提高烟草CO_2固定能力的遗传操作--《昆明理工大学》2007年硕士论文
提高烟草CO_2固定能力的遗传操作
【摘要】：
根据植物光合作用暗反应产生的第一个产物的碳原子数是三还是四可将植物的光合作用分为C_3光合作用和C_4光合作用。通过C_3光合作用固定二氧化碳的植物叫C_3植物，通过C_4光合作用固定二氧化碳的植物叫C_4植物。在干旱高温和高光的条件下，C_4植物的二氧化碳固定效率比C_3植物高1.5～2倍。大多数重要的农作物如烟草，小麦，水稻等都是C_3植物。如何将C_4植物的这一机制转移到C_3作物上一直以来都是众多植物生物学家的主要研究课题之一。常规的杂交育种很难实现，但利用植物基因工程技术，可把与C_4植物的CO_2浓缩机制有关的基因转入C_3植物，可望使其获得C_4植物的优良特性，提高其CO_2固定能力。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)、磷酸烯醇式丙酮酸／磷酸载体蛋白(PEP／Pi)和苹果酸／钠离子载体蛋白(Malate／Na)是C_4植物光合作用过程中关键作用的酶及载体蛋白。因此本研究尝试以C_3植物烟草(野生型烟草和PCK转基因烟草)为研究材料，通过植物基因工程技术在烟草中过量表达C_4循环途径关键蛋白质PEPC和PEP／Pi载体蛋白，使用合适的信号肽序列，使PEPC表达后定位于烟草叶肉细胞的细胞质(或叶绿体)中，成为类C_4循环途径的CO_2固定酶；使PEP／Pi载体蛋白定位于叶绿体内膜上，成为运送OAA和PEP进出叶绿体中的通道。为在烟草中构建类C_4循环机制、改良C_3植物CO_2固定能力奠定研究基础。本研究所取得的主要研究结果如下：
研究中所用的PEP／Pi载体蛋白基因和PEPC基因分别来自拟南芥和嗜热蓝藻。利用Gateway~(TM)技术成功构建了以35S为启动子的PEP／Pi基因植物组成型表达pH35S-PEP／Pi和3个以rbcS为启动子的PEPC基因光诱导型植物表达载体pH-rbcS-KsPEPC、pH-rbcS-SvPEPC和pH-rbcS-T-SvPEPC(其中SvPEPC是野生型，KsPEPC是突变型)。采用电转化法将4个植物表达载体导入到农杆菌pPMP90中，再利用农杆菌介导法转化到野生型烟草和转PCK基因烟草(P7)中，通过抗性筛选和PCR检测获得转PEP／Pi基因烟草株系18个和转PEP／Pi和PCK基因烟草株系16个，转KsPEPC基因烟草株系12个和转KsPEPC和PCK基因烟草株系15个。
RT-PCR检测结果表明PEP／Pi、KsPEPC在转基因烟草中均能成功地转录。酶活测定结果表明转KsPEPC基因(定位细胞质)烟草植株的PEPC的酶活性比对照提高约3～5倍，表明PEPC基因的表达可以提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的活性；与此同时转KsPEPC基因(定位叶绿体)烟草的叶片出现了黄化网状叶表型。在中氮(5mMolN／L)营养条件下进行盆栽试验，T_2代转PEP／Pi和PCK双基因烟草的植株比T_2代转PEP／Pi单基因的植株及对照植株矮约1～2倍。
以上结果表明成功地构建了1个PEP／Pi基因组成型植物表达载体和3个PEPC基因光诱导型植物表达载体，这些载体转入烟草中并能够得到表达。转KsPEPC基因(定位细胞质)烟草植株的PEPC的酶活性比对照提高约3～5倍。同时获得了转单基因烟草4个(分别为转PEP／Pi基因，转细胞质型KsPEPC基因，转叶绿体型SvPEPC和KsPEPC基因)、转双基因烟草4个(分别为转PEP／Pi+PCK基因，转细胞质型KsPEPC+PCK基因，转叶绿体型SvPEPC+PCK基因，转叶绿体型KsPEPC+PCK基因)，这些转基因烟草可以为今后的研究提供试验材料．这些结果为在没有花环状结构的C_3植物叶片环境中安装类C_4光合作用代谢途径奠定了实验基础。
【学位授予单位】：昆明理工大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分类号】：Q943.2
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