慢病毒载体之风险评估及生物安全建议
由于慢病毒载体（LV）在非分裂和分裂细胞中的稳定整合和长期的转基因表达，因此慢病毒载体（LV）是用于基因研究和基因治疗的基因转移载体。随着LV在转基因治疗中的应用，我们发现由于插入突变，复制能力的病毒的产生（RCL）和载体动员带来的生物安全问题。因此，研究人员继续致力于研究和设计LV，改善其功效和生物安全特性。
实验研究选择一个特定的LV系统通常是由功能决定的，包括提高生产力和/或转导效率。更安全的载体的设计也直接让研究人员受益，使他们能够进行低风险的实验研究。目前，载体结合了改进的安全特性（降低重组和载体动员的风险），提高了转导效率。因此，研究者无意中传播转导细胞有关的风险在评估这些载体的整体风险方面更为重要，并成为重要的生物安全问题。
本文通过比较最新的LV生产系统概述了提高LV生物安全性的不同方法，并强调在他们使用过程中生物安全问题也会出现。针对LV在研究中的使用进行讨论，一些国家和国际的生物安全建议被提出，就使用LV中最常见的研究活动的提出了建议。
病毒是一种生物制剂，其在感染时可以有效地将其遗传物质引入靶细胞，并依赖宿主细胞进行复制。载体可以携带目的基因进入细胞，代替野生型病毒基因。因此，非复制载体缺乏在细胞中自我繁殖的遗传信息，但仍保留向靶细胞引入目的基因的能力。慢病毒（LV）属于逆转录病毒家族（逆转录病毒，慢病毒属）。LV是目前最实用的基因载体，也是基因治疗应用中重要的研究工具，因为其可以感染细胞并使携带的基因整合到基因组上长期稳定的表达。人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）可能是已经研究的慢病毒中最适用的，虽然其致病性早就被人们所知，但是艾滋病病毒衍生的载体载基因治疗中的应用越来越受到人们关注，尤其是其在分化和不分裂的细胞的研究。此，已经有相当多的研究致力于设计具有更高生物安全特性的LV。此外，非基因治疗LV的应用也得到了广泛的研究，包括基于RNA干扰的哺乳动物细胞稳定基因敲除的基因功能的研究。虽然在实验研究中使用LV可能更倾向于它们的功能特性，包括提高生产力和/或转染效率，但更安全的载体的设计有助于提高实验的安全性。
LV被认为是重组病毒，还是细胞转染工具LV，这主要可能取决于涉及活动的目的或类型的若干监管规定和指导方针。在使用LV时，相关法规、指南做出了规定：（i）在工作场所，保护工人远离生物制剂暴露的风险；（ii）操作规范，正确谨慎处理转基因释放的（微）生物体或生物体含有重组DNA分子；（iii）保证人或兽用生物制品和药品的安全性，如使用LV的人员和LV转染的细胞
虽然用于治疗目的的LV或慢病毒转导细胞的使用产生了一些重要的问题包括质量、疗效、安全性、伦理、社会和监管问题，但是本次探讨的范围是限于LV在研究活动的生物风险评估。我们的目标是概述目前用于改善载体生物安全的不同策略，并比较最新的慢病毒包装系统。虽然这次探讨的重点是由单独的载体构成的危险，但是我们也认识到LV风险评估也应考虑到与转基因相关的危害。在LV中克隆癌基因或使shRNA介导的肿瘤抑制基因的敲除显然是需要严格的生物安全措施实施的高风险操作。本文主要阐述与宿主系统有关的载体选择，目前针对LV使用的生物安全建议以及较安全的LV生产系统。
2. 慢病毒载体潜在的不利因素
慢病毒载体的主要不良反应实际上是所有逆转录病毒载体的共病，因为它们都是利用逆转录病毒的生存周期，将病毒基因组整合到宿主细胞基因组。一旦感染，这些病毒的单链RNA基因组反转录为双链DNA中间体，然后整合在宿主基因组DNA，从而复制病毒。病毒可以将包含病毒编码区侧链的长末端重复序列同时插入宿主基因组中的多个位点。
一方面必须考虑的不良影响是在载体生产过程中，具有复制能力的慢病毒的产生和传播，这些必须在进行临床试验GMP生产中解决。这种具有复制能力的慢病毒的产生主要是通过同源重组序列之间发生重叠。虽然在亲嗜性逆转录病毒或者双嗜性逆转录病毒包膜感染的具有分裂功能的逆转录病毒整合细胞系中已经检测到了具有复制能力的逆转录病毒，但是目前并没有关于慢病毒载体细胞中出现具有复制能力慢病毒的报道。这可能取决于载体的结构，失活载体是不产生具有复制能力慢病毒的基础（见下文）。
另一方面需要考虑的不良影响是所有的逆转录病整合病毒DNA到宿主基因组中，有可能插入临近基因序列的突变区或者转录区的风险。在很多情况下，逆转录病毒的整合都会产生不良影响，例如肿瘤的形成。在γ逆转录病毒载体转染后，LMO2基因（已知的原癌基因）由长末端长度序列的增强子插入激活。这种情况在两个独立进项的X连锁重症联合免疫缺陷临床实验中的进行基因治疗的五个白血病病人中出现。小鼠急性随性包白血病也是因为逆转录病毒载体基因转插入到临近一个原癌基因后造成插入激活启动了发病机制。另一项研究发现，虽然还不清楚是否与发生插入突变或转录激活有关，但是在新生小鼠体内随着EIAV慢病毒载体（马传染性贫血病毒）携带的病毒基因的转移，肿瘤的发病率增高。最近，克隆优势化已经在一个使用转导携带染色质绝缘体的失活HIV-1慢病毒载体造血干细胞进行临床试验的受试者逐渐体现出来。克隆优势化的出现是由于整合到基因组上的载体基因可编码一个与良性和恶性肿瘤相关的HMGA2蛋白。研究发现HIV阳性患者癌症发生的风险也明显提高，这包括HHV-8感染相关的卡波西肉瘤和EBV感染相关的伯基特淋巴瘤，这主要是由于免疫缺陷病人再次被这些外来的病毒造成基因激活所导致的，甚至在极其罕见的情况下，也会发生HHV-1感染相关T细胞淋巴瘤。有证据表明，在HIV-1感染相关的T细胞淋巴瘤患者中，病毒已经整合到CD4 T细胞基因组c-fes癌基因的上游，HIV-LTR作为c-fes的增强子元件导致了fes表达的上调。
研究早期，人们认为逆转录病毒整合到宿主基因组并不是一个纯粹的随机事件。目前的研究表明，γ逆转录病毒和慢病毒都优先整合到具有转录活性的基因。HIV-1整合是受许多不同的因素影响的，这些因素包括碱基组成，Alu重复序列和DNase I超敏感位点。HIV-1整合是由慢病毒整合酶的细胞结合的伴侣LEDGF/p75来控制的。已经证明γ逆转录病毒载体优先整合到启动子和CpG岛。关于RV和LV的整合概况得到了更详细的研究，证明整合偏好可以影响基因治疗应用中整合偏好可以影响潜在载体遗传毒性。转导CD34+造血干细胞/祖细胞的多种刺激方法中，最主要的区别可能会影响患者基因的整合。然而，一份转导RV 和LV人类造血干细胞的体内定位研究显示，RV具有更高的几率插入原癌基因，癌症相关的突变位点和调控生长的基因位点，而不是LV。这暗示我们LV整合到人类基因潜在危险区域的倾向较低。通过嵌合载体在体内遗传毒性试验即肿瘤易感小鼠模型得到的结果，也发现了RV和LV的致癌潜能的差异性，这种差异性也可以通过研究RV的优先靶向基因来解释。这份研究也证明了LTRs在整合载体的遗传毒性潜力中起到的决定性作用，也支持了在病毒载体设计中，失活LTRs选择的必要性（见下文）。
因为内在整合位点的选择，HIV-1衍生的LV在导致肿瘤发生发面比RV更具安全性。然而，LV插入具有转录活性的基因仍然是有很高的风险，因为其有可能造成常的抑癌基因杂合性缺失和/或正功能的丧失。此外，邻近的基因组序列的转录激活相关的风险也必须被重视，因为体外研究表明载体的增强子元件在LV的插入转化能力有决定性的作用。因为在临床试验中，使用γ逆转录病毒载体基因转导产生的不良反应有三年的潜伏期，但是HIV衍生的LV的相对安全性并有没有进行长时间的随访，因此需要更多的病人进行治疗和研究。
使用LV两一个需要考虑的不良影响是构建载体对未经修饰的（非目标）细胞或者组织的动员和后续传播。当载体保留其完整的LTR，并且转染过程中有不断包装蛋白提供，那么动员就会发生，这就类似于HIV病毒感染或者其他野生型慢病毒的感染。在体外可以从野生型HIV感染的T细胞系或者人原代淋巴细胞中分离出来。最近通过第一期临床试验发现，在慢性HIV感染患者中，使用LV转染抗HIV-1的基因，也会出现HIV衍生LV的有条件复制造成的短暂动员。在5个病人中有四个人血浆中都检测到了载体RNA的存在。然而，这里应该指出的是这个载体不包含LV研究中常用的增强子敲除SIN LTR区域（见下文）。载体传播是大多数基因治疗应用的一个重要问题，而这个临床试验中出现的载体动员现象有利的证明了载体（抗HIV-1基因转录子）是可以传播到其他T细胞的。然而，虽然野生型HIV感染细胞的范围较小，但是这些发现证明了接收LV基因治疗后感染HIV病人载体动员问题。
3.HIV-1来源的慢病毒载体设计的安全性改进
除了包含所有逆转录病毒所共有的gag、pol和env基因的结构外，HIV-1还包含两个调节基因：病毒复制必不可少的tat和rev， 和四个病毒体外生长以及体内复制致病起关键作用的四个基：vif、vpr，VPU和Nef。综上所述，在慢病毒基因序列两段是在病毒复制和基因转录中起重要作用的LTRs序列（图1）。来自野生型同源物的病毒载体的设计首先要求从编码病毒结构蛋白的序列（由外膜结构提供）中分离出来顺式作用序列引导病毒基因组转移（由转移载体提供）。这种方法构建的LV转染载体包含一个带有内部启动子的表达框，这个启动子可以通过两个病毒LTR控制外源基因的转录。外膜结构特点是在病毒LTR的5’和3’端分别有一个强启动子和多聚腺苷酸化信号。下面介绍进一步提高LV安全性的一些方法：
Fig. (1). （左）带有典型HIV-1衍生载体的HIV前病毒结构图示：野生型 (A)，失活型(B)， 改造的失活型载体 (C)；（右） 典型的HIV-1衍生的衣壳结构：一(D)，二 (E) ，三 (F)代衣壳结构。信封结构与HIV无关，是用于假病毒载体的(E)。
野生型HIV-1（和HIV-2）感染是限制表达CD4受体的细胞（主要是辅助性T细胞）和辅助受体CCR5和CXCR4的结合。第一代LV设计就是水泡性口炎病毒糖蛋白替代天然HIV包膜基因（VSV-G）基因，由于其通过超速离心浓缩提到稳定性，大大拓宽了细胞嗜性（大多数但不是所有的哺乳动物细胞）。即使已经发生了衣壳和转移质粒的重组这个几乎不可能的事情，第一代的LV还是排除了野生型HIV的形成。值得注意的是 ，这个研究发现VSV-G假病毒LV颗粒在人细胞中繁殖时会被血清所抑制。然而，因为RCL的高突变率可以抵抗这种抑制作用，所以在人类血清中RCL的复制能力降低这是不可能发生的。除了对VSV-G假病毒LV的泛嗜性，VSV-G假病毒LV似乎也含有大量的细胞起源的微管泡结构，可以搬运核酸，包括最初用于LV构建的质粒DNA。 因此，基因治疗和研究使用重组LV的时候，以上的特征都需要进一步的验证。
有研究表明，其他病毒糖蛋白也适用于假病毒颗粒。例如：带有小鼠白血病病毒亲嗜性的复制缺陷型LV假病毒也是可以的，因为他们可以通过超速离心和超滤浓缩。尽管他们效率比VSV-G低，但是也已经证明在小鼠模型的临床中安全性增加。
另一种假型化的LV衣壳包括包膜糖蛋白RD114-TR 和GALV-TR的嵌合体，它来自于猫白血病病毒RD114和长臂猿白血病病毒细胞外和跨膜结构域，以及小鼠白血病病毒双嗜性包衣壳（TR）的胞质尾区。带有这些衣壳的LV假病毒也是可以通过离心浓缩。此外，与VSV-G假病毒LV不同，这些载体不能用于转导小鼠胚胎成纤维细胞，通常用于支持未分化状态不同的人类胚胎干细胞。最后，对RD114- TR假病毒LV的转导能力分析表明，它们可能是临为床研究设计安全、高效的基因修改的人类造血干细胞最好的选择。其他慢病毒假型化的例子以及他们之间滴度，病毒粒子稳定性，病毒和宿主细胞的特异性的比较，都已经被Reiser等人进行了研究。
3.2 辅助基因的去除
有一些从衣壳转移的病毒基因对于目的基因的转移并不是必需的，他们主要负责HIV-1病毒的感染的毒力和致病性，比如辅助基因(vif, vpr, vpu and nef)。因此生产的第二代载体又被称为“multiply attenuated”载体（表1）。清除HIV Tat基因可以进一步提高载体的安全性。Tat蛋白是一个具有很强转录激活能力的因子，可以有效地激活HIV病毒的无限复制。Tat不仅影响载体感染的细胞，还可以通过分泌影响临近未感染的细胞。已经证明，胞内Tat蛋白可以改变病毒和细胞基因的表达，包括一些重要的细胞因子，同时也表明胞外Tat也是重要的免疫抑制因子，可以诱导细胞凋亡。最后，有充分的证据证明外源性的Tat是参与AIDS相关疾病的发生的，例如卡波西肉瘤和HIV相关的痴呆症。因为在载体生产过程中，Tat对于载体基因组的有效转运是非常重要的，因此在Tat缺失的情况下，需要一个很强的重组启动子融合到转运载体HIV-LTR的上游，从而保证有充足的RNA来包装和转运。然而，应该指出的是，在最近的生产系统设计中，并不所有的方法都消除TAT基因。
表1 慢病毒生产系统的比较
3.3降低同源重组率
RCL的产生被认为是重叠序列之间发生了同源重组。通过去除非必需基因（如上所述）和将功能性病毒成分分离成单独的表达质粒，制备了第三代包装系统，这将RCL发生的风险降低到最小。通过不同的表达质粒分离的方法，二，三甚至四组同源重组发生的概率明显降低。此外，Tat基因缺失,Rev蛋白的表达由一个独立的非重叠的表达结构完成。通过构建Rev独立密码子优化的gag-pol表达质粒，载体和衣壳的同源区域进一步减少，这样HIV-1也就缺少了5’端非翻译区。提出使用不同质粒分离基因策略研究人员努力设计了新型慢病毒包装系统，不仅使Gag从Pol中分离出来，而且蛋白酶（PR）的表达也是独立的。将两个质粒上的gag-pol重叠结构分开，有效的防止了功能性gag-pol结构的形成，这是载体动员的必要条件。然而，这个方法的缺点是，因为完成所有病毒基因的生产需要的质粒数量较多，生产效率和转染效率将受到极大挑战。
另一个减少同源重组的概率的方法是通过一个病毒的转运载体的交叉包装和另一个病毒载体的机械包装创造一个杂交载体。这种方法的基本原理是，病毒序列之间的差异可能会制重组，但是它们之间的相似性仍有可能导致功能粒子的形成。基于这种方法，使用SIV病毒颗粒或者HIV-1和HIV-杂核体的HIV-1基因组衣壳正在被研究。
3.4 自我灭活型转移载体
另一个可以提高LV安全性的策略是删除位于转移载体的3’LTR U3区的启动子和增强子元件。这种缺失的载体被称为自我灭活型载体，在逆转录过程中，U3缺失区域从3'LTR到5' LTR被复制，因此产生了包含U3修饰的LTRs的整合载体，可以减少启动子的活性（大约为原活性的10%）。这一修饰的实用性被它可以提高大多数LV生物安全性的事实所证明，其承担的风险如下：(1)转运载体和衣壳结构质检的同源重组，（2）LTRs使用时，插入诱变导致癌症的发生，（3）来自HIV-1转导载体之后或者之前感染野生型HIV-1病的靶细胞的载体动员。后两个问题需要更深入的研究。首先，虽然U3区元素删除，可以减少与整合载体基因组附近基因表达增强的风险，但是转基因表达所需的内部增强子和启动子仍然有继续构成的转录激活的风险，因此需要慎重选择。相对于逆转录病毒的启动子，细胞内部的启动子插入激活的能力是比较弱的，使用遗传性或者组织特异性的启动子可以增加其潜在的生物安全性。第二，虽然动员的风险减少了，但研究表明，在SIN载体中动员并没有完全被消除。
3.5 LV效率的改善
目前在LV结构中经常引入额外的元件，不是为了改善载体安全性，而是为了提高转导效率。这些元件主要由以下几种：（1）cPPT可以通过促进慢病毒前整合复合物的翻译以及入核参与载体的整合。（2）WPRE被证明能够提高LV的效价和RVs、 LV的表达，这可能是通过增加mRNA的半衰期，入核以及多腺苷酸化完成的。之前，安全性还会考虑到PRE中X蛋白ORF的存在。然而，现在构建了缺乏X蛋白和他们启动子的PRE变体，我们发现他们仍然能高效的促进转移基因的表达。
上游多聚腺苷酸化增强子元件也被发现可以提高对正确的polyA位点的识别。这些元件的加入可以提高生物安全性，因为通常高达10%的转录子都不能被3’LTR准确终止，这可能导致临近癌基因的翻译。
目前，并没有RCL传代的危险事件出现，随着更安全病毒生产系统的发展，RCL生产的风险被明显的减小了。与RCL形成的低概率相比，LV的出现还需要大量的临床试验证明。在这样情况下，当大量生产时，针对RCL的PCR检测和敏感性检测将被开展，用来正式RCL的缺失。
4. 慢病毒载体生产系统的比较
大多数慢病毒生产系统至少使用三个质粒：一个信封结构，一个或多个编码病毒蛋白Gag a和 Pol的辅助结构和转移载体。第三代LV相比，第一代和第二代载体被认为是不安全的因为它们含有更多的HIV原病毒序列，理论上降低了形成RCL重组事件发生的几率。然而，随着“第三代”载体的发展，最近慢病毒生产系统的设计并没有考虑去除其他的HIV序列和使用自身灭活转移载体。此外，选择从生物安全最合适的LV生产系统不能简单地基于RCL生成概率的定量比较，因为至今没有任何数据证明带有慢病毒RCL形成。因此，最合适的LV生产系统应该是符合安全生产。表1说明了一些LV生产系统的性能。
Lenti-X TM、TranslentiviralTM和Super-split生产系统都会诱导比第三代生产系统更多的HIV基因。虽然优先使用的LV生产系统包含一段很小HIV序列，但是使用非SIN Lenti-X TM系统的RCL产生几率与第三代SIN载体相同或者更低。原因是，Lenti-X TM、TranslentiviralTM和Super-split生产系统至少在两个质粒之间都存在Gag-Pol结构，这就防止了功能性Gag-Pol结构的产生，阻止载体动员。
Lenti-X TM生产系统有两个固有的理论缺陷。首先，与SIN载体比较，lenti-x生产系统实际上具有增加载体动员的可能性的特点。如果野生型病毒感染转导的宿主细胞，随后的TAT蛋白表达可激活慢病毒系统。但是，通过预测宿主细胞相关的野生型病毒以及实施防止它们意外感染的措施，这种风险被大大的减小了。
其次，使用non-SIN慢病毒生产系统的时候，必须考虑由于插入突变引起的转录激活效应的的风险。虽然，HLV的LTR是Tat依赖性的（载体颗粒不包括Tat），但是在Tat缺失的情况下，LTR并没有完全失活。因此，使用non-SIN转染载体比SIN转染载体造成基因激活的风险更高。综上所述，最近的研究显示，LTRS是遗传毒性的主要决定因素，这进一步支持了SIN病毒载体的使用。另一个需要注意的是LTR由于内部启动子驱动外源基因表达所造成的潜在效应。大多数的内部启动子能够有效的支持增强子元件，这些增强子可能抵消转录终止的效力，通常通过天然的慢病毒polyA和土拨鼠肝炎转录后调控元件插入改进或上游多聚腺苷酸化增强子元件。
其他LV设计包括一个整合class I 突变的点突变，其中病毒整合的抑制的而整合其他功能区域不受影响。这种整合缺陷的病毒载体（IDLV）增加了LVDNA环的水平。事实上，这些LV DNA环也在正常慢病毒感染过程中产生，但传统上它们被认为是逆转录酶的终端产物。利用这些游离的DNA环，IDLV成为最新的最有效的基因载体，它能促进线性和环状DNA的高表达。最近，这种整合缺陷载体的游离基因也被当做高效的基因校正模型使用，其可以在人类细胞系和胚胎干细胞之间发生同源重组。
寻找一种方式来改变慢病毒整合形式，研究发现，IDLV可以通过一个非病毒介质或者整合体代替正常的病毒整合从而达到定点整合的目的，例如酵母重组酶Flp。通过整合酶缺失的LV将目的基因插入预定的插入位点可以减少插入突变的几率，是未来应用的主要方式。然而，这种方式还有一个缺点，就是通过非典型的整合机制，一小部分不受控制的LVDNA环整合还是会发生。IDLV与基因表达还需要进行长时间的观察，并不仅仅是因为他们非典型的整合。最近提出了一个可以代替这种倾向转录激活基因的天然整合的策略，构建一个IDLV和可编码SB转座子的非病毒SB转座子载体的杂合载体系统。
5. LV使用风险评估
除了需要识别LV本身固有的危害外，还需要对载体使用过程中的风险进行彻底的评估。典型的实验室操作规程包括：（1）操作和处理LV转染细胞实验室，（2）LV悬浮处理，（3）体内实验，包括接种LV悬浮液或者LV转染细胞的实验动物，（4）载体的制备。必须确定每一个过程中暴露的风险，特别注意的是体内试验或在非确定是否存在内源性逆转录病毒学列的细胞培养中，对于宿主的意外污染。
5.1 处理LV转染的细胞实验室
如果没有合适的培养条件，动物细胞的生存期都是有限的。因此，转染细胞体外操作最主要的生物危害就是实验室工作和意外接种的可能性。在细胞基因族中LV的整合，这可能有插入突变或转录的邻近基因以及外源基因稳定表达的风险，有可能促进细胞生命周期延长，增加肿瘤形成的风险，以及其他有害的影响。然而，在宿主生物体中，LV转导细胞接种这些假定的有害影响的真实程度是很难预测的。转导的细胞和宿主生物之间的组织相容性不匹配仍然是它们生存和扩张的主要障碍，因为在非免疫缺陷的宿主内他们通过免疫反应排斥转导细胞的识别和破坏。这也是为什么严格控制那些个人实验室培养细胞的主要原因之一。
5.2 LV的悬浮处理
LV悬浮液的处理，尤其是高浓度，提高实验室工作人员意外感染的可能性，因此被认为是与高风险相关的活动。主要的潜在危险是研究人员通过注射耗材接种（如针头）感染，因为偶然感染后后，LV可能会整合到受感染的宿主细胞基因组中。这不仅能产生基因插入激活或者转录激活的危害，也可能导致转染基因的永久表达，产生有害的基因产物。尽管转基因的风险不在本次审查中涉及，但它们仍然是需要认真考虑的一个重要因素。特定类别的基因，包括癌基因、细胞因子的编码基因和病毒基因，本质上就是具有高风险的。由LV引入的介导基因沉默的shRNA也可以敲出抑癌基因。鉴于潜在的转基因或sh-RNA种类繁多，LV携带转基因风险评估仍然是个别案例个别处理的方法，需要进行更仔细的分析。
5.3 体内试验
当意外或者特意感染LV的宿主，载体序列和宿主体内存在的野生型病毒的衍生序列仍然存在着重组的理论风险，这可能会产生不良的影响。例如，在动物模型体内试验发现，在长臂猿白血病病毒-MLV衍生的逆转录病毒载体和牛白血病病毒（一种复杂的感染白血病的牛和羊逆转录病毒）之间的重组有直接的危害。
在小鼠模型中使用HIV衍生的LV可以避免潜在的野生型啮齿类病毒的风险，防止HIV感染。此外，一些研究证明在宿主系统中γ-逆转录病毒的存在几乎没有不利的影响。γ-逆转录病毒和慢病毒之间的交叉包装还没有在培养的细胞中发现，甚至在携带HIV病毒基因组的转基因小鼠中的每个细胞中也没有发现，对组织进行Southern blot分析也没有检测到自由的HIV前病毒序列的存在。在体内异种移植系统产生有复制能力的慢病毒的潜力也被调查。通过对慢病毒转染人造血干祖细胞移植的149只免疫缺陷小鼠进行风险评估发现，两只之间没有明显的相关性，并且通过几个月的观察，也没有在他们的血清中检测到HIVp24抗原。然而，尽管这些“令人放心”的发现，作者强调，与这种有限的小鼠研究相比，进行长时间体内评估是必要的。
特别要注意的是当宿主被慢病毒感染的时候，因为这将增加慢病毒载体动员或者互补的风险，从而增加RCL形成的潜在可能。如前所述，在使用LV的第一个临床试验结果显示，在慢性HIV感染的病人中存在慢病毒载体序列的动员。另一个问题就是那些经过基因治疗获得HIV感染的病人中LV的动员。
5.4 内源性逆转录病毒序列
用于载体制备和携带LV的特异性靶向细胞的包装细胞系可能会引起宿主细胞中或者包装细胞中存在的内源性逆转录病毒序列的相互作用。ERV是古老种系中外源性逆转录病毒整合到基因组上残留下来的。有些可能通过逆转录转座子已经进入宿主的基因组中。通过各种机制如重组和转录激活，一些ERV可以和外源性的逆转录病毒相互作用这已经被证明了，外源性的逆转录病毒就包括了逆转录病毒载体。在逆转录病毒载体介导的反式作用蛋白也能导致其他非内源性逆转录病毒动员，或ERVS包装会导致不必要的序列转移到靶细胞，与逆转录病毒载体或者细胞内基因组发生重组。同样，LV在临床试验中使用也需要考虑人类内源性逆转录病毒的存在的相关潜在风险。HERVs使人类内源性序列与病毒载体之间的重组的理论性可能高达8%。
通过体外研究小鼠白血病病毒（MLV）在载体颗粒中HERVs的掺入暗示因为MLV包装机制，还存在着HERVs的无意识别和包装。从最近的一项研究表明，HIV-1衍生的LV系统与HERV序列包装程度小于MLV系统。这个作者对这一现象进行了部分解释，在人类基因组中不存在逆转录病毒相关HERVs，但是却存在着相当数量的MLV相关的HERVs序列。不过，在易感细胞被HIV感染后，一些HERVs是存在被HIV Rev识别的序列的，这样才能促进HERV复制子的出核。此外，在HIV-1感染的患者血浆中检测到了HERVs的RNA，这个结果支持了重要蛋白对内源性逆转录病毒依然存在编码能力和激活潜力这一观点。HERVs包装的HIV与释放HIV RNA的比例仍然是不清楚的，但是不同形式的细胞应激可以诱导HERVs非特异性表达这是公认的。然而，最近的研究表明，HERVs是功能性慢病毒序列与HIV衍生LV重组的原因，这是需要我们解决的。
目前对于人类基因治疗建立一个LV安全生产系统还太早。一些LV的临床试验还在进行，还需要进一步随访观察产生的不良影响。自从第一次使用LV靶向人类T淋巴细胞进行HIV感染（例如，抗HIV RNAs的表达）或者癌症的治疗以来，最近LV介导的基因治疗已经发展到靶向自体CD34+造血干细胞/祖细胞，以进行脱髓鞘疾病治疗，这些疾病包括肾上腺脑白质营养不良血红蛋白病或者干细胞缺陷如镰状细胞性贫血，地中海贫血或威-奥德里奇综合征。这些临床试验的结果将会给我们提供更多关于LV临床适用性和安全性的有价值的信息。
6. 安全性建议
目前，并没有针对LV安全操作和操作生物制剂的国际指导方针和建议。对逆转录病毒载体的风险评估给予了更多的关注，强调应根据个案分析确定可实施的控制措施。一些指南提供LV使用的几点建议。例如，英国健康与安全执行提出涉及缺陷病毒的活性可分为1类：限制活性（即不太可能感染人类细胞）和低概率的RCL传代（如第三代亲嗜性逆转录病毒）在德国，带有信封结构的LV（即只感染小鼠细胞是受到BSL-1条款控制的，VSV-G假LV的生产和转导是必须按照BSL-2规程来处理的，除非这些细胞已经被淘汰或者清洗两次，确保RCL没有活性。据比利时规定，HIV-1来源的LV的生产和使用至少应在2级生物安全实验室（BSL-2）进行。如果需要大量使用或者转基因序列编码潜在的有害基因产物则必须使用BSL-3。这些建议不考虑LV设计的特性，如3’LTR的U3缺失（SIN转录载体），生产中质粒的数量或者HIV辅助基因的存在。因此，这些新的特点值得我们仔细分析，特别是HIV衍生载体已经在LV设计和安全性方面取得了巨大的进步。
表2概述了具体阐述LV使用的最新建议和指南。这个关于已建立的指南之间的比较说明并不是明确的，是受到几个因素制约的。首先，在安全级别的确定中，LV的设计特征被认为是非常重要的。例如：法国Commission de Génie Génétique 对于缺乏调节蛋白Vpr, Vpu, Vif 和Nef的SIN转导载体的LV要求并不是很严格，因此LV的生产系统使用至少需要三个质粒。在荷兰，COGEM建议对于SIN第三代LV的使用措施要更加严格，因为其缺乏调节蛋白，生产需要至少4个质粒。阻碍这些建议比较的另一个因素是他们缺乏对基础设施最低要求的一致性。以英国ACGM指南为例，指出控制实验室工作人员接触载体的具体措施是必须的（如手套，生物安全柜，限制人员），因此被限定为风险等级2。
总的说来，指南推荐BSL-2级别，尤其对于锋利的工具。我们认为在大多数复制缺陷的LV的生产和处理过程中BSL-2措施已经足够了，除非超大容量（NIH规定产物体积＞10L）或者转基因自身的额外风险。表3描述了在BSL-2标准下LV生产需要的工作规程和安全设备。这些建议的主要关注的是预防生物风险和意外污染后采取适当措施的重要性。在这方面，目前的对于管理HIV污染的指导方针主要依赖于抗病毒药物的使用。理想情况下，建议在刺伤后一个小时内进项预防感染的措施，从而减少HIV阳性的风险。抗病毒药物如AZT可以有效的抑制病毒的逆转录酶发生作用，从而抑制病毒RNA逆转录为DNA，因此建议实施HIV衍生LV的预防措施，以尽量减少使用有害转基因时与无意转导相关的生物危害。预防措施必须由职业医生来进行，因为抗逆转录病毒药物的耐受性通常不好，因此，必须根据感染的严重性和表达转基因的生物危险来确定是否需要治疗。
当转染可复制LV的细胞系的处理受到限制时，要求BSL-2实验室可能是有问题的。人们普遍认为有缺陷的LV，其产生RCL概率是可以忽略不计的，对于转染细胞几乎没有任何额外的风险。根据所使用哺乳动物的内在特性所造成的相关风险，要求使用BSL-2安全设备。以比利时为例，对于含有病原体和/或使用转基因生物区域立法，建议灵长类动物或人类起源的原代细胞的处理，不论是否进行LV的转导，都需要BSL-2。另外，已经证明没有病原体污染的细胞系可以使用BSL-1处理，但是如果细胞系来源于人类或者灵长类动物，还是需要BSC Ⅱ。表4列出类一些关于可以使用BSL-1进行处理的LV转染细胞的条件。这个列表主要是根据COGEM对于在BSL-1设备处理转导哺乳动物细胞的建议来制定的。这些指导方针更侧重于减少细胞转导后慢病毒颗粒的存在的可能性。对于HIV衍生的LV，这种减少可以通过用培养基洗涤转导的细胞来实现，通过胰蛋白酶，人血清或者因为病毒半衰期为37℃10h增加孵育时间处理转染细胞可以灭活LV。也有数据表明，树突状细胞和单核细胞来源的巨噬细胞可以吞噬HIV从而使其保持感染形态长达数月。因此，单纯的增加洗涤次数和延长孵育时间并不能完全清除病毒颗粒，这仍然需要一段较长时间的处理。所以，转染的树突状细胞和巨噬细胞应在BSL-2进行处理。
表2 对慢病毒载体的操作生物安全的建议和指导方针
在表4中列出的条件下进行的LV转导细胞的风险仅仅符合最低的控制水平（BSL-1）。但是，应该强调的是，在大多数实验室细胞培养中，良好的实验室规程，微生物操作规程（包括限制人员）和BSC使用规程是常用的标准操作程序。这样做的另一个好处就是如果需要升级成为BSL-2设备，只需要增加简单的安全设施即可。
表3 在BSL-2下操作LV的具体工作规程和安全设备
如果进行LV操作，实验室至少需要一个二级生物安全柜。它可以避免工作区内污染空气的流通。生物安全柜的位置要原理门、窗、供应室、排风百叶窗和复杂的实验室区域。不管是放置的时候还是每次移动后都要进行检测，每年至少一次。
直接接触或者可能会造成皮肤接触时，工作人员必须佩带一次性手套。
在操作搓成中佩带面具、眼睛保护罩或者面罩，防止产生飞溅或者气溶胶。
尽量避免使用针头或者其他尖锐的耗材。如果必须使用，这些器具必须谨慎使用防止或者减少皮肤刺伤的风险。
所有可能产生感染性气溶胶或者具有潜在风险的操作都必须在二级生物安全柜中进行。
禁止在同一个二级生物安全柜中同时操作具有复制能力的病毒或者其他载体系统。
禁止使用水平气流箱来操作病原体和/或基因修饰（微）生物体。
工作结束或者任何生物材料泄露后，都要对工作台面进行清洗和使用消毒剂进行消毒。对表面LV进行灭活的合适的消毒剂有1%次氯酸钠、2%碱性戊二醛或70%乙醇。
针对消毒剂的使用情况对工作人员进行培训。主要包括消毒剂的用途、说明书、种类、浓度和接触时间。
将可能造成实验室事故的行为张贴在实验室中。建立污染后的预防处理方案，并尽快在职业医生的指导下完成。
在设备中传输LV或者LV转染细胞必须进行二次包装。二次包装主要是方式容器泄露，这样在正常的运输条件下，它是牢不可破的。
根据联合国制定的有关危险品运输的要求，LV和LV转染细胞外部运输必须要进行三次包装。
表4 在BSL-1下操作LV转染细胞的条件
没有原代培养细胞的灵长类动物或人类的起源。
没有需要BSL-2的细胞系。
没有吞噬感染HIV的树突状细胞。
没有病原体污染的风险。特别是，宿主细胞应无HIV-1，HIV-2，人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1），HTLV-2，SIV或其他相关的与宿主细胞亲和性高的慢病毒。
转染复制缺陷LV粒子的细胞由以下系统之一生产：
VSV-G假HIV衍生系统，载体包装3个质粒（见第三代生产系统），转移载体没有U3 3'LTR（SIN载体）
VSV-G假HIV衍生系统，载体包装多余于3个质粒。
假HIV衍生系统，不能感染人类细胞，载体包装3个质粒。
复制缺陷LV颗粒不含有转基因，或者转基因产物不会对转染细胞产生额外的伤害，影响人类健康和环境。
在同一BSC中，处理具有复制能力载体或者其他载体系统后至少30分钟才可以进行细胞的转染。
在BSC进行细胞转导过程中，避免了同时操作有复制能力的病毒或其他载体系统。每一项涉及病毒使用的操作后，BSC都需要进行准确的清洗，并选用适当的消毒剂进行消毒。
转染后减少游离慢病毒颗粒存在的具体措施。如：1，使用培养基清洗。2，使用胰蛋白酶或者人血清处理转染细胞灭活游离的LV颗粒。3，增长细胞在37℃培养的时间。
与转染细胞接触的工作台面和仪器都要使用适当的消毒剂处理。如1%的次氯酸钠，2%碱性戊二醛、70%乙醇。
人们对LV和LV转染细胞感染动物的体内试验进行了研究。注射LV转染细胞的动物在满足表4的BSL-1中处理，但是直接接触LV病毒还需要更仔细。NIH、COGEM和 ACGM的重组体DNA咨询委员会全部建议那些没有允许病毒感染的动物需要BSL-2，初次处理LV可以使用BSC（表2）。考虑到动物接种带来的危害，必须特别注意使用尖锐器具可能发生的事故。在生物安全柜中无法进行的病毒注射（如立体定向注射）必须在BSL-2条件下进行，包括手套、护目镜，外科口罩等，减少黏膜暴露的可能性。接种位点应该彻底清洗。注射IV不支持HIV感染的动物被发现有一个微不足道的RCL复制概率（如使用SIN第三代载体），可以在BSL-1中保持1-7天。
之前采用的LV处理动物的指导方针仅仅是根据病毒体外的半衰期（在37℃培养基中，VSV-G假LV的半衰期为10-24小时）。因此，注射106活性粒子的动物需要在BSL-2中待至少21天，假设最坏的情况下的病毒的半衰期将类似于在体外条件下。最近开始了针对大鼠进行颅内和静脉注射高剂量LV制剂的实验（分别为转染单位 TU ＞106和107/剂量）。p24 ELISA和使用细胞系功能性TUs滴定实验发现，注射20分钟后，在培养集中的p24降低到50%，两个小时后已经检测不到了。在同一时期内，在血清和尿液中也没有发现任何功能性的TUs。在第二个实验室也获得了类似的数据。根据以上实验数据和考虑到可进行病毒复制的啮齿类动物，我们提出了一套实施方案，用于转染第三代SIN载体的啮齿类动物的接种和管理。
一些建议是根据在一个可接受的低剂量水平p24 ELISA阴性结果来制定的。然而RCL的相关性还是值得商榷的。一些说明在HIV衍生LV生产中RCL传代的结果表明，当使用载体的传代很慢的时候可以合理地假定它们的频率非常低。因此，除了用于临床或者在合理的安全措施下制作的LV颗粒，RCL检测是没有任何价值的，因为它们的频率大大低于目前可用的最敏感测试的检测阈值。RCL检测可能增加风险（与检测材料相比），因为每个检测都需要适当的阳性控制。RCL测试应该在一个具有专业技能的BSL-2实验室中完成。
一般来说，那些在BSL-2实验室所需的实施附加安全措施应该考虑LV污染风险的增加（包括RCL传代的增加）和转基因相关风险的识别。
污染增加可能是由于处理大量的载体颗粒-高容量和/或高滴度-或来自容易慢病毒感染的实验室实验室动物引起的。多数指南要求接种人类细胞进行HIV复制的动物需要高度严格控制，例如SCID小鼠和缺失限制HIV-1的TRIM5的mamu7纯合子动物。处理第一代LV也可能需要执行附加措施因为这些载体被认为是不安全的，RCL的概率是不可以忽略不计的。
LV被广泛用作基因转移载体，部分原因是它们具有稳定的转基因表达。因此，对LV的全面风险评估也应考虑到这些载体所传递的转基因产品的风险。基因产物可能是本质有害的（例如毒性特性），或者通过他的表达可能导致危险性，转导的细胞调控表达主要是依赖于基因组整合位点，启动子活性和调控序列表达。不管是否使用LV，转基因的风险评估都不那么简单。因为这一问题比本文的论述更值得探讨，我们建议，感兴趣的读者可以参考专门针对这个主题的文献。
7. 非人类的慢病毒
非人类的慢病毒不能感染人类细胞。然而，这种限制是可以通过假病毒颗粒和/或改变病毒的启动子序列来克服的，这就导致了非人类慢病毒LV的发展。例如从不同的猴子种系得到的猴免疫缺陷病毒（SIV），猫免疫缺陷病毒（FIV），马传染性贫血病毒（EIAV），山羊关节炎/脑炎病毒（CAEV）和牛JD病毒。在人类细胞中，非人的LV的适宜性和有效性取决于LTR使人类细胞稳定表达转基因的能力和允许在人类细胞生产病毒颗粒。对于人类感染非人灵长类动物和非灵长类动物的LV的后果是未知的，因此，安全问题仍然存在，特别是任何动员，重组嵌合慢病毒的同阶层和跨物种的传播。值得注意的是，目前使用EIAV对帕金森病人进行的基因治疗的已经到了I / II期试验。
一般情况下，BSL-1适用于风险1组生物。然而，带有外源信封结构的复制缺陷型载体（VSV-G）的包装需要BSL-2，因为它们增加了转导人类细胞的能力和插入突变的风险。
表5 接种第三代SIN载体的啮齿动物和后续培养条件
接种在生物安全柜防护条件下进行。应穿戴适当的个人防护装备，包括双层手套和防护服。动物最好是麻醉的或佩带抗穿刺的手套。
使用更安全的专用设计针头或注射系统。
放回动物关在笼子前，病变/注射部位用70%乙醇消毒。
所有工作台面都要使用适当的消毒剂处理。如1%的次氯酸钠，2%碱性戊二醛、70%乙醇。
接种后最少72小时，注射的动物保持在BSL-2坏境下（独立通风笼（IVC）或过滤器上的笼子里），或者BSL-1坏境下（独立通风笼（IVC））。只有在生物安全柜里才能打开笼子。动物需要在生物安全柜中转移到新的笼子里面，不能太早转移，至少接种后三天才可以转移。
在接种后的第一个72h，废弃物如笼子、粪便和尿液都需要灭活处理。
第一次接种后24h内，动物不允许离开笼子（在BSL-2环境下的有过滤器上笼）。一天之后，动物被允许离开笼子用于实验（如成像技术）以确定p24检测数据是否是阴性。接触台面用70%乙醇清洗。
72h后，小鼠可以转移到BSL-1坏境下，p24检测也不在强制进行。应禁止接种动物与其他实验动物直接接触。废弃物，如笼子，粪便和尿液，在处理前也不需要灭活。
应对工作人员进行适当的培训和指导。应制定一套标准作业程序，所有工作人员都应使用该准备作业程序。
研究室中LV操作的主要风险在于实验室人员的无意传播。在转导，操作者可能接触到来自转基因插入突变或激活邻近的基因导致的载体整合或产生有复制能力的病毒的潜在的有害影响。在这方面，潜在有害转基因的效应值得特别关注，因为LV能够使这些转基因在分裂和不分裂细胞中稳定地表达。
来源于HIV-1的LV可能会引起生物安全的关注，因为其亲代病毒致病性是众所周知的。然而，为了改善这些LV的生物安全，人们作出了很大的努力。除了通过去除辅助基因减少或消除HIV-1致病性外，更加安全的LV已经被开发出来。通过在分离的表达质粒上分离病毒序列并在转移载体本身中删除启动子和增强子元件，从而减少同源重组和动员整合载体的可能性。LV整合到基因组上的这一固有特性也促使研究人员开发一种整合酶缺陷的LV。
最近开发的HIV-1衍生的LV具有足够的安全特性，可作为临床试验的基因转移载体。此外，RCL传代概率问题的解决是重要的，无论是在载体生产过程中还是实验室动物实验过程中，目前并没有RCL传代的情况被报道出来。然而，进一步开发更安全的LV，必须重新考虑这些风险和采取适当的限制措施。
安全要求的建议不能推广到所有情况，因此需要在逐案基础上建立，特别是关于转基因选择。这是研究了大多数常用的LV研究成果提供了建议。然而，我们也强调控制措施的重要性，其目标是尽量减少直接暴露于LV，从而防止研究人员的无意传播。
参考文献：
Pauwels K, Gijsbers R, Toelen J, Schambach A, Willard-Gallo K, Verheust C, Debyser Z, Herman P.State-of-the-art lentiviral vectors for research use: risk assessment and biosafety recommendations.Curr Gene Ther. ):459-74.
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