高效液相法测定大鼠血浆中DL0309含量及其药代动力学--《中国药理学会第十一次全国学术会议专刊》2011年
高效液相法测定大鼠血浆中DL0309含量及其药代动力学
【摘要】：目的建立大鼠血浆中DL0309含量的高效液相测定方法,并对其在大鼠体内药代动力学及组织分布进行研究。方法样品经甲醇沉淀蛋白,13 400rpm离心10 min,取上清液氮气吹干,50μl甲醇复溶,13 400 rpm离心10 min,取上清液进样。采用高效液相色谱法,Agilent SB-C18(5μm,4.6×250 mm,USA),柱温40℃。流动相由0.1%磷酸水溶液:乙腈(65:35V/V)组成,流速为1 ml·min~(-1),检测波长为286 nm,248 nm,230 nm。取SD大鼠108只,230～250 g,雌雄各半,口服灌胃给药,剂量分别为150,300和600 mg·kg~(-1),HPLC测定DL0309及代谢产物水杨酸的血药浓度,DAS软件计算药代动力学参数。另取18只SD大鼠,230～250 g,雌雄各半,口服灌胃给药300 mg·kg~(-1),于给药后2,6,10 h断头处死大鼠,测定DL0309及水杨酸组织分布情况。结果 DL～32μg·ml~(-1)范围内线性良好,相关系数r=0.9998。日内日间精密度RSD值均小于10%,回收率大于80%。水杨酸在0.25～500μg·ml~(-1)范围内线性良好,相关系数r=0.9994(T=1/C)。日内日间精密度RSD均小于10%,回收率大于90%。DL0309给药600,300和150 mg·kg~(-1)剂量后,各组的T_(1/2)和AUC分别为15,5,15 min和10.574,6.9μg·ml~(-1)·h。检测代谢产物水杨酸的血药浓度,各组T_(1/2)和AUC分别为6,8,6 h和6.38,843.53μg·ml~(-1)·h。DL0309在胃及小肠中有少量分布,水杨酸在胃、小肠、睾丸、卵巢、肾、肝、脾等组织中有少量分布。结论本测定方法简单、灵敏、准确,可用于DL0309在大鼠体内药代动力学的研究,DL0309口服给药后,原型药血药浓度AUC与给药剂量呈线性关系(r=0.98),表明在研究的计量范围内,原型药在大鼠体内的消除过程是线性的,并在胃、肠等组织中有少量分布,代谢产物水杨酸血药浓度与给药剂量不呈线性关系,其在大鼠体内分布较为广泛,尤其是肝、肾、睾丸、卵巢等组织中。
【作者单位】：
【分类号】：R96【正文快照】：
高效液相法测定大鼠血浆中DL0309含量及其药代动力学@张丹$中国医学科学院北京协和医学院药物研究所!北京 100050
@黄超$中国医学科学院北京协和医学院药物研究所!北京 100050
@张天泰$中国医学科学院北京协和医学院药物研究所!北京 100050
@杜冠华$中国医学科学院北京
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高效液相色谱法测定大鼠血浆及组织中多柔比星含量
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【求助】请教HPLC测定血药跟尿液浓度时加入内标物的问题
最近做到这一块的内容，看文献资料时看到大家做时都加入了内标物质，但同时又都做了标曲，所以我想请问一下，测定血药浓度时加入的这个内标物的作用是什么？怎么选取相应的内标物？请做过了解的大侠不吝赐教，如果可以请推荐一些做血药尿液的书籍资料。谢谢^_^
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反相高效液相色谱法检测大鼠血浆吡非尼酮浓度
　　摘要：目的 ：建立高效液相色谱法检测大鼠血浆吡非尼酮浓度的方法。 中国论文网 http://www.xzbu.com/1/view-5247640.htm　　方法 ：以ZORBAX XDB-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）分离；以乙腈-0.2%三氟乙酸-水为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL?min-1；检测波长314nm，柱温为30℃。以卡马西平为内标，大鼠血浆经乙酸乙酯萃取后检测。 　　结果 ：吡非尼酮浓度在0.05～6.00mg?L-1范围内线性关系良好（r=0.9998）；低中高三个浓度（0.1、1.00、4.00mg?L-1）的日内精密度RSD分别为4.95%、2.86%和2.15%，日间精密度RSD分别为5.39%、4.04%和2.62%；相对回收率分别为（102.33±5.47）%、（101.38±3.69）%和（101.84±3.24）%。 　　结论 ：该方法稳定准确、简便快速，适用于大鼠血浆吡非尼酮浓度的测定及其药代动力学研究。 　　关键词 ：吡非尼酮 高效液相色谱法 血浆浓度 　　Doi：10.3969/j.issn.13.07.042 　　Determination of pirfenidone in Rat Plasma by RP-HPLC 　　Wang Lingfei Song Jijun Gu Jianping 　　Abstract：Objective：To develop a HPLC method for determination of pirfenidone in rat plasma. 　　Methods：The analytical column was packed with ZORBAX XDB-C18. The mobile phase was acetonitrile-water-0.2% trifluoroacetic acid using gradient elution and the flow rate was 1.0 mL?min-1. The detection wavelength was set at 314 nm. Excellent liner relationship was obtained from the range of 0.05 mg?L-1 to 6.00 mg?L-1（r=0.9998）. The intra-day RSD were 4.95%、2.86%and 2.15% and inter-day RSD were 5.39%、4.04% and 2.62% respectively at three concentrations（0.1、1.00、4.00 mg?L-1）， the relative recoveries were （102.33±5.47）%， （101.38±3.69）% and（101.84±3.24）% respectively. 　　Result： 　　Conclusion：The method is steady， accurate， simple， rapid and suitable for determination of pirfenidone concentration in rat plasma and study of its pharmacokinetics. 　　Keywords：Pirfenidone HPLC Plasma concentration 　　【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】（5-02 　　试剂与药品。甲醇、乙腈为色谱纯（天津科密欧化学试剂有限公司），三氟乙酸（Sigma-Aidrich，BCBC2263V），乙酸乙酯、碳酸钠为分析纯。吡非尼酮对照品（Sigma，）；卡马西平对照品（中国食品药品检定院，批号：041201）。 　　1.2 仪器。高效液相色谱仪为Agilent 1100系列产品，配置有G1322A在线脱气机、G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1316A温控箱、G1315B二极管阵列检测器；其他仪器有涡旋混合器和氮吹仪。 　　1.3 标准品溶液配制。准确称取吡非尼酮标准品10mg，用甲醇溶解并定容至10ml，得吡非尼酮标准储备液的浓度为1g?L-1；吡非尼酮标准工作液浓度依次为100、10、1mg?L-1（用纯净水稀释）。 　　准确称取替硝唑标准品25mg，用甲醇溶解并定容至25mL，得替硝唑标准储备液浓度为1g?L-1；替硝唑内标工作溶液浓度为100mg?L-1（用甲醇稀释）。 　　1.4 色谱条件。色谱柱：ZORBAX XDB-C18（4.6×150mm，5.0μm）；保护柱：XDB-C18保护柱（4.6×12.5mm，5μm）；流动相为乙腈-水-0.2%三氟乙酸体系，梯度洗脱（0～5min，乙腈28%→38%，水52%→42%，0.2%三氟乙酸20%）；流速：1.0mL?min-1；柱温：30℃；检测波长：314nm。 　　1.5 血浆样品处理方法。吸取大鼠血浆样品0.2mL于10mL具塞试管中，加入100mg?L-1替硝唑内标工作液25μL，加入10% Na2CO3 250μL，混匀。加入乙酸乙酯3.0mL，漩涡混合2min后，离心分层，吸取上层有机相于另一锥底试管中，氮吹仪中吹干。200μL流动相复溶，20μL进样。
　　2 结果 　　2.1 专属性。血浆中吡非尼酮和内标峰形良好，分离完全，无内源性杂质峰干扰。吡非尼酮Rt为6.6min，内标Rt为8.4min。见图1。 　　2.2 标准曲线及定量下限。用空白血浆和吡非尼酮标准工作液，配成吡非尼酮血浆对照品溶液浓度依次为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00mg?L-1，按1.5处理后检测，记录吡非尼酮面积As、内标峰面积Ai，纵坐标（y）为As/Ai，横坐标（x）为对应浓度，绘制标准曲线。吡非尼酮的标准曲线回归方程为y=0.8（r=0.9998）。定量下限为0.05mg?L-1。 　　2.3 精密度试验。配制0.10，1.00，4.00mg?L-13个浓度的吡非尼酮血浆对照品溶液，平行6组，按血浆样品处理方法处理。在同1d检测，计算日内精密度；连续测定3d，计算日间精密度。见表1。 　　表1 大鼠血浆吡非尼酮的精密度结果（X±S，n=6） 　　2.4 回收率试验。配制0.10，1.00，4.00mg?L-13个浓度的吡非尼酮血浆对照品溶液，平行6组，按1.5项处理。依据标准曲线计算各自的浓度，计算相对回收率。同时记录吡非尼酮的峰面积，与标准溶液峰面积比较，计算绝对回收率。见表2。 　　表2 大鼠血浆吡非尼酮的回收率结果 　　2.5 样品稳定性。配制0.10，1.00，4.00mg?L-13个浓度的吡非尼酮血浆对照品溶液，分别考察在室温放置、反复冻融3次以及在-80℃冰箱冰冻保存条件下的稳定性。结果显示吡非尼酮有良好的稳定性，3个浓度的RSD均小于10%。 　　2.6 应用。雄性SD大鼠6只，体重180-230g，正常饲养3d，试验前禁食12h，自由饮水。吡非尼酮用0.3%羧甲基纤维素溶解后，每只按20mg?kg-1的剂量灌胃给药。分别在给药前和给药后0.08，0.17，0.33，0.67，1，1.5，2，3，4，6，9h尾静脉采集血液0.5mL。3000rpm离心10min后，分离血浆。 　　用该方法测定大鼠血浆中吡非尼酮的含量。6只大鼠血浆吡非尼酮的平均药物浓度-时间曲线见图2；用DAS2.0程序计算吡非尼酮的主要药动学参数为：Cmax为（2.19±0.40）mg?L-1，Tmax为（0.56±0.18）h，t1/2α为（0.38±0.10）h，t1/2β为（2.30±0.21）h，AUC（0-t）为（6.27±1.47）mg?h?L-1，AUC（0-∞）为（6.58±1.56）mg?h?L-1，CL/F为（3.20±0.80）L?h-1?kg-1，V/F为（9.46±2.10）L?kg-1。吡非尼酮在大鼠体内符合一级吸收的二室模型。 　　3 讨论 　　有报道用HPLC-UV[5，7]和LC-MS[6]的方法检测生物样品中吡非尼酮的浓度。吡非尼酮在紫外区吸收良好，最大吸收波长在314nm处；故本研究使用314nm为检测波长。 　　本研究中发现，使用三氟乙酸调节pH后，吡非尼酮的峰形得到改善；同时采用部分梯度洗脱，使吡非尼酮和内标的保留时间相差缩短，两者的理论塔板数增高。液-液萃取法，结果显示，用碳酸钠碱化血浆样品后，以乙酸乙酯为萃取试剂，吡非尼酮和内标物均具有较高的提取率；且较少引入杂质，故最终确定碱性条件下液-液萃取法为血浆样品的处理方法。 　　本研究建立的HPLC-UV法检测大鼠血浆吡非尼酮浓度，专属性高，相对回收率、绝对回收率以及日内和日间变异均符合药代动力学研究的要求；且检测时间为6.5min，较文献[5-7]短。 　　本研究显示，大鼠灌胃给予吡非尼酮后，吡非尼酮的Tmax为0.56h，Cmax为2.19mg?L-1左右，t1/2约为2.3h左右。吡非尼酮在大鼠体内符合二室模型；主要药代动力学参数与文献接近。 　　参考文献 　　[1] 李丽，阳慧湘.吡非尼酮抗肝纤维化机制[J].国际病理科学与临床杂志，）：220-225 　　[2] 李鹏旺，庞纪平，刘俊芳.吡非尼酮的药理学及疾病治疗学研究进展[J].天津药学，）：73-76 　　[3] 马兆娟，李惠萍.特发性肺纤维化急性加重的研究进展[J].同济大学学报，）：108-113 　　[4] 纪春阳，李娣昕，曾红兵.吡非尼酮对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏间质纤维化的影响[J].华中科技大学学报（医学版），）：350-354 　　[5] 师少军，吴健鸿，陈汇，等.高效液相色谱法测定人血浆吡非尼酮浓度[J].中国药学杂志，）：138-141 　　[6] TONG SH， WANG XQ， TIANG HY， et al. Determination of pirfenidone in rat plasma by LC-MS-MS and its application to a pharmacokinetic study[J]. Chromatographia，9-712 　　[7] 肖敏，李军伟，孙未.HPLC法检测大鼠血浆中吡非尼酮的浓度及其药动学研究[J].药物分析杂志，）：202-205
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xzbu发布此信息目的在于传播更多信息，与本网站立场无关。xzbu不保证该信息（包括但不限于文字、数据及图表）准确性、真实性、完整性等。告诉你我体内至少流着5正义之血惠然吧史辑+景海漪+黄玉秋+范亚楠+贾天柱摘要：目的探討炮制对巴戟天中水晶兰苷在大鼠体内血药浓度及组织分布的影响。方法分别给予SD大鼠灌胃巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天的正丁醇萃取
告诉你我体内至少流着5 正义之血 惠然吧史辑+景海漪+黄玉秋+范亚楠+贾天柱摘要：目的 探討炮制对巴戟天中水晶兰苷在大鼠体内血药浓度及组织分布的影响。方法 分别给予SD大鼠灌胃巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天的正丁醇萃取物，采用HPLC，Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，柱温25 ℃，检测波长235 nm，测定血浆及各组织中水晶兰苷的含量。结果 巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天中水晶兰苷高、中、低剂量（0.177、1.77、17.7 ?g/mL）的药代动力学特征符合二室模型，在所研究的剂量范围内，AUC与给药剂量呈现良好的线性相关性，符合线性动力学特征。灌胃给药60 min后，水晶兰苷在肾、肺、肝、脾的浓度达到最大，在肾组织和肝组织中的浓度分布为盐巴戟天>巴戟肉>制巴戟天，在脾组织中浓度分布为制巴戟天>盐巴戟天>巴戟肉。结论 不同炮制方法对巴戟天在大鼠体内血药浓度及组织分布有一定影响。关键词：巴戟天；水晶兰苷；药代动力学；组织分布；高效液相色谱法DOI：10.3969/j.issn.17.05.018中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：（6-06Effects of Monotropein in Different Processing Products of Morindae Officinalis Radix on Plasma Concentration and Tissue Distribution in Rats SHI Ji1，2，3， JING Hai-yi1， HUANG Yu-qiu1， FAN Ya-nan1， JIA Tian-zhu1，2，3 （1. College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 2. Key Laboratory of Processing Principle Analysis， State Administration of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 3. Liaoning Research Center of Processing Engineering Technology for TCM， Dalian 116600， China）Abstract： Objective To study the effects of monotropein in different processed products of Morindae Officinalis Radix on plasma concentration and tissue distribution in rats. Methods The n-butanol extracts of Morindae Officinalis Radix and its processing products by salt and licorice were given to SD rats orally. HPLC was employed， Venusil MP C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m） with the mobile phase consisting of methanol-0.4% phosphoric acid at the detection wavelength of 235 nm and a column temperature of 25 ℃. The content of monotropein in plasma and tissues was determined. Results The pharmacokinetics of the monotropein in three different dosages （0.177， 1.77， 17.7 ?g/mL） of different processing products of Morindae Officinalis Radix in the rats fit the two-compartment model. In the dose range studied， AUC showed a good linear correlation with dose， which accorded with linear dynamic characteristics. After 60 min of gavage， the concentration of monotropein reached the highest in kidney， lung， liver and spleen. The concentrations of monotropein were Morindae Officinalis Radix processed by salt & Morindae Officinalis Radix & Morindae Officinalis Radix processed by licorice in kidney tissues and liver tissues， Morindae Officinalis Radix processed by licorice & Morindae Officinalis Radix processed by salt & Morindae Officinalis Radix in spleen tissues. Conclusion The different processing methods have certain influence on the plasma concentration and tissue distribution of Morindae Officinalis Radix in rats.
Key words： Morindae Officinalis Radix； monotropein； pharmacokinetics； tissue distribution； HPLC巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根，具有补肾阳、抗风湿、强筋骨作用。2015年版《中华人民共和国药典》收载其炮制品种有巴戟天、巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天，巴戟天生品偏于祛风湿，盐巴戟天补肾壮阳作用增强，制巴戟天则偏于脾肾双补[1]。环烯醚萜苷类是巴戟天的主要有效成分，其中以水晶兰苷（monotropein）含量最高。本课题组前期研究发现，巴戟天经炮制后水晶兰苷含量显著增加[2]。近年来对巴戟天炮制前后的药理药效学研究逐渐增多[3-6]，但炮制影响巴戟天有效成分在体内分布的研究尚未见报道。药物的体内代谢过程在一定程度上对药效有影响。本研究比较巴戟天不同炮制品中水晶兰苷在大鼠体内的血药浓度及其组织分布特征，为系统阐明巴戟天炮制前后功效变化奠定基础。1 仪器、试药与动物Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），紫外检测器（美国安捷伦公司），Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m，天津博纳艾杰尔科技有限公司），Mettler AE240电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），KQ-5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HGC-12A氮吹仪（天津恒奥科技有限公司），XW-80A微型涡旋混合仪（上海青浦沪西分析仪器厂），TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂），微量移液枪（芬兰雷勃仪器厂）。巴戟天药材购自广东省德庆高粱镇巴戟天GAP种植基地，甘草药材购自大连开发区阳光大药房，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定，分别为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根和豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎；精制盐（大连盐业有限公司，批号）。水晶兰苷对照品（批号MUST-，质量分数≥98.0%），成都曼思特生物科技有限公司；栀子苷对照品（批号，质量分数≥98.0%），中国食品药品检定研究院；乙腈和甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。SPF级SD雄性大鼠100只，40日龄左右，体质量（200±20）g，大连医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（辽）。在温度20～22 ℃、相对湿度45%～65%、光照/黑暗12 h/12 h条件下饲养，自由饮食、饮水，适应性饲养1周。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱为Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液，梯度洗脱（见表1），流速为1.0 mL/min，检测波长为235 nm，柱温为25 ℃。进样量为20 ?L。内标为栀子苷。2.2 溶液制备2.2.1 炮制品制备 ①巴戟肉：取原药材，除去杂质及木心，洗净，晒干。②盐巴戟天：取净巴戟天，加入适量食盐水（每100 g巴戟天，盐2 g），拌匀，闷润，待盐水被吸尽后蒸透，趁热除去木心，切段干燥。③制巴戟天：取甘草煎汤3次，去渣，得甘草汁。取净巴戟天，加药材量1.5倍甘草汁（相当于每100 g巴戟天加甘草6 g），文火煮至甘草汁被吸尽，趁热抽去木心，切段，干燥。2.2.2 供试品溶液制备 分别取巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天，切成2～5 mm的段，加入8倍量80%乙醇，回流提取3次，每次2 h，过滤，弃去药渣，滤液减压浓缩至无醇味，得浓缩液。浓缩液加适量蒸馏水混悬，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，回收溶剂。收集正丁醇萃取物，加适量蒸馏水混悬至浓度为4 g/mL的提取液。2.2.3 对照品溶液制备 精密称取水晶兰苷对照品适量，加甲醇制成0.354 0 mg/mL对照品溶液。再分别以适量甲醇按倍数稀释法稀释得水晶兰苷系列对照品溶液，置4 ℃冰箱中保存备用。2.3 内标溶液配制精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成0.423 0 mg/mL对照品溶液，置4 ℃冰箱中保存备用。2.4 给药与样品采集取健康SD大鼠，随机分为巴戟肉组、盐巴戟天组和制巴戟天组，给药前禁食不禁水24 h，各组大鼠分别灌胃给予相应提取物20 g/kg 1次。于给药前和给药后5、10、15、20、30、45、60、120、240、360、480、720、1440 min经眼眶静脉丛取血约0.5 mL，置预先肝素化的离心试管中，10 000 r/min离心10 min，分离血浆，-20 ℃冰箱保存备用。取健康SD大鼠，给药前禁食不禁水24 h，巴戟肉组、盐巴戟天组和制巴戟天组大鼠分别灌胃给予相应药物20 g/kg 1次。分别于给药后15、60、360 min后处死大鼠，每个时间点6只，立即解剖采集心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠和脑组织，组织样品经生理盐水冲洗，去除表面的血液和内容物后，称重，装入自封袋中，-20 ℃冰箱冰冻保存备用。2.5 血浆及组织样品预处理取血浆样品200 ?L，置2.0 mL肝素化离心管中，精密加入内标溶液（栀子苷）100 ?L、乙腈200 ?L、甲醇400 ?L，涡旋震荡混合2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，35 ℃空气流吹干，残留物用甲醇- 0.4%磷酸溶液（5∶95）100 ?L超声溶解，12 000 r/min离心5 min，取上清液20 ?L进样检测。
取组织样品（心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠和脑）各0.5 g，精密稱定，加入生理盐水1 mL，用匀浆机制备组织匀浆。组织匀浆超声后，10 000 r/min离心5 min。取上层液100 ?L，置2.0 mL离心管中，精密加入内标溶液（栀子苷）100 ?L、乙腈200 ?L、甲醇400 ?L，涡旋震荡混合2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，35 ℃空气流吹干，残留物用甲醇- 0.4%磷酸溶液（5∶95）100 ?L超声溶解，12 000 r/min离心5 min，取上清液20 ?L进样检测。2.6 方法学考察2.6.1 专属性 空白血浆、加药血浆和血浆样品HPLC图显示，血浆内源性物质对药物和内标的检测无干扰，水晶兰苷和栀子苷内标峰峰形好、分离度高，表明该法的专属性好。取大鼠空白组织（小肠）匀浆上清液100 ?L，组织样品中除不加内标溶液外，其余按“2.5”项下组织样品处理操作，获得空白样品色谱图；将水晶兰苷对照品溶液和栀子苷内标溶液加入空白组织（小肠）匀浆中，同法操作，获得相应色谱图；同法操作，获得大鼠灌胃巴戟天提取液后小肠组织样品色谱图。结果表明，组织中内源性物质不干扰水晶兰苷和内标物栀子苷的测定。色谱图见图1。2.6.2 标准曲线 取大鼠空白血浆100 ?L，依次加入系列对照品溶液100 ?L，配制成相当于大鼠血浆药物浓度分别为17.7、7.08、3.54、1.77、0.708、0.354、0.177 ?g/mL的血浆样品。按“2.5”项下方法处理并测定，建立标准曲线。以血浆中水晶兰苷浓度（?g/mL）为横坐标，水晶兰苷与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（1/CC）最小二乘法进行回归计算，得回归方程Y=3.509 8X-0.096 8（r=0.996 8），表明血浆中水晶兰苷在0.177～17.7 ?g/mL浓度范围内线性关系良好。取大鼠空白组织（小肠）匀浆上层液100 μL，依次加入系列对照品溶液10 μL，配制成相当于大鼠组织药物浓度为17.7、7.08、3.54、1.77、0.708、0.354、0.177 μg/mL的组织样品。按“2.5”组织样品处理项下操作，进样20 μL测定，建立标准曲线。以组织中水晶兰苷浓度（?g/mL）为横坐标，水晶兰苷与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（1/CC）最小二乘法进行回归计算，得回归方程Y=0.553 6X-0.051 4（r=0.994 0），结果表明，组织中水晶兰苷在0.177～17.7 ?g/mL浓度范围内线性关系良好。2.6.3 精密度 按“2.5”项下方法分别配制水晶兰苷低、中、高3个浓度的大鼠空白血浆/组织样品（0.177、1.77、17.7 ?g/mL），每一浓度进样6次，连续测定3 d，随行标准曲线。根据当日标准曲线计算各样品的浓度，与配制浓度对照，求得血浆/组织样品测定方法的日内精密度和日间精密度。测定结果显示，低、中、高浓度日内精密度RSD=5.8%，日间精密度RSD=6.3%，符合测定要求。2.6.4 稳定性 取大鼠空白血浆（组织）100 ?L，按“2.5”项下方法配制水晶兰苷低、中、高3个浓度的空白血浆/组织样品（0.177、1.77、17.7 ?g/mL），室温保存24 h，再次测定，以考察样品在室温条件下的稳定性。每一浓度进行3样本分析。将2次测得结果的均值进行对照，计算相对误差（RE）。低、中、高3个浓度的RE值分别为4.7%（3.8%）、3.9%（4.3%）、4.2%（4.1%），表明水晶兰苷血浆/组织样品处理后在室温至少可稳定存放24 h。2.6.5 冻融稳定性 同法配制低、中、高3个浓度的血浆/组织样品，经反复3次-20 ℃冷冻-室温溶解，再测定样品浓度，以考察样品在冷冻和冻融条件下的稳定性。每一浓度进行3样本分析。将冻融前后2次测得结果的均值进行对照，计算相对误差（RE）。低、中、高3个浓度的RE值分别为3.9%（4.5%）、4.1%（4.0%）、4.5%（3.9%），表明血浆样品冻融3次基本稳定。2.6.6 提取回收率 取大鼠空白血浆100 ?L，按“2.5”项下方法制备低、中、高3个浓度的样品（分别为0.177、1.77、17.7 ?g/mL），每个浓度进行6样本分析。另取空白血浆（组织）100 ?L，按“2.5”项下方法操作，取上清液，分别加入相应浓度的对照品溶液100 ?L（各浓度平行操作3个样品），于35 ℃空气流下吹干，残留物用甲醇-0.4%磷酸溶液（5∶95）100 ?L超声溶解，12 000 r/min离心5 min，取上清液20 ?L进样检测，获得相应峰面积值（3次测定的平均值）。以每一浓度2种处理方法得峰面积比值，计算提取回收率，结果本法在大鼠血浆（组织）样品低、中、高3个浓度的提取回收率分别为75.0%±4.1%（80.9%±3.2%）、74.8%±3.5%（90.1%±3.7%）、75.1%±2.8%（87.3%±2.9%）。同法考察内标回收率为86.8%±4.5%（88.3%±3.5%）。2.7 水晶兰苷药时曲线未知样品测定按“2.5”项下方法操作，记录峰面积，计算血药浓度，并绘制平均血药浓度-时间曲线图，结果见图2。2.8 药代动力学参数测定采用DAS2.1.1软件对各组大鼠灌胃巴戟天不同炮制品后组织中水晶兰苷浓度数据进行分析，自选房室数和权重，分别进行一室、二室模型及1、1/C、1/CC 3种权重的曲线拟合，根据AIC最小和R2最大的原则，判定巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天均属于二室模型，权重系数为1/CC。结果见表2。2.9 水晶兰苷在大鼠体内的组织分布大鼠分别灌胃给予巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天提取液后，水晶兰苷在大鼠体内不同时间点（15、60、360 min）各组织中的浓度见表3。
采用SPSS19.0统计软件分析各组大鼠灌胃巴戟天不同炮制品后水晶兰苷在不同时间点的组织分布数据，结果见图3～图5。3 讨论本试验考察了Cromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）和Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色谱柱，结果表明，Venusil MP C18色谱柱可使水晶兰苷得到较好保留。试验中对乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.4%磷酸溶液作为流动相按不同比例进行了考察，同时考察了等度洗脱和梯度洗脱的分离效果，发现甲醇-0.4%磷酸溶液梯度洗脱（0～12 min，5%A～28.8%A；12～18 min，28.8%A～60%A；18～20 min，60%A～75%A；20～25 min，75%A～80%A）時，血浆样品中水晶兰苷达到基线分离，出峰时间适中，血浆中的内源性物质无干扰。水晶兰苷的最大吸收波长为235 nm，栀子苷的最大吸收波长为238 nm，考虑到整体效果，选择235 nm作为采集波长。同时，根据被测组分水晶兰苷的理化性质和色谱行为，选择栀子苷作为内标，经反复调整流动相后无干扰。本研究采用DAS2.1.1软件进行房室模型拟合分析，结果显示，巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天三者均符合二房室模型，即大鼠灌胃后，水晶兰苷瞬间就可在血液供应丰富的组织（如血液、肝、肾等）分布达到动态平衡，然后在血液供应较少或血流缓慢的组织（如脂肪、皮肤、骨骼等）分布达到动态平衡。巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天中水晶兰苷的体内分布过程没有明显差异。与巴戟肉相比，大鼠灌胃制巴戟天和盐巴戟天后达峰时间明显加快，半衰期缩短，说明其消除迅速；盐巴戟天AUC增加，表明其生物利用度较高。辅料盐和甘草汁能促进水晶兰苷的吸收。组织分布实验表明，在心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠组织中都能检测到水晶兰苷的存在，表明水晶兰苷可以在大鼠体内广泛分布与代谢，特别是在肾组织中的浓度较高。口服给药15 min后，水晶兰苷可分布至多数组织（脑组织除外），胃中含量最高，小肠次之，这可能与口服给药方式有关；大部分血流较丰富的组织（肾、肺、肝和脾）在给药60 min后药物浓度达高峰，然后逐渐下降，至6 h时已不能检测到原型药，这与该药在血液中的消除过程基本同步，表明水晶兰苷的组织分布与血流灌注过程密切相关。巴戟肉组肝、肺、肾随大鼠代谢时间变化水晶兰苷含量显著增加；盐巴戟天组各组织随大鼠代谢时间变化水晶兰苷含量均有增加，心、肝、肺和肾中水晶兰苷含量在60 min出现最大值；制巴戟天组胃、大肠和小肠随大鼠代谢时间变化水晶兰苷含量显著降低，而心、肝、脾、肺、肾含量增加，且脾中水晶兰苷的含量在60 min出现最大值。本研究结果表明，巴戟天经盐制后，能改善水晶兰苷在体内分布、吸收、代谢，促进其在肾组织的吸收，这与“盐制入肾经”的传统理论相符。巴戟天经甘草水制后，延长了水晶兰苷在大鼠体内被吸收的时间，且促进了水晶兰苷在脾和胃的吸收，这也从组织分布角度说明了制巴戟天脾肾双补作用增强的原因。参考文献：[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：75.[2] 肖新霞，潘胜利.巴戟天属植物化学成分、药理活性与临床应用[J].国外医药：植物药分册，）：243-248.[3] YOSHIKAWA M， YAMAGUCHI S， NISHISAKA H， et al. Chemical constituents of Chinese natural medicine， morindae radix， the dried roots of morinda officinalis How.：structures of morindolide and morofficinaloside[J]. Chem Pharm Bull （Tokyo），）：.[4] 景海漪，史辑，崔妮，等.不同炮制方法对巴戟天中寡糖类成分和水晶兰苷含量的影响[J].中国实验方剂学杂志，）：20-23.[5] 崔妮，史辑，贾天柱.巴戟天不同炮制品补肾壮阳作用的比较研究[J].中国中药杂志，）：.[6] 徐德峰，宓为峰，张素贞，等.巴戟天寡糖抗抑郁作用机制研究[J].中国临床药理学杂志，）：.
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