想在宫颈癌中高表达的IER5与PARP1存在相互作用，能否在宫颈癌的治疗中有新的治疗突破点。接下来将继续验证两者相互作用方式、时效关系及功能影响等，争取有更深一层的研究突破和进展。
本文研究者及家属, 未因进行该研究而接受任何不正当的职务或经费利益, 在此对研究的独立性和科学性予以保证
作者贡献声明
于新平执行项目的研究, 撰写论文；马腾、周平坤、吴玉梅设计研究方案，分析讨论研究结果，修改论文
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Indexed by&&&SCIE, EI ...
Bimonthly&&&&Since 1986
:<font color="#7-123&&&&DOI:
Special Issue on Computational Challenges from Modern Molecular Biology
蛋白质组学中质谱数据的计算分析所面临的挑战
Challenges in Computational Analysis of Mass Spectrometry Data for Proteomics
Bin Ma (马斌)
Cheriton School of Computer Science, University of Waterloo, Canada
Dingsheng Technologies, Beijing 100085, China
Download: [ 386KB] &
摘要&质谱技术极大地改变了蛋白质组学的研究模式，即从&逐个蛋白，人工密集&模式转变成&计算密集，高通量&模式。在质谱技术中，计算技术的作用是无可替代的&。另一方面，质谱数据的规模和复杂程度都给数据分析带来了很大的挑战，本文试图尽可能全面地介绍这些挑战以及最新的进展。
---蛋白质鉴定的数据库搜索方法
C1：精确预测肽段的理论质谱；
C2：衡量肽段和质谱之间相似性的打分函数；
C3：肽段鉴定结果的性能评估，即有效估计假阳性率(False positive rate)；
C4：&one hit wonders&，即当某个蛋白质仅仅只有一个肽段被质谱匹配时，如何准确鉴定蛋白质；
C5：蛋白质鉴定结果的性能评估；
C6：联合使用一级质谱和二级质谱进行蛋白质鉴定；
C7：由于同源蛋白质常常会包含相同的肽段，在这种情况下，如何从肽段匹配结果中准确推断出蛋白质；
C8：质谱质量评估，以去除噪音质谱；
C9：和固定修饰(fixed PTM)相比而言，可变修饰(variable PTM)对数据库搜索方法带来很大的麻烦，因为在这种情况下，一个氨基酸可能发生，也可能不发生修饰。多个氨基酸的可变修饰造成搜索空间呈指数级增长，因此需要开发有效的搜索算法；
C10：目前质谱仪器能够高通量地产生质谱，因此要求算法与软件实现必须能够处理大量的数据；
---肽段测序的De Novo方法
C11：为提高De Novo方法的性能，如下问题是值得考虑的：1）快速的组合搜索算法。理论上总质量等于给定值的肽段数目是指数数量级的，因此需要快速的搜索算法。2）和上述组合搜索相适合的，精确的打分函数设计；3）有效处理不理想质谱，比如谱峰丢失现象，异常断裂模式生成的谱峰识别问题等；4）使用不同质谱仪生成的多张质谱联合推断；
---使用同源序列库提高肽段/蛋白质鉴定性能
C12：使用同源序列库提高肽段/蛋白质鉴定性能。虽然数据库中未包括目标蛋白质，但是如果包含与其同源的序列的话，依然可以有效地提高序列鉴定的性能。为完成这个目标，需要修改经典的序列比对统计模型，比如考虑De Novo错误的同源比对算法。
---蛋白质完全测序
C13：使用MS/MS技术对目标蛋白质进行完全测序。一些前驱性工作包括1) 手工拼接：先使用De Novo技术鉴定出各酶切片段的序列，然后将这些序列人工拼接成完全序列；2) 自动化预处理：先从各酶切片段的质谱计算出中间量，称作前缀质谱(prefix residue mass spectrum)，然后将这些前缀质谱拼接成一个总的质谱。如何进行全自动的完全测序，是值得关注的问题。
---PTM鉴定
C14：结合MS/MS与序列信息鉴定PTM。目前已经有工作从序列出发预测出哪些氨基酸会发生哪些PTM，如果再结合质谱信息的话，有希望准确鉴定PTM；
C15：适宜于PTM的序列-质谱相似性度量：PTM对质谱的影响是多样的，有些PTM仅仅影响氨基酸的质量，从而造成质谱的简单偏移，还有一些PTM会严重影响肽段的断裂方式，从而造成质谱发生很大的改变。因此，需要设计能够考虑PTM的序列－质谱相似性度量。
C16：未知PTM的自动发现：对每个氨基酸枚举其所有可能PTM会造成搜索空间的指数级增长，因此一种自动检测未知PTM的方法是很有意义。一些已有的工作包括1)质谱与序列的比对发现PTM；2）质谱－质谱比对发现PTM；
---糖基结构确定
C17：使用质谱数据确定糖基结构：和其他PTM不同，糖基化不仅会造成氨基酸质量的变化，同时还会形成不同的结构。一般来说，糖基是有多个糖原形成的树状结构，连接糖原的化学键在质谱仪中会发生断裂，形成一些离子，并混杂于肽段形成的离子中。不同于肽段线性结构，糖基形成树状结构，从而导致鉴定的复杂性。已有的工作包括1）使用酶切技术分离出糖基，然后使用质谱技术鉴定糖基结构；2）直接通过糖基化蛋白质的质谱鉴定糖基的结构。上述工作使用动态规划或者启发式算法逐步构建出糖基的整体结构。已有工作证明了糖基结构确定问题是NP-Hard的，因此需要开发有效的实用算法。
---质谱数据库搜索
C18：高质量质谱数据库构建：随着带序列标注信息的质谱数据的快速累积，将待鉴定质谱与已标注质谱进行直接比较成为一种质谱鉴定的有效方法。这条路线的首要之处在于质谱序列标注的质量控制；
C19：在质谱数据库中快速搜索相似质谱：随着质谱数据库的增大，如何进行快速的质谱比对，是值得研究的内容；
C20：同一肽段的带PTM质谱与不带PTM质谱的快速比对与发现：对于同一个肽段来说，如果能够通过比对发现其含有不同PTM的修饰产物，无疑是有意义的工作；
---蛋白质定量
C21：保留时间(retention time)校正：经典的肽段/蛋白质定量方法是基于蛋白质的同位素标定，最近无须同位素标记(label-free)的方法日益得到重视，其优势在于无须同位素标记样品制备、避免样品制备等过程的错误引入等，更重要的在于可以在不同蛋白质之间进行比较。
对存在于不同蛋白质的同一肽段来说，其保留时间大致相同，但是在不同反应中依然会存在较小的变化，因此首先需要进行校正。比如，通过多个样本的保留时间进行校正。
C22：特征肽段(peptide features)检测：存在于多个样品中的共同肽段称作为特征肽段。从质谱保留时间数据中发现特征肽段，称为特征肽段映射(mapping)。在建立映射并计算每个特征肽段的强度之后，特征肽段可以用来计算不同样本之间的比例。
C23：肽段特征匹配：
C24：依据肽段表达量计算蛋白质表达量：原则上，可以由肽段表达量推断出蛋白质的表达量，然而此步计算需要解决两个困难：1）共同肽段问题。如果两个蛋白质含有一个共同肽段，那么此肽段的表达量如何合理分配给这两个蛋白质。2）肽段表达量计算中的错误去除。
C25：PTM定量：含某种PTM的蛋白质/肽段的表达量是多少，是非常有意义的问题。利用保留时间信息有助于计算PTM定量。
---非标准蛋白质测序
C26：含二硫键肽段的肽段测序：常见的蛋白质通常呈线性结构，而含有多个Cystine的蛋白质会形成二硫键，从而导致质谱发生特异性变化；
C27：非核糖体合成蛋白质(non-ribosomal protein, NRP)的测序：非核糖体蛋白质通常呈环状或者分支结构，也会导致质谱发生特异性变化；
C28：从多个肽段的混合质谱中鉴定肽段：如果多个肽段具有相同的母离子质量，则其二级质谱会混杂在一起，因此如何从混合质谱中鉴定出所有肽段序列，是值得研究的；
---&自顶向下&(top-down)蛋白质鉴定
C29：&自顶向下&(top-down)蛋白质鉴定：传统的蛋白质鉴定方法都是采用&先酶切，测肽段&的策略，随着新型质谱仪器的出现，可以无需酶切步骤，直接对整个蛋白质加多个电荷获得整体质谱。因此，有必要开发新的打分函数以适应完全不同的断裂规律。
---肽段的可检测性
C30：精确预测肽段是否形成二级质谱：研究表明，即使是来源于同一个蛋白质，有些肽段会更容易形成可观察到的二级质谱，而有些肽段则更不容易产生质谱，其原因大致可归纳为：1）酶切步骤中的遗漏；2）肽段上PTM导致二级质谱未观察到；3）肽段在LC步骤丢失；4）肽段离子化不充分，从而在一级质谱阶段因强度较弱而未检测到；5）肽段断裂异常导致产生异常二级质谱。预测肽段形成可观测二级质谱的可能性有助于蛋白质定量。
---多质谱联合进行肽段鉴定
C31：使用多级质谱进行肽段/蛋白质鉴定与测序：由于断裂不完全等原因，往往会形成低质量质谱。多级质谱是解决此问题的一种可行方案。
C32：使用多类质谱进行肽段/蛋白质鉴定与测序：此外，还可以采用多类质谱，比如断裂规律不同的CID和ETD，联合进行质谱鉴定和测序。
---质谱数据压缩
C33：质谱数据文件压缩与管理：随着质谱数据的快速累积，如何进行压缩以降低磁盘空间需求，是有实际意义的；
---保留时间预测
C34：精确预测二级质谱的保留时间：每个二级质谱都关联一个保留时间，即相应肽段从LC上被洗脱的时间。原则上保留时间是能够重现和预测的。对二级质谱保留时间的精确预测，能够有效地校验肽段鉴定结果，并提高鉴定性能。
---质谱预处理
C35：噪声谱峰去除与去迭和(deconvolution)算法：质谱中往往包含一些噪声谱峰，识别并去除噪声谱峰能够有效提高后续步骤的性能。噪声谱峰识别的难点在于如何处理谱峰重合。ESI离子化过程容易产生带多个电荷的离子，因此需要先将多电荷离子形成的质谱变换成单电荷离子形成的质谱，然后再进行后续鉴定步骤。现有依赖于同位素谱峰的方法需要处理谱峰重合的情况。
---生化标记物发现
C36：从质谱数据直接发现生物标记物：对蛋白质鉴定结果的分析能够有助于发现新的生化标记物，最近的研究表明能够从质谱数据出发直接发现生化标记物。
Abstract：
Mass spectrometry is an analytical technique for determining the composition of a sample. Recently it has become a primary tool for protein identification and quantification, and post translational modification characterization in proteomics research. Both the size and the complexity of the data produced by this experimental technique impose great computational challenges in the data analysis. This article reviews some of these challenges and serves as an entry point for those who want to study the area in general.
Keywords：
Received ;
引用本文: &&
马斌.蛋白质组学中质谱数据的计算分析所面临的挑战[J]& Journal of Computer Science and Technology , ): 107-123
Bin Ma.Challenges in Computational Analysis of Mass Spectrometry Data for Proteomics[J]&
Journal of Computer Science and Technology, ): 107-123
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