Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons | Protocol (Translated to Chinese)
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Nucleofection和胚胎小鼠海马和皮层神经元的原代培养
*1, *1, *1, 1
* These authors contributed equally
该协议概述解剖所需的步骤，通过电穿孔和文化小鼠海马和皮层神经元的转染。短期可用于文化研究轴突的生长和指导，而长期的文化可以为研究突触和树突棘分析。
Date Published: 1/24/2011, ; doi:
Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (47), e2373, doi:10. (2011).
海马和皮层神经元已被广泛地用于研究中枢神经系统（CNS）神经细胞极化，轴突/枝晶生长，突触的形成和功能。培养这些神经元的一个优点是，他们很容易分化，形成独特的轴突和树突，在非常低的密度上的两个立体基板。此属性，使他们非常确定神经元发育的许多方面作出了有益的。此外，通过提供这些神经元的神经胶质空调，他们将继续发展，形成功能性突触连接，尚存在几个月文化。在这个协议中，我们勾勒出一种技术，解剖，文化和转染小鼠胚胎海马和皮层神经元。转染是通过电穿孔进入神经元的DNA，然后通过nucleofection电镀。此协议已经表达荧光标记的融合蛋白的早期发展（?4 8小时后镀），在两极分化，轴突的生长和分支研究的动态与蛋白质的功能优势。我们还发现，这在电镀前的单转保持在适当的水平，整个一生的神经元（& 2个月的文化）成像荧光标记的融合蛋白的表达。因此，这种方法是研究神经元功能很少或根本没有中断蛋白定位和整个中枢神经系统发育的功能非常有用。
1。盖玻片和分庭的制备干净的盖玻片和商会的制备是健康的文化所必需的。快捷键不应该采取任何这些步骤。 洗净的盖玻片（12mm或22毫米轮，德国玻璃 - 卡罗来纳州助理品牌）集中在一个专用的玻璃瓶或烧杯中的硝酸（HNO3）过夜。 从硝酸中删除的盖玻片，在去离子水冲洗广泛（5 7X）。 在层流罩或生物安全柜的盖玻片和干分开。干燥时，消毒30分钟的紫外线光。消毒的无菌培养皿储存菜盖玻片。如果12毫米盖玻片电镀神经元直接放置在无菌的35mm盘的盖玻片，进行第2节。 影像室，钻一个孔（删除所有毛刺）的35mm培养皿的底部15毫米和附加清洁盖玻片，用3:1的石蜡和凡士林混合构造。 熔体在锥管内沸水浴的石蜡/凡士林混合物。使用一个小的油漆刷和大衣盘周围的15毫米洞下方。请一定要保持石蜡/凡士林混合搅拌，因为它会分开。这通常会导致与凡士林的浓度较高，这将成为粘稠的菜肴放置在孵化器，在盖玻片支队粘在一起商会。其余石蜡/凡士林可以在室温下保存。 将菜倒放在一个平面托盘，并将其放置在孔盖玻片。 80 ° C烘箱中加热，直到石蜡混合物融化（大约10分钟）。取出一个平坦的表面上的菜肴，让石蜡混合物集。 打开菜，消毒的紫外灯盖和底部商会内部。 大衣盖玻片或地区的商会，1.0mg/mL聚- D -赖氨酸在硼酸盐缓冲液（0.1M硼酸钠，pH值8.5）（30kDa）一小时的玻璃。丰富的组织文化品位去离子水冲洗3-5次。确保删除所有的硼酸盐缓冲的痕迹。干燥和使用即时或存储商会/盖玻片，以供日后使用。我们通常使用的准备工作后一个月内清洗盖玻片。
2。神经解剖和培养基的制备准备组织文化品位水通过添加适当数量的10倍HBSS和100倍的HEPES的夹层介质（DM）。保存在4 ° C。在冰上保持在清扫。 解剖前一天准备电镀液（下午）和无血清培养基（SFM）。下午由Neurobasal中等，B27的补充，2毫米谷氨酰胺，0.3％的葡萄糖，氯化钠37.5毫米和5％胎牛血清（FBS），。 SFM Neurobasal中等，B27的补充，谷氨酰胺2毫米，0.3％葡萄糖和37.5毫米氯化钠。 只在组织文化的清扫和存储足够的孵化器与盖隔夜稍微虚掩着，使温度和CO 2的介质达到平衡的内容。我们增加了额外的葡萄糖和渗透压增加，氯化钠约310mOsm。我们找到的文化做一个更生理的渗透压（Neurobasal渗透压一般为205 - 245mOsm）更好。
3。长期培养的皮层神经胶质直属层的制备如果要准备长期的文化，执行这部分的协议的两至三个星期，然后再继续与皮质或海马解剖。 准备胶质培养基与MEM（GM）0.3％的葡萄糖，青霉素/链霉素和10％马血清。 安乐死P1 - P3的小鼠的幼崽在冰上冷却5分钟。从冰和喷用70％乙醇中删除每个小狗。用剪刀快速斩首。整个大脑取出一盘冷DM（步骤2.1）。 移除大脑两半球和脑膜。海关新皮层，并转移到一个新的菜，不包含任何媒体。准备共4大脑皮质。 尽可能细切碎，用干净，无菌刀片皮层，并取出用塑料吸管50 mL锥形管，含有12毫升的冷DM切碎组织。添加胰蛋白酶和DNase 0.25％（1.5毫升）和0.1％（1.5毫升），终浓度。在37℃水浴孵育10分钟间歇纷飞。 取出试管中皮层组织，用70％乙醇引入到组织培养罩前要彻底清洁。吸取皮质组织与一个10毫升吸管最块约10-15次，或直至消失。 返回管至37 ° C，在水浴10分钟间歇纷飞。 彻底清洁，用70％乙醇管，并把它带回去的组织文化罩。吸取的皮层组织和5米大号吸管约10-15次，或直至块消失。 添加15毫升的温暖通用和200xg（1000RPM）离心10分钟。 弃上清，重悬在20毫升的新鲜GM颗粒细胞，并与一个血球计数。板5 - 7.5x10 6细胞15毫升每75厘米2烧瓶总经理。 一天后，每2-3在随后的日子里文化，打跑松散的细胞，对你的手敲烧瓶。删除任何脱落细胞中，并与15毫升的新鲜GM替换。 神经胶质细胞可以收获后1-2周在烧瓶增长，当他们约70-100％融合。为了准备与神经胶质涂层的个人盖玻片，放置6硝酸清洗和消毒，在10厘米菜25毫米圆形盖玻片，并将其放置在一个三角形图案用小油漆刷到每个盖玻片3点3:1混合石蜡/凡士林。 30分钟的紫外线光对开放的菜肴。大衣与0.1 mg / mL的聚- D -赖氨酸在硼酸盐缓冲液（30kDa）一小时，然后洗净广泛用无菌组织的文化品位去离子水（3 - 5倍），并让干燥的盖玻片。 从孵化器中取出含有胶质烧瓶，弃培养基预热胰蛋白酶/ EDTA溶液5毫升冲洗。从烧瓶中取出的胰蛋白酶/ EDTA溶液和3毫升新鲜预热胰蛋白酶/ EDTA吸管入烧瓶。在37℃前加入5毫升的GM停止胰蛋白酶为1分钟瓶。 从烧瓶中取出的神经胶质细胞，反复吹打10-15次，然后媒体转移到15 mL锥形管。 200xg（1000RPM）离心8分钟。去除上清液，并添加12.5毫升每10厘米菜含有盖玻片的GM通用汽车的10毫升，计数细胞， 板 5X10 5细胞。 每2-3天在新鲜预热GM交换介质。神经清扫的前一天，通用汽车公司和与SFM（2.2节）更换。皮质或海马文化水浸时，使用在步骤4.12胶质空调的可持续森林管理。
4。皮层和/或海马解剖和电穿孔删除适当数额的nucleofection解决方案（龙沙），结合起来，温暖的室温开始剥离之前。由于Nucleofection解决方案的有限生命周期相结合时，我们只有结合每个准备（100μL每转）所需的金额。 安乐死在E15.5怀孕的老鼠与CO 2（插件一天E0.5）和一个10cm的培养皿中取出子宫。取出胎儿和斩首，到寒冷的DM（2.1节）。 取出到一个单独菜冷DM的整个大脑和弯曲的钨针，同时删除neocortices。删除新菜冷DM microforceps和地方皮层脑膜。虹膜或老爷车用小剪刀，删除在1.5毫升的Eppendorf管充满了1.0毫升的冷DM皮质或海马和地点。此管置于冰上。 所有皮质或海马解剖后，加110μL2.5％胰蛋白酶的Eppendorf管中，包含在37℃培养箱20分钟的组织和地方管。 轻轻颠倒Eppendorf管中上清，洗皮质或海马取出1.0毫升下午（2.2节）。重复洗两次澡，留在管1毫升的PM。 磨碎的块15倍，与P1000的吸管，除去上清液/细胞到一个新的15 mL锥形管中含有4毫升的PM，留在Eppendorf管中仍然存在的任何块。
7分钟关闭制动20xg（350rpm）旋转15毫升管。弃上清，每转增加100μL预混，室温nucleofection解决方案（龙沙）。磨碎的P1000的吸管轻轻向上和向下运动的5倍。 每一个新的Eppendorf管中取出100μLnucleofection解决方案/细胞混合，并添加适量的DNA。对于长期的文化，我们一般采用1 -2μg每转染的DNA。然而，这一个小的文化中的神经元的比例&10％的标签。我们一般使用每转5 -10μg的DNA，如果想短期文化的转染效率更高。我们使用的40μg的DNA的总时与两个不同的质粒转染。质粒存储在1μg/μLTE缓冲液。 加入细胞悬液/ DNA的比色皿（龙沙）和electroporate Nucleofector（龙沙）的细胞，使用程序O - 005（小鼠中枢神经系统的神经元）。 工作快速，加500μL预热和平衡下午试管和删除的解决方案/一个新的1.5 mL Eppendorf管的细胞。补充足够的下午带来的每转的体积为1.0 mL。一个血细胞计数板计数细胞在3 - 5X10 3细胞/长期文化对青少年的文化，或5 - 10 × 10 3细胞/ 厘米2厘米2 。/ LI& 对于短期文化，洪水2.0毫升的温暖，CO 2平衡可持续森林管理的电镀一小时后的35毫米培养皿。如果使用盖玻片，我们删除的PM的一半，替换与SFM，然后重复两次。泛滥的成像商会或洗涤盖玻片结果在一个非常低的血清含量（&0.5％）。短期文化不需要与胶质细胞滋养层培养，不需要再喂。 对于长期的文化，我们删除一个神经胶质细胞盖盖玻片，包含三个点的石蜡/凡士林和15毫米孔在35mm盘，初步电镀后一小时以上反转。从胶质菜空调的SFM毫升，然后添加到成像室。饲料长期的文化，我们的可持续森林管理，每2-3天中删除的三分之一，代之以新鲜， 预热和CO 2平衡可持续森林管理。
5。代表性的成果：
图1。生活海马神经元在连续的发展阶段。配对生活代表的海马神经元的图像显示为微分干涉对比度的图像和相应的荧光显微镜。这些细胞已pCAX向量与EGFP -微管蛋白和DsRed2转。在随后的日子里在体外 （DIV）：第1阶段（1DIV），第2阶段（1DIV），第3阶段（2DIV），第四阶段（11DIV）和第五阶段（32DIV）成像神经元。比例尺是20微米。
作为一个银行家协议，它使用大鼠神经元1,2的修改，这为培养的胚胎海马和皮质鼠标神经元的协议。我们已经用3,4,5,6,7，以及为培养小鼠和仓鼠神经元这一协议。该协议同样适用海马和新皮层神经元和类似Meberg和米勒8出版的协议。一般来说，我们使用长期培养的海马神经元，因为他们是很好的特点和更成熟的模型系统。此外，它们可能含有更均匀的人口比大脑皮层的神经元。然而，新皮层神经元的培养，使用此协议，也同样生存和分化（未发表数据）。海马和新皮层神经元的短期文化，我们经常使用。大脑皮层夹层结果比海马夹层（2.5 × 10 5％海马对神经元），这使得它的材料更好的选择免疫印迹例如，更多的神经元（1.5x10 6个神经元皮质对）。 任何小学文化，它是必不可少的，以尽量减少所需的时间从死亡的动物细胞电镀。它通常会采取10-20解剖成为始终在快速剥离和电镀。此外，龙沙Nucleofector工作时，它是关键在电过程迅速，作为神经元的活力迅速下降，如果他们都留在nucleofection缓冲区。 我们的成像与总内部反射荧光显微镜（TIRFM）进行。这种类型的显微镜只能够成像几百纳米超出盖玻片。因此，神经元的地区，我们经常形象，轴突的生长锥和树突棘，需要坚持直接盖玻片。因此，我们使用低密度的文化，需要长期培养的神经胶质喂养。我们已经使用了密度较高的文化（& 2 × 10 4细胞/ 厘米 2），没有胶质细胞的饲养层，长期培养，发现他们很少喂养很好的生存。然而，这些神经元的树突棘常常过于远离基板TIRFM形象，虽然他们可以很容易地与宽视场显微镜或共聚焦显微镜检测。 在大多数我们的研究，我们转染电镀前的神经元，并有高达文化三个月成像荧光标记的蛋白质。这种荧光标记的蛋白质长期的表现，使用低浓度的DNA（1 -2μg），我们不生产过度表达在神经元的文物给了我们信心。但是，这个过程也可以被用于研究蛋白质的过度表达，如果使用高量的DNA（10 -20μg）。我们使用的质粒，转染神经元通常含有EGFP或mCherry融合蛋白，虽然我们也标签DsRed2或EGFP单独的神经元的胞浆。这电技术的工作原理以及与向量的数量。我们宁愿含有β-肌动蛋白启动子与CMV增强子和β-珠蛋白的质粒，聚尾巴（pCAGGs或pCAX质粒）9，由于相对较高的水平表达，而他们是由神经元的耐受性良好在短期和长期的文化。一般来说，蛋白质在约4小时电镀内开始表达，达到成像足够的水平在10 - 24小时10。我们已成功地用于巨细胞病毒启动子驱动的质粒在短期文化，但发现它们可能会导致高层次的过度表达，杀死神经细胞长期培养。不过，我们已经发现，低密度培养的神经胶质空调帮助与巨细胞病毒启动子驱动的质粒转染神经元的生存，而密度较高的（非胶质美联储）文化。
没有利益冲突的声明。
所有的程序获得批准委员会威斯康星大学动物护理，并按照美国国立卫生研究院的指引。我们感谢她Nucleofector设备的大量使用凯瑟琳Kalil博士。我们也感谢登特实验室成员协议的意见。这项工作是支持由NIH R01 - NS064014，达纳基金会和白厅基金会的赠款，以EWD 克里Viesselmann，贾森Ballweg和德里克Lumbard同等贡献本文。
Catalog Number
Sodium Borate
Fisher Scientific
Store borate buffer at room temperature (RT).
Poly-d-Lysine
Sigma-Aldrich
Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C.
Trypsin (10x)
Invitrogen
Store aliquots at -80°C.
DNase (10x)
Sigma-Aldrich
Store aliquots at -80°C.
Invitrogen
Store at 4°C.
HBSS (10x)
Invitrogen
Store at RT.
HEPES (100x)
Invitrogen
Store at 4°C.
Penicillin/Streptomycin (100x)
Invitrogen
Store aliquots at -80°C.
Horse Serum
Store aliquots at -80°C.
Trypsin/EDTA
Invitrogen
Store at 4°C.
Neurobasal E (NB)
Invitrogen
Store at 4°C.
B27 Supplement (50x)
Invitrogen
Store aliquots at -80°C.
Glutamine (100x)
Invitrogen
Store aliquots at -80°C
30% Glucose in NB (100X)
Fisher Scientific
Dissolve glucose in NB and sterile filter.
Store at 4°C.
3.75M NaCl in NB (100X)
Fisher Scientific
Dissolve NaCl in NB and sterile filter.
Store at 4°C.
Fetal Bovine Serum (FBS)
Store aliquots at -80°C.
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w)
Fisher Scientific
Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1
Combine in conical tube and melt in boiling water.
Concentrated Nitric Acid (HNO3)
Fisher Scientific
Store at room temperature.
Can be reused several times.
Discard if it yellows.
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X)
Sigma-Aldrich
Dissolve AraC in NB and sterile filter.
Store at -80°C
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well.
Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.
Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. . Goslin, K., Banker, G. The MIT Press. 339-370 (1998).
Kaech, S., Banker, G.
Nat Protoc. 1,
Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K.
J Neurosci. 19,
Dent, E. W., Kalil, K.
Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).
Dent, E. W.
Nat Cell Biol. 9,
Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W.
J Neurosci. 28,
Lebrand, C.
Neuron. 42, 37-49 (2004).
Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. . Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).
Osumi, N., Inoue, T.
Methods. 24, 35-42 (2001).
Zeitelhofer, M.
Nat Protoc. 2,
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【求助】小鼠胎鼠海马神经元原代培养中出现的又粗又长的结构是什么
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这个帖子发布于3年零156天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
如题，请高手指教。这是更换神经细胞分散液为胰酶消化细胞种板后第5天开始出现的结构，分别展示了两个孔里的其中之一异常结构，依次为5倍、10倍、20倍、40倍图像，此异常结构有很多，在5倍镜下即可看到。我个人分析是换胰酶后终止消化时用了血清，导致杂细胞过度增长，此结构可能是少突胶质细胞形成的髓鞘。我用的是neurobasal培养基，添加B27和谷氨酰胺，未加阿糖胞苷，但以前用神经细胞分散液消化细胞时从未出现此现象。注|：其中一一侧细胞已死亡的孔是我验证问题故意弄死的，展示在这里是为了能在细胞群边缘更好地显示此异常结构。
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感觉是杂细胞，用抗体染一下就知道了。
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sunhe831109 感觉是杂细胞，用抗体染一下就知道了。你的意思是不是染神经元和树突？可否详细指导一下，小弟刚开始做实验，只会养细胞。
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具体我也不知道是什么，很可能是神经胶质细胞，但是只是猜测，我的意思你想知道具体是什么，只能用特异性抗体标记一下，是神经元还是胶质细胞。
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sunhe831109 具体我也不知道是什么，很可能是神经胶质细胞，但是只是猜测，我的意思你想知道具体是什么，只能用特异性抗体标记一下，是神经元还是胶质细胞。 明白了，谢谢前辈！
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这么小的鼠你们究竟是如何快速去除海马组织的，一直都很好奇！
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celestin-chen 这么小的鼠你们究竟是如何快速去除海马组织的，一直都很好奇！ 先把左右大脑半球用镊子从中间分开，然后去除一侧大脑半球和海马的脑膜，再沿着海马的边界将其剪下就可以了。熟能生巧。
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海马神经元细胞的的培养方法 越详细越好 **大神指点
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yj1984ren edited on
现在养细胞也出现了同样的问题，不知道楼主现在找到答案没
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关于丁香园君，已阅读到文档的结尾了呢~~
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胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定
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3秒自动关闭窗口优秀研究生学位论文题录展示氯胺酮对大鼠胎鼠海马神经元凋亡的影响专　业: 麻醉学关键词: 氯胺酮 海马神经元 细胞凋亡 Bax Bcl-2分类号: R614.1　
R338.2形　态: 共 46 页　约 30,130 个字　约 1.441 M内容阅　读: 内容摘要目前世界上每年有150万婴幼儿因需进行外科手术或介入治疗等多种原因而接受全身麻醉。长期以来，全身麻醉是否影响婴幼儿的智力发育一直是患儿亲属十分关注的问题，并往往因这种顾虑而耽误了最佳手术治疗时机。至今为止，国内外对此问题还没有进行深入系统的研究，因而麻醉药物对婴幼儿智力发育的影响成为了目前待解决而又未有明确答案的问题。婴幼儿处于脑发育的关键时期，中枢神经系统的可塑性很大，易受内外环境的影响，这为证实麻醉药是否作用于婴幼儿的大脑而影响智力发育提供了理论上的可能性。氯胺酮是NMDA受体的非竞争性拮抗剂，具有起效快、镇痛效果好及作用时间短等优点，在婴幼儿麻醉中应用广泛。近年的研究表明，在脑发育的关键期短暂的使用NMDA拮抗剂可诱发新生鼠多个重要脑区大量神经元发生凋亡，并可对成年期的行为学和认知功能产生重大的影响。乙醇既是NMDA受体的拮抗剂，又是GABAA受体的激动剂。目前有大量的研究指出，孕妇过度服用乙醇，可造成胎儿海马和其它脑区神经元凋亡，导致胎儿酒精综合症，表现为行为异常、学习能力下降等精神疾患。氯胺酮作为NMDA受体的拮抗剂的一种，作用于婴幼儿的大脑，是否也有相似的作用呢?目前尚不明确。细胞的凋亡常常受抑凋亡基因及促凋亡基因的控制，Bax和Bcl-2是和凋亡密切相关的基因，在中枢神经系统的发育过程中起着重要作用，并且在海马等多个脑区中表达量很丰富。氯胺酮如果对未成熟大脑神经元凋亡有影响，是否是通过Bax和Bcl-2基因表达的改变而发挥作用?目前这方面的研究少见。本实验在体外分离培养大鼠海马神经元细胞的基础上，观察不同浓度的氯胺酮对大鼠海马神经元凋亡的影响，从细胞存活率、细胞形态学、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达等方面对氯胺酮损伤海马神经元的过程及机理进行探讨，为进一步的分子机制等研究提供依据。实验方法1.海马神经元原代培养：选用妊娠18d的SD大鼠的胎鼠，分离海马组织，机械吹打法分离成单细胞悬液，接种于24孔板。3～6hr细胞贴壁后换成无血清培养基DMEM/F12+2%B27。2.实验设计：实验设计采用完全随机化设计，分析研究不同浓度的氯胺酮对体外培养5d的大鼠海马神经元凋亡的影响。2.1实验分组将体外培养5d生长良好的海马神经元，随机分成以下5组进行实验。对照组：正常培养，未作处理，但与实验组同时换液0.1uM组：加入氯胺酮使其终浓度0.1uMuM为umol/L的简写1uM组：加入氯胺酮使其终浓度为1uM10uM组：加入氯胺酮使其终浓度为10uM20uM组：加入氯胺酮使其终浓度为20uM以上5组在上述处理后培养24hr，之后全量换培养液2%B27+DMEM/F12，继续培养24hr后观察各指标的变化。2.2主要检测指标1MTT、FDA染色检测氯胺酮对海马神经元存活率的影响；台盼蓝染色鉴别海马神经元的坏死与凋亡。2光学显微镜下对氯胺酮处理后的神经元进行形态学观察；3Hoechst33258核染色及TUNEL法检测细胞凋亡情况；4免疫细胞化学方法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达情况，以探讨氯胺酮诱导凋亡的相关机理。每组在每次实验中均设至少4个孔，对每次实验均行3次独立的细胞培养进行重复，以避免不同次的细胞培养造成实验结果的差异。统计学分析所有计量资料数据以均数±标准差x±s表示，应用SPSS11.0版统计学软件，采用方差分析法进行检验，各处理组与对照组间的比较采用DUNNETT过程，各组间两两比较采用S-N-K过程。以P＜0.05作为差异有显著性。实验结果:1.海马神经元的培养及鉴定：取培养5d的细胞，进行微管结合蛋白2MAP2抗体免疫组化染色鉴定。显微镜下，胞浆、轴突和树突呈棕褐色或棕黄色的细胞为神经元，结果显示神经元纯度在90%以上。2.氯胺酮对海马神经元存活率的影响氯胺酮处理后，MTT及FDA染色结果均显示，0.1uM、1uM组细胞存活率略有降低，但与对照组无差异；而10uM、20uM组的神经元存活率明显降低p＜0.001.台盼蓝染色结果显示各组的细胞坏死比例无差异。3.氯胺酮对海马神经元凋亡发生的影响3.1形态学观察倒置相差显微镜下观察各组神经元。0.1uM、1uM组的神经元与对照组无差异。10uM、20uM组的海马神经元，见细胞胞体缩小，胞浆浓缩，细胞核固缩，神经元突起中断，呈典型的凋亡形态学改变。3.2细胞凋亡检测结果分析Hoechst33258染色及TUNEL染色均显示0.1uM、1uM组细胞凋亡比例与对照组无差异。而10uM、20uM组细胞凋亡比例明显增高p＜0.001，20uM组细胞凋亡比例高于10uM组p＜0.05。4.氯胺酮对Bcl-2及Bax蛋白表达的影响免疫细胞化学染色法发现，10uM、20uM氯胺酮处理后，与对照组比较，Bax蛋白的表达水平明显上调p＜0.001，而20uM组Bax蛋白OD值高于10uM组p＜0.05；Bcl-2蛋白水平则下调p＜0.001，20uM组Bcl-2蛋白OD值低于10uM组p＜0.05。0.1uM、luM组的Bcl-2、Bax蛋白表达与对照组相比无显著性差异。结论:1.氯胺酮在一定的浓度范围内≥10uM可明显地诱导大鼠胎鼠海马神经元凋亡，并与剂量有关。2.Bcl-2及Bax蛋白表达的改变可能与氯胺酮诱导大鼠胎鼠海马神经元凋亡的机制有关..……全文目录文摘英文文摘前言材料与方法结果讨论结论参考文献附录1 英文缩写词表附录2 实验图片相似论文,36
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> <font color=@4.1 > 医药、卫生 > 外科学 > 外科手术学 > 麻醉学其他分类:
> <font color=@8.2 > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生理学 > 神经生理学
& 2012 book.