选择一种恰当的质粒是影响基因表达的关键因素。请看Figure1.我们尝试利用10种不同的质粒构建成的融合质粒表达相同的虫荧光素酶报告基因，这10种融合质粒表达出的虫荧光素酶基因的表达水平各异。本文将告诉您影响基因表达的质粒因素。
Figure1.虫荧光素酶报告基因表达水平依赖于空载质粒的类型。以上是虫荧光素酶报告基因在THP1和HUVEC细胞中在4小时、24小时和48小时中的表达水平。在THP1细胞中，质粒DNA的量为0.3-0.5μg。HUVEC细胞中质粒DNA的量为2.5-4.4μg。
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1.&启动子强度启动子的类型是否适用于现在的细胞类型？Table1展示了在不同的细胞类型中启动子的强度时不同的。尽管CMV在大多数哺乳动物细胞中属于较强的启动子，但是另外的启动子可能会在我们研究的这种细胞中有较强的表达(例如BHK-21细胞中SV40启动子)。
2.&内含子许多研究者认为最理想的基因表达需要基本的内含子的剪切，然而这个观点并不是总被大家认可。内含子的位置和强度会影响转录、mRNA的输出和聚腺苷酸化。这样，依赖于内含子的位置，内含子甚至会导致基因表达的降解。
3.&IRES(内部核糖体进入位点)内核糖体剪切位点质粒，启动子驱动两种基因的表达，一个是感兴趣的克隆基因(经常是处在上游基因)，另一个是报告基因，通常编码GFP蛋白。IRES质粒表达的mRNA是双顺反子信使，意味着两个基因都在相同的mRNA分子上。两种基因的双顺反子数量是一样的，但是两种基因的翻译起始水平存在极大的不同。核糖体结合上游基因的起始位点是相当有效的，然而IRES却会让核糖体与下游基因的结合和翻译处于一个较低的水平。下游基因通常是GFP，因此GFP的表达水平就会低于没有IRES序列的质粒表达。而通常没有IRES序列的GFP质粒的表达水平我们认为是正常的。可以通过构建两种基因的融合质粒或者共转染实现表达相同数量的感兴趣的蛋白和GFP蛋白。
Figure2A显示了报告基因GFP处于IRES的上下游的不同位置，Figure2B显示了当GFP位于IRES的下游时，GFP的表达显著的下降。这项研究适用于GFP报告基因，同样也适用于虫荧光素酶报告基因。
Figure2.报告基因的表达水平依赖于在IRES表达载体上的位置。
你的质粒包含IRES序列吗？如果包含的话，它是位于质粒的什么位置呢？插入的两种基因的任何一种有可能会影响mRNA双顺反子的稳定性。两种基因的蛋白表达水平不是完全一样的。因此，由于报告基因低的表达水平，可能会造成对质粒表达真实效率的低估。对于报告基因在IRES下游的报告基因的检测，一定要用非常灵敏的检测方法。
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4.&LTR(病毒长的末端重复)许多质粒的表达利用逆转录病毒的LTR的启动子和增强子，然而当这些质粒被转染进入特定类型的细胞中时，可能会受到这些细胞对于其表达的抑制。尽管这种抑制机制未完全阐明，很有可能是因为来自于逆转录病毒的启动子或者增强子在某些原代细胞或者细胞系中不能很好的工作。唯一的解决办法就是利用传统的启动子例如CMV(e.g.,pmaxCloning Vector),EF1a或者SV-40将基因重新克隆至新的载体上。
5.&质粒的大小在实验室中我们通常会使用4-7kb的质粒，而Lonza的Nucleofection可以转染长至20kb的质粒。若是更长的质粒可能会导致转染效率的降低。通常的规则是，质粒长度越长，越难进入到细胞内。这个规则适用于电穿孔的方法以及脂质体介导的方法。
6.&报告基因用什么报告基因呢？报告基因需要满足几个要求：安全、重复性好、能定量、灵敏度好等。细胞内源性的该种基因表达水平不能太高，下游检测时需简单方便。当更换一种报告基因或者转染方法时，必须用目前使用的这种转染方法对报告基因的表达水平做动力学的评估以确定最佳的检测时间点。例如虫荧光素酶报告基因，当使用Nucleofection或者脂质体转染两种不同的转染方法时，其表达的动力学是不一样的（Nucleofection方法是在转染后6-16小时达到最高点，脂质体的方法是在24小时后达到最高点）。研究发现，虫荧光素酶报告基因的表达动力学与转染方法有关，与质粒载体和细胞类型无关。报告基因的表达水平还依赖于mRNA和蛋白的稳定性，我们用Nucleofection转染后比较了虫荧光素酶和β-gal的表达水平(Figure3)。对HUVEC细胞共转染虫荧光素酶报告基因和β-gal。这两种报告基因的动力学表现出明显的不同。虫荧光素酶报告基因的表达在转染后16小时后的表达就开始明显下降；然而，β-gal的表达在转染后10小时达到最高然后维持表达。若选择一个最佳的检测时间点的话，如果是24小时，那就已经错过了虫荧光素酶报告基因的最佳检测时间，也不足以代表真实的基因表达水平。因此，虫荧光素酶报告基因的推荐的最佳检测时间应该是转染后6-16小时，而β-gal或GFP的最佳检测时间是转染后10-48小时。
Figure3. 虫荧光素酶和β-gal报告基因转染后表达动力学的不同。虫荧光素酶报告基因在转染后6-16小时表达达最高点，而β-gal的表达在转染后可维持数天。
7.&检测方法报告基因的检测方法有很多种。例如GFP下游的检测方法有荧光显微镜、流式细胞仪、荧光读板仪。如果只是想得到一张图像的话，可用荧光显微镜，若想得到定量结果，则可以用流式细胞仪或荧光读板仪的方法进行准确定量。
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8.&融合质粒VS.共转染融合蛋白的表达水平依赖于转录、翻译、以及融合蛋白的折叠和稳定性。为改善蛋白的表达水平，建议更换蛋白融合的末端序列。除融合质粒外，也可采用共转染的方法。一种质粒表达报告基因，另外一种质粒表达感兴趣的基因。由于启动子强度和质粒大小的不同，两种质粒的比例需要进行优化。
9.&基因产物的发夹结构RNA形成的发夹结构会影响基因的翻译水平。这个因素需要考虑，例如，向表达的基因中引入突变序列的时候。
10.&Kozak序列Kozak序列会改善核糖体识别ATG起始密码子的几率。如果Kozak序列与ATG起始密码子相邻的话，会极大地增强感兴趣基因的翻译和蛋白表达水平。
如需更多信息，请联系基因有限公司各办事处（）。(/)
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联系信箱：通过饮食是怎样影响您的基因表达
请问各位大师，“通过饮食是怎样影响您的基因表达”是一部什么样的书，书名叫什么？
09-08-22 &匿名提问
1.原核细胞启动子的选择启动子是指 RNA 聚合酶结合于 DNA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列，是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列,没有启动子,基因不能转录。原核生物的RNA酶不能识别真核基因的启动子,因此,原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核基因启动子位于转录起点（ transcription initiation ）上游（左侧），由两段高度保守并彼此分开的核苷酸序列组成:一是位于-10区的TATAAT序列；另一个是位于转录起始点上游35 bp处, 是 RNA 聚合酶识别并结合的位点，称为-35区,常见序列为TTGACA,该序列的点突变可以使启动子增强并增加蛋白的表达水平[1]。[1]　McAleese FM et al. Microbiology , (Pt 1):99目前在原核表达系统中使用最普遍的强型可调控的启动子主要有以下５种：① lac 启动子，是乳糖操纵子的启动子，受 lac I 编码的阻遏蛋白调节控制；② trp 启动子，是色氨酸操纵子启动子，受 trpR 编码的阻遏蛋白调控；③ tac 启动子，由 lac 启动子的 -10 区和 trp 启动子 -35 区融合而成，汇合了 lac 和 trp 两者优点，是一个很强的启动子，同样受 LacI 阻遏蛋白调控 。④ P(L 、 R) 启动子，是λ噬菌体左、右向启动子，其温度敏感的阻遏蛋白受温度调控；⑤ T 7 噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多且十分专一，只被 T 7 RNA 聚合酶所识别大肠杆菌表达系统一般采用温度调控的启动子和T7/T7lac启动子。前者包括乳糖启动子(Lac)、色氨酸启动子(Trp)和tac启动子(由Trp与Lac启动子人工构建的杂合启动子),其中LacZ启动子的使用较多,该启动子并不是强启动子,它的-35序列(TTTACA)有一个碱基与共有序列(TTGACA)不同。它的-10序列(TATGTT)有两个碱基(TG)与共有序列(TATAAT)不同,因此启动子的转录起始效率明显减弱,如果这些碱基变成与共有序列一致的碱基[2], 将增加启动子的转录效率,可使表达量增加100倍以上。[2]　Jan J et al. Appl Microbiol Biotechnol, ):69尽管有多种启动子可以实现高效表达,但来自大肠杆菌T7噬菌体的T7启动子是表达水平最高的系统。此表达系统除具有高效表达特性外,还有良好的可控性,T7噬菌体RNA聚合酶作为蛋白质在宿主细胞内不能自主复制,一旦T7噬菌体RNA聚合酶降解,将自动终止目的基因的表达。使用T7启动子[3,4]已经实现了包括Taq酶在内的多种目的蛋白的高效表达;可使表达的目的蛋白超过细胞总蛋白的40%,因此T7是很有前景的启动子。[3]　Yin J et al. J Biotechnol, ):181[4]Toksoy E et al. Appl Microbiol Biotechnol ,-3): 239虽然蛋白的表达与启动子的强弱有关,但增加启动子的强度并不一定能够提高蛋白的产量。有研究[5]证实:蛋白的表达与启动子周围的阻遏蛋白活性有关,原核启动子可被乳糖类似物IPTG激活,但IPTG价格昂贵,并且本身具有细胞毒作用,因此人们尝试降低IPTG的浓度或替代IPTG来诱导高效表达,发现2g/L的乳糖和0.05 mmol/L的IPTG[6]都可以诱导最大量的蛋白表达。[5]　Westermark M et al. J Bacteriol, ):6347[6]Donovan RS et al. Can J Microbiol, ):5322.翻译增强子 目前已经在细菌和噬菌体中鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列。Olins等从T7噬菌体基因10前导序列（ g10-L）中鉴定了一9bp的序列，该序列似乎能替代有效的RBS。同SD共有序列相比，g10-L能使多种基因的表达水平提高40-340倍[7]。若将其置于合成SD序列的上游，按照β-半乳糖苷酶的活性与LacZ mRNA的水平来估计，g10-L序列能使 LacZ的翻译水平提高110倍[8]。另外的研究小组在mRNA的5’非翻译区（UTR）鉴定了一U富含序列，该序列同样具有翻译增强子活性。McCarthy等[9]在 E.coli atpE基因中紧接于SD位点下游鉴定一类似区域。有文献用一30bp的序列超量产生IL-2和IFN-β[10]。另有人证明在编码RNase D的rnd mRNA SD位点的上游，有一U8序列对该mRNA的有效翻译是必需的。缺失这一区域会显著降低翻译，但不影响rnd mRNA的水平和转录起始位点[11]。研究证明这些类似序列的靶位是30S核糖体亚单位的S1蛋白[12]。在另一项有趣的研究中，研究者证明在紧接起始密码子下游的序列在翻译起始过程中发挥重要作用。位于T7基因0.3编码区+15至+26之间或位于T7基因10编码区+9至+21之间被称做下游框（DB）的特定区域具有翻译增强子的功能。DB区与16S rRNA的核苷酸互补，这一区域称做反下游框（ADB）。缺失DB将废除翻译活性。相反，如果优化DB和ADB之间的互补则会以最高水平表达dhfr融合基因。有趣的是，如果将DB从起始密码子的上游移到SD序列的位置，DB则失去功能。DB序列存在于一些E.coli和噬菌体基因中[13,14] 上述这些发现充分证明，除了SD位点和起始密码子以外，mRNA中的其他序列对于有效的翻译也是重要的。尽管其精确的机制还不太清楚，但有可能利用翻译增强子来达到超量表达蛋白质的目的。7     Olins P O, Rangwala S H. Gene. -235 8    Olins P O, Rangwala S H. J Biol Chem. 973-16976 9    McCarthy J E G, Schairer H U, Sebald W. EMBO J. -526 10    McCarthy J E G, Sebald W, Gross G. Gene. -20611     Zhang J, Deutscher M P. J Biol Chem. 28-1823312    Tzareva N V, Makhno V I, Boni I V. FEBS Lett. 9-194 13  Sprengart M L, Fatscher H P, Fuchs E. Nucleic Acids Res. 9-172314  Sprengart M L, Porter A G, Remaut E. EMBO J. -6743.　核糖体结合部位的改变原核微生物的 mRNA 结合核糖体的序列最初是由夏英（ Shine ）和达尔加诺（ Dalgarmo ）发现的，因此称为 SD 序列。核糖体结合部位即富含嘌呤的SD序列(shine-delgarno sequence),是位于起始密码子AUG上游3~11个核苷酸处的一段3~9个碱基的DNA序列,该序列和核糖体蛋白S1与16S rRNA(aSD)的3′端互补,形成核糖体-mRNA复合体,共同起始蛋白质的合成。研究发现[15],SD-aSD的距离从10缩短到8和6 bp时,β-半乳糖的产量分别提高4倍和6倍,延长SD-aSD的距离则降低目的蛋白的产量,原因是增加的碱基提高了稳定性,使核糖体在起始被推迟,如果在SD区的上游插入富含A/U的S1结合序列,可使翻译的产量显著增加。SD序列为UAAG-GAGG时的翻译效率比AAGGA高,起始密码子AUG与SD序列UAAGGAGG的最适距离为6~8 bp,与AAGGA的最适距离为5~7 bp。有实验[16]证实,在大肠杆菌SD序列并不是唯一的翻译起始子,许多其他的序列尤其是病毒来源的序列,也能提高或起始翻译。即使缺乏[17]翻译起始子,大肠杆菌也能自我开始mRNA的翻译过程。Xu等[18]研究发现没有SD序列也可以实现基因的高水平表达,PAP(美洲商陆抗病毒蛋白)基因表达依赖两段基因顺序(AC-CUACU)和(GAGUUAG)的存在而不需要SD序列。这种影响对于不同基因影响不一样。[15]　Komarova AV et al. RNA, ):1137[16]　Golshani A et al. Z Naturforsch〔C〕, -4):307[17]　Kolev V et al. Folia Biol (Praha), ):171[18] Xu J et al. J Basic Microbiol, ):514.信号肽的选择如果合成的外源蛋白能不断从细胞内分泌出来，不仅可免受宿主细胞中蛋白酶的降解，而且有利于提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。通常信号肽与外源蛋白的 N 端连接，由于信号肽含有带正电荷的氨基酸和疏水氨酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜上的信号肽酶将信号肽切除。已知真核生物的分泌蛋白，大多能在大肠杆菌中得到很好分泌，此外一些相对小分子的多肽也能较好分泌。对于表达的真核生物非分泌蛋白，即使装上信号肽也常不能被分泌到周质或外膜内，最多只能结合到细胞内膜上。4.1细胞周质分泌在细胞外周质进行蛋白质表达有许多优越之处。在外周质只有4%的总细胞蛋白，这显然有利于目的蛋白的纯化，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在转移到外周质的过程中，信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N-末端。此外，外周质中的蛋白质降解也少得多[19]。蛋白质通过内膜转运到外周质需要信号肽[20，21，22]。许多原核和真核细胞来源的信号肽已成功地用于Ecoli中蛋白质从内膜到外周质的转运。如E.coli的PhoA信号[23]、OmpA[24]、OmpT[25]、LamB和OmpF[26]以及金黄色葡萄球菌的A蛋白[27]，鼠RNase[28]和人生长激素信号肽[29]等。但是，蛋白质转运到细菌外周质是一个特别复杂和尚未完全明了的过程，信号肽的存在并不总能保证有效的蛋白质通过内膜转运[30]。改善蛋白质转运到外周质的策略包括提供蛋白质转运和加工所需的成分：过量表达信号肽酶I[31]，利用prlF突变株[32]，共表达参与膜转运的几种蛋白质，降低蛋白质的表达水平以防止转运工具的过载[33]。 4.2  细胞外分泌（外泌） 将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。要解决蛋白质外泌方面的难题，必须弄清E.coli的分泌途径。Pugsley[34]对革兰氏阴性菌的分泌途径进行了详细的研究。在E.coli中将蛋白质分泌到培养基中的方法大致分为两类：（1）利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径[35]；（2）利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。第一种方法具有将目的蛋白质特异性分泌的优点，并最小限度地减少了非目的蛋白的污染。最突出的例子是溶血素基因，该基因曾被用于构建分泌的杂交蛋白[36，37]；第二种方法依赖于有限渗透的诱导而导致蛋白质的分泌。例如应用pelB[38]、ompA[39]和A蛋白引导序列[40，41]；与细菌素释放蛋白的共表达[42]；丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白和在培养基中添加甘氨酸[43]以及与kil基因共表达而进行膜穿透[44]。但通常情况下，外泌蛋白质的产量是中等的。有文献报道[45]，在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，蛋白的外泌表达发生于细胞生长后期。但所用的启动子为A蛋白自身的启动子，该启动子在大肠杆菌中为非可控性的组成性表达，且强度较弱。如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。目前我们正在进行这方面的尝试，且已经取得初步成效。
19  Talmadge K, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci USA. 0-1833 20  Michaelis S, Beckwith J. Annu Rev Microbiol. -465 21  Schatz G, Dobberstein B. Science. 19-1526 22  Schatz P J, Beckwith J. Annu Rev Genet. -248 23  Deneffe P, Kovarik S, Clora T. Gene. -510 24  Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M. EMBO J. 7-244225   Johnson D L, Middleeton S A. Protein Expression Purif. -113 26  Hoffman C S, Wright A. Proc Natl Acad Sci USA. 7-511127   Hogset A, Blingsmo O R. J Biol Chem. 38-7344 28  Schein C H, Boix E. Biochem J. 7-144 29  Gray G L, baldridge J S. Gene. -254 30  Pluckthun A. Immunol Rev. 1-188 31  van Dijl J M, de Jong A. Mol Gen Genet. -48 32  Snyder W B, Silhavy T J. J Bacteriol. 61-566833   Makrides S C. Microbiol Rev. -538 34  Pugsley A P. Microbiol Rev. -108 35  Stader JA, Silhavy T J. Methods Enzymol. 6-187 36  Blight M A, Chervaux C, Holland I B. Curr Opin Biotechnol. -474 37  Holland L B, Steipe B.  Methods Enzymol. 2-143 38  Better M, Chang C P, Robinson R R. Science. 41-104339   Ko J H, Park D K. Biotechnol Lett. 9-1024 40  Abrahmsen L, Moks T, Nilsson B. Nucleic Acids Res. 7-7500 41  Hsiung H M, Cantrell A. bio/Technology. -271 42  Yu P, Aristiou A A, San K Y. Biotechnol Lett. -316 43  Kato C, Kudo T. et al Gene. -202 44  Abrahmsen L, Moks T, Nilsson B. Nucleic Acids Res. 1-39065.密码子的使用增加目的基因片段大肠杆菌偏爱密码子也可以增加表达量,Lakey等[45]在不改变氨基酸的情况下通过点突变的方法,将肺结核分枝杆菌编码抗原85A、85B和过氧化物歧化酶的低使用密码子换成高使用密码子,把抗原85B的野生型基因替换了5个密码子,mRNA增加了1.7到2.5倍,重组蛋白的产量提高了54倍,提高的蛋白产量主要是来自提高的翻译效率。Xu等[46]通过点突变改变大肠杆菌偏爱密码子,提高了抗CD(3)ScFv的表达,将抗CD(3ScFv抗体重链基因编码的第6位氨基酸从E(GAG突变为Q(CAG),突变的抗CD(3)ScFv(m2)的表达量提高了100倍,并且突变前后抗体的抗原结合活性没有差异。但Griswold等[47]发现把野生型真菌基因替换为大肠杆菌偏爱密码子,其在细胞质的表达量反而显著降低。抗体可变区基因的顺序对表达量也有一定的影响,Hamilton等[48]研究认为把V(H)-(L)顺序改为V(L)-V(H),对于重组抗体的结合活性有意想不到的效果,并且可以使ScFv的表达量提高150%,而表达的蛋白具有相同的生物学作用。[45]　LakeyDLetal.InfectImmun,):233[46]许元富等.中华血液学杂志,):252[47]　GriswoldKEetal.ProteinExprPurif,):134[48]　HamiltonSetal.HybridHybridomics,-6):351原核和真核生物的基因对同义密码子的使用均表现非随机性[49，50]。对E.coli中密码子的使用频率进行系统分析得到以下结论[51]：（1）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有偏好；（2）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，无论蛋白质的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密码子；（3）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的密码子偏好；（4）同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量有高度相关性。这些结果暗示,富含E.coli不常用密码子（表1）的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。已经证明[52]，微精氨酸tRNAArg(AGG/AGA) 是多种哺乳动物基因在细菌中表达的限制因子。因为AGA和AGG在E.coli中不常用。如果共表达编码tRNAArg(AGG/AGA)的argU(dnaY)基因，就会高水平表达目的蛋白[53]。但利用同方法所进行的另外几项研究的结果却不一致[54，55]。其他的研究表明,通过用常用密码子替换稀有密码子或与“稀有”tRNA基因共表达可以提高外源基因在E.coli中的表达水平[56，57]。许多研究者对有关密码子使用模式的进化意义和密码子使用效果的机制进行了研究，但至今尚未找到协调密码子的使用和转录本翻译的精确规则。似乎在转录本5’末端附近存在稀有密码子将会影响翻译效率。另外，基因5’编码区中GC含量似乎也影响其表达。这在人胸苷酸激酶（TS）中已经得到证明.在不改变所编码蛋白的前提下，将TS cDNA的第三、四、五密码子的嘌呤碱基变成胸腺嘧啶，使得TS基因的表达占到E.coli中总蛋白量的25-30%。综上所述，有许多可变因素可能影响实验结果，如位置效应、稀有密码子的群集和mRNA的二级结构等等。 49  Gouy M, Gautier C. Nucleic Acids Res. 5-707450  Gutman G A, Hatfield G W. Proc Natl Acad Sci USA. 9-3703 51  de Boer H A, Kastelein R A. Biased codon usage. 1986, p225-285 52  Brinkmann U, Mattes R E, Buckel P. Gene. -114 53  Chen G F T, Inouye M. Genes Dev. 1-2652 54  Chen K S, Peters T C, Walker J R. J Bacteriol. 04-2510
55  Buell G, Schulz M F, Selzer G. Nucleic Res. 3-1938 56  Devli P E, Drummond R J, Toy P.  Gene. -22S 57  Pedersen-Lane J, Maley G F, Chu E et al Protein Expres Purif -2626.蛋白质的蛋白酶解蛋白酶解是一个选择性的、高度调节的过程，该过程参与许多代谢活动。E.coli在细胞质、细胞外周质、内膜和外膜有许多蛋白酶。这些蛋白酶参与宿主的代谢活动，如选择性地清除异常和错误折叠的蛋白。到目前为止，蛋白酶解的机制尚未完全明了，但已有一些策略和方法以减少E.coli中异源蛋白的降解。虽然使得蛋白质不稳定的精确结构特点还不清楚，但是通过系统研究已经明确了一些蛋白不稳定的决定因素。蛋白酶解途径的“N-末端规则”在E.coli中能够发挥作用，即蛋白质的稳定性与其氨基端的残基有关。在E.coli中，Ｎ－末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期为２分钟，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过10小时。有研究表明，在多肽的第二位带有较小侧链的氨基酸有利于甲硫氨酸氨肽酶催化的N-末端甲硫氨酸的去除，从而暴露出位于第二位的亮氨酸，使得该蛋白不稳定。蛋白质的第二个决定因素是位于近氨基端的特异性内源赖氨酸残基。该残基是多遍在蛋白链的受体，多遍在蛋白链在真核细胞中有利于遍在蛋白依赖的蛋白酶对蛋白质的降解。有趣的是在一个多遍在蛋白中，它的两个决定簇可以位于不同的亚基上，却能靶向同一个蛋白进行加工。 氨基酸成分和蛋白质不稳定性的另一个关系体现在PEST假说中。根据对短寿命真核蛋白的统计分析，蛋白质如果富含Pro、Glu、Ser和Thr的区域，且在该区域附近有某些特定的氨基酸，则该蛋白就会不稳定。这些PEST结构域的磷酸化导致钙的结合能力提高，从而利于钙依赖性蛋白酶对蛋白质的降解。这提示可以在缺乏PEST蛋白裂解系统的E.coli中表达PEST富含蛋白。 减少E.coli中重组蛋白裂解的策略有以下几种：（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基[1；（2）在较低的温度下培养细菌；（3）选用蛋白酶缺陷的菌株；（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白；（5）将目的基因多拷贝串联；（6）与分子伴侣共表达；（7）与T4 pin基因共表达；（8）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点；（9）改善蛋白质的亲水性；（10）优化培养条件。7.融合蛋白表达 在E.coli中表达外源蛋白，尤其是真核蛋白时，蛋白质的稳定性是经常遇到的问题。最近几年，众多巧妙的蛋白质——融合系统的发展，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。融合表达具有多方面的优点：如防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解和利于纯化。 Uhlen和其同事利用葡萄球菌A蛋白和合成的结构域（Z）开发了一种多功能的融合伴侣，除了能够作为纯化标记外，A蛋白组分还作为一种可溶性伴侣促进蛋白质的折叠，A蛋白信号肽的存在可使表达蛋白分泌到培养基中。另一个融合伴侣是链球菌G蛋白（SPG），它是一种细菌胞壁蛋白，在其氨基端具有分离的白蛋白结合区，在OH端具有免疫球蛋白IgG结合区。最小的白蛋白结合区由来源于SPG的46个氨基酸残基组成，作为亲和纯化标记纯化cDNA编码的蛋白。如果将A蛋白和SPG结构域联合组成三联融合蛋白，则为纯化提供了更为广泛的选择，可以更进一步防止蛋白酶解。SPG-白蛋白的一个重要应用是其能够稳定哺乳动物外周循环中的短寿命蛋白，这一效应是通过SPG结构域与一种长寿命蛋白——血清白蛋白的结合来介导的。 最近又建立了一种更为复杂和巧妙的亲和系统。这种多元系统利用了七种不同的亲和标记，从而允许使用多种结合和洗脱条件，为重组蛋白的生产、检测和纯化提供了一个有力的工具。 使用基因融合表达系统在E.coli中表达外源基因已经越来越受欢迎。这在很大程度上归因于融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白。谷胱甘肽Ｓ－转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）均已经被证实能非常成功地生产正确折叠、有生物活性的蛋白质，能明显提高在E.coli细胞质中产生的融合蛋白的可溶性，并能抑制包涵体的形成。其中每一种都备有方便的纯化方法，可将融合蛋白与细胞污染物分开。已经建立了多种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法，方法的选择通常由特定蛋白的组成、序列及物理性质决定。可采用诸如溴化氰（Met↓）、羟胺（Asn↓Gly）、等试剂或低pH(Asp↓Pro)来进行融合蛋白的化学裂解。化学裂解的方法较便宜而且有效，甚至常常可以在变性的条件下裂解非变性不能溶解的蛋白质。但有时目的蛋白中存在裂解位点，或因发生副反应而导致对蛋白质进行不必要的修饰，从而阻碍了它们的应用。作为一个备选方案，酶解的方法相对来说其反映条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中常用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶和胶原酶。所有这些酶都具有较长的底物识别序列，从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。在上述提及的各种酶中，Xa因子和肠激酶应用最多，因为它们切割各自的识别序列的羧基端，使带有天然氨基酸的被融合部分得以释放。7.分子伴侣目前已经达成共识，有效的蛋白质翻译后折叠、多肽装配成寡聚体结构以及蛋白质的转位都是由一种被称为分子伴侣的专职蛋白来介导的。原核生物的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶在E.coli中的有效合成和装配需要GroES和GroEL蛋白的证据，使得利用分子伴侣在E.coli中进行基因高效表达成为近来研究的热点。但是，利用分子伴侣所得到的实验结果并不一致，而且迄今为止，伴侣分子的共表达对基因表达的影响似乎都具有蛋白质特异性。目前尚不清楚在基因过度表达的情况下，分子伴侣的体内水平是否受到限制。正常情况下，蛋白质的折叠最终达到一种热力学的稳定状态。特别不稳定的蛋白即使在伴侣分子存在的情况下，或许也不能正确折叠。因此，多肽链的截断、多亚基蛋白复合物单个结构域的产生、缺乏维持蛋白质正常结构的二硫键的形成以及缺乏翻译后的修饰如糖基化等，都将不可能达到热力学的稳定状态。现在已经明白不同类型的伴侣分子正常情况下是协同发挥作用的。因此，只过度表达单一的伴侣分子可能不太有效。在某些情况下，共表达与靶蛋白来源相同的伴侣分子可能是必要的。还有一个需要考虑的变量是培养温度。例如，在30℃时GroES-GroEL共表达能够提高β-半乳糖苷酶的产量，而在37℃或42℃则不能。最后，伴侣分子的共表达有可能导致表型的改变如细菌丝状生长，这有可能对细菌的生存和蛋白质的产生不利。最近有报道表明，将人或鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）与靶基因共表达，能提高在E.coli细胞质中正确折叠蛋白质的产量。E.coli细胞质中二硫键的形成是由维持氧化还原电势的一组蛋白质来促进的。有人认为DsbA（一种可溶性的细胞外周质蛋白）直接催化蛋白质中二硫键的形成，而DsbB（一种内膜蛋白）则参与DsbA的再氧化。真核生物的PDI能够补充dsbA缺失突变株的表型，但其功能在dsbB突变株中完全丧失。另外，通过额外添加谷胱甘肽可以提高PDI增强靶蛋白产生的能力。这些证据表明，PDI有赖于细菌氧还蛋白来完成自身的再氧化。  8.培养条件
    E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。高细胞密度培养系统可以分成三类：分批培养、补料分批培养和连续培养。这些方法能获得超过100g/升的细胞浓度，从而获得廉价的重组蛋白。有关大规模培养系统的资料已有详细的综述。培养基的组成需要仔细地计算和监控，因为这对细胞和蛋白质的产生具有重要的代谢效应。例如，不同mRNA的翻译可以因温度和培养基的变化而受到不同程度的影响。营养成分和培养参数如pH、温度和其他参数都会影响蛋白酶的活性、分泌和产量。已经证明对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解。同样，在山梨糖醇和甘氨酰甜菜碱存在的渗透压力下培养细菌，可以使可溶性的活性蛋白产量提高多达400倍。 高细胞密度培养系统也有其自身的缺陷。这些缺陷包括在高细胞密度情况下，溶解氧的量有限；二氧化碳水平能够降低生长速度、刺激乙酸形成降低发酵罐的混合效率和产热等。有关这些问题的解决方案已经有详细的介绍。利用高细胞密度培养系统生产重组蛋白质的一个主要问题是乙酸的积累，这种亲脂性成分对细胞的生长是有害的。虽然有多种解决这一问题的方案，但是均各有缺点。近来这一问题通过将来自B. subtilis编码醋酸盐合成酶的alsS基因导入E.coli细胞中得以解决。该酶催化丙酮酸转化为非酸性和低毒性的副产品。乙酸积累的减少极大地改善了重组蛋白的产生。另外，其他酶缺陷的E.coli突变株也已经建立，这些突变株产生较少的乙酸，从而提高了人重组蛋白的表达水平。
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糖尿病是由于胰岛素不足而引起的代谢性疾病。基本特征是长期高血糖。胰岛素是由胰腺中β细胞分泌的，是葡萄糖代谢中不可缺少的一种激素。当胰岛素分泌不足，葡萄糖利用及贮存受阻，血液中葡萄糖浓度（血糖浓度）就会升高。血糖浓度超过一定水平，多余的葡萄糖便通过肾脏排出体外，这时化验小便会发现尿糖阳性，故称糖尿病。 糖尿病分原发性和继发性两大类。原发性糖尿病是指其发病原因尚未明确，也称特发性糖尿病或原因不明性糖尿病，占绝大多数。一般所称糖尿病即指原发性糖尿病。可分以下几型：胰岛素依赖型糖尿病（IDDM，I型）该型约占糖尿病总数的5%-10%，发病年龄多小于40岁，主要为幼年及青少年，偶见于非肥胖的成人。患者体内胰岛素极少或缺乏，发病时糖尿病症状较明显，病情较重，有酮症倾向（指易发生糖尿病酮症酸中毒）必须依赖外源性胰岛素为生，一旦中止胰岛素治疗则会威胁生命。非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM，II型）该型约占糖尿病总数的90%或以上，多于40岁后发病，起病缓慢、隐匿，临床症状不典型，病情较轻，有些病人是因动脉硬化、冠心病、肾脏疾病或眼科疾病就诊而发现糖尿病，有些是在健康检查时才发现患有糖尿病。该型糖尿病一般无酮症倾向，控制饮食或加用口服降糖药治疗便能控制病情，少数病人为控制血糖必须用胰岛素治疗，但不依赖外源性胰岛素（即停用胰岛素不致于威胁病人生命）。目前我国糖尿病及糖耐量低减的患病率分别为2.51%和3.27% ，糖尿病患病率最高地区为新疆自治区克拉玛依市（4.6%），其次是北京地区（3.99%），浙江省糖尿病患病率为2.96%。虽然中国糖尿病患病率与世界发达国家相比仍然较低，但是中国人口众多，估计现有25-64岁的糖尿病人约1500万。另一观察发现，大于25岁的成年人糖尿病的发病率超过130/10 万，推算在大于25岁的人口中，每年将有70万糖尿病新病人，调查还发现，糖尿病患病率随着年龄、体重还发现，糖尿病患病率随着年龄、体重及平均收入的增加而增加，肥胖者患病率约为正常体重者的5倍。遗传因素在糖尿病发病机理方面的重要性，已越来越受到医学专家的关注。I型糖尿病的诱发因素主要是感染，此外与牛乳喂养亦有一定关系，II型糖尿病的诱发因素有：（1）肥胖。肥胖是诱发II型糖尿病的最重要的因素之一，中度肥胖者糖尿病发病率比正常体重者高4倍，而极度肥胖者则要高30倍，且腹部肥胖较臀部肥胖者发生糖尿病的危险性更大。肥胖者的胰岛素受体减少、对胰岛素的敏感性减弱。（2）饮食。不良的饮食习惯，如进食过多，高糖高脂肪饮食可诱发糖尿病。尤其是长期以精米精粉为主食，造成微量元素及维生素的大量丢失也可能诱发糖尿病，因为某些微量无素如锌、镁、铬等对胰岛素的合成及能量代谢都起着十分重要的作用。（3）年龄。糖尿病的发病率随年龄的增长而增高。40岁后患病率开始明显升高。50岁以后急剧上升，高峰约在60-65岁。（4）体力活动。体力活动的减少亦是目前糖尿病患病率增高的一个重要因素。体力活动减少一方面可引起肥胖，另一方面也可以影响细胞表面的胰岛素受体的数目并使其敏感性减弱。（5）应激因素。应激是当人体受到外界致病因素影响时机体的保护性生理反应。当处于急性心肌梗死、脑血管意外、严重外伤、大手术等应激情况时，胰高血糖素、糖皮质激素等对抗胰岛素的激素增加，会使部分患者发生高血糖。这些人中部分患者随疾病的好转可恢复正常，而另一部分则成为糖尿病。（6）妊娠。有人认为多次妊娠可能是糖尿病的诱发因素之一。（7）药物。某些药物可诱发或加重糖尿病，如氯噻酮、双氢克尿噻、糖皮质激素（强的松、地塞米松等），口服避孕药及普萘洛尔等。怎样预防　糖尿病患者不一定必有“三多一少”的典型症状，尤其是II型糖尿病患者：因而，出现以下情况也要怀疑是否得了糖尿病。 （1）有糖尿病家族史。有明确的轻型糖尿病家族史者发生II型糖尿病的可能性很大，要引起注意。（2）有异常分娩史。如有原因不明的多次流产史、死胎、死产、早产、畸型儿或巨大儿等。（3）反复感染。顽固性外阴瘙痒，或反复外阴、阴道霉菌感染，或屡发疖痈者，有可能是患了糖尿病。不少女性病人就是因为外阴瘙痒去妇科就诊而发现糖尿病的。此外，反复的呼吸道、胆道、尿路感染，创口不愈合者，也就怀疑是否患有糖尿病。（4）阳瘘。男性病人出现阳痿，在排除了泌尿生殖道局部病变后，要怀疑有糖尿病可能。（5）有多尿、口渴多饮或有近期不明原因的体重减轻。（6）偶有尿糖阳性而空腹血糖正常者也要怀疑是否有糖尿病，应作进一步检查。（7）反应性低血糖。多发生于餐后3小时或3小时以上，表现为心慌、出汗、饥饿、颤抖等，如测血糖则在正常低值或低于正常，进食含糖食物后上述症状可消失。在某些肥胖的II型糖尿病患者早期可有所表现。（8）年轻患者发生动脉硬化、冠心病、眼底病变等应怀疑有糖尿病。（9）当老年人不明原因的知觉障碍，如肢体麻木，疼痛或感觉过敏等；自主神经功能紊乱，多汗，尤其是半身出汗，体位性低血压，不明原因的尿潴留；尿失禁、不明原因的腹泻或腹泻便秘交替；下肢血管病变，如下肢发凉、发泔、间歇性跛行、肢端坏死、水疱、溃疡等；冠心病心肌梗死、肾病、脑血管意外等情况；不明原因的昏迷等时都应怀疑有糖尿病。 发现以上情况，应到内分泌科或代谢科就诊，如医院未设上述专科，则应到内科就诊。如怀疑有糖尿病应去医院就诊、检查。检查内容有：尿糖、空腹血糖、餐后2小时血糖。如仍不能确诊，可做口服葡萄糖耐量试验。
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