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呕吐物 微生物检验
您查询的关键词是：呕吐物微生物检验微生物学检验实验指导 2009.7 一,《微生物学检验》实验目的要求 1.通过实验验证理论知识,并掌握比较全面的微生物学基本操作技术. 2.在微生物学实验过程中建立无菌观念,掌握无菌操作技术. 3.通过实验进一步掌握临床常见病原微生物的生物学性状,分离培养和 鉴定的方法,各种临床标本的微生物学检验程序和方法. 4.在实验过程中逐渐培养独立思考问题,分析问题和解决问题的能力. 二,微生物学实验室规则及实验室意外处理方法 1.微生物学实验室规则 由于微生物学实验是以病原微生物为研究对象,在实验过程中任何疏忽 大意都有可能引起实验人员的自身感染或实验室和周围环境的污染.因 此,实验中应严格遵守实验规则,建立无菌观念,严格无菌操作,防止实 验过程中出现意外情况,并确保实验结果的准确. (1)试验前须预习实验内容,了解实验目的,方法和注意事项,做到心中 有数,避免发生错误,提高实验效率. (2)进入实验室必须穿工作服,必要时还须戴口罩,帽子和手套,并做好 实验前的各项准备工作. (3)非必需物品禁止带入实验室,带入实验室的物品应远离操作区,放在 指定的区域.(4)实验室内不准大声喧哗,嬉戏,应保持实验室的安静,整洁和有序.不 准在实验室内吸烟,饮水和进食,尽量避免用手触摸头,面部,防止感染, 尽量减少室内活动,以免引起风动. (5)实验中注意节约试剂,爱护仪器,避免有菌材料的污染,如有传染性 材料污染桌面,地面,手,衣服或发生其他意外情况,应立即报告老师及 时作适当处理. (6)用过的污染物品应放到指定的地点,经专人消毒灭菌之后再进行清 洗,切勿乱丢或冲入水池中.禁止将本实验室的物品带出实验室外.需送 温箱培养的物品,应标记清楚后送到指定地点. (7)实验完毕后应将桌面整理清洁,试剂,仪器放回原处,并用浸有消毒 液的抹布将操作台擦拭干净,打扫卫生,关好水,电,门窗. (8)离室前脱下工作服,反折放在指定的地方;双手在2%来苏液中浸泡 5min 左右,再用肥皂,清水洗净,方可离开实验室. 2.实验室意外的紧急处理方法 (1)发生皮肤破损或刺伤:首先用肥皂和水冲洗伤口,尽量挤出损伤处的 血液,并用70%乙醇或其他皮肤消毒剂进行消毒,立即进行医疗处理. (2)化学药品腐蚀伤:若为强酸,用大量清水冲洗后再以5%碳酸氢钠溶液 中和;若为强碱,用大量清水冲洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和;若受 伤处是眼部,经上述方法处理后,再滴入橄榄油或液体石蜡1~2滴. (3)烧伤:局部涂凡士林,5%鞣酸或2%苦味酸. (4)菌液误入口中:立即将菌液吐入消毒容器中,再用1:1000高锰酸钾或 3%过氧化氢漱口,根据菌种服用适当抗生素预防感染.(5)菌液污染环境:将适量2~3%来苏或0.1%新洁尔灭浸泡污染面半小时 后除去,如手上有菌污染,也可浸泡于上述消毒液中3~5min,之后用肥皂 和清水洗净. 三,生物安全防护知识简介 医学检验工作人员长期接触有潜在传染性的血液,粪便,体液等标本,这 些标本往往是各种细菌,病毒等病原微生物的传播载体,无论是实验人 员感染,还是造成实验室和周围环境的污染,都将导致严重的后果.因此 实验室工作人员在实验过程中必须高度重视实验室生物安全防护,强化 生物安全意识,熟悉生物安全防护有关知识,严格无菌操作. 1.微生物的分类等级 根据世界卫生组织(WHO)出版的《实验室生物安全手册》,将微生物分为 四个不同危险度等级:危险度1级是指不能引起人或动物致病的微生物, 此类微生物无或仅具有极低的个体和群体危险;危险度2级的病原体具 有中度个体危险,低度群体危险,能引起人或动物致病,但对实验室工作 人员,社区,家畜或环境不易导致严重危害,所引起的感染具有有效的预 防和治疗措施,并且疾病传播的危险有限;危险度3级的病原体具有高度 个体危险,低度群体危险,通常能引起人或动物的严重疾病,但一般不会 发生感染的播散,并且对感染具有有效的预防和治疗措施;危险度4级的 病原体具有高度的个体危险和群体危险,通常能引起人或生物的严重疾 病,并且很容易发生个体之间的直接或间接传播,对感染一般没有有效 的预防和治疗措施. 基于以上划分标准,结合微生物的致病性,传播方式,目前所具有的预防和治疗措施等因素,我国卫生部于2006年制定了《人间传染的病原微生 物名录》,对各种病原微生物的危害程度及其相关实验活动需要达到的 生物安全实验室级别做了详细分类,各实验室进行有关实验均需参照此 标准. 2.生物安全实验室分级与要求 由于各种病原微生物的危险度等级不同,因此实验室必须达到相应的生 物防护等级才能开展有关实验.根据 WHO 《实验室生物安全手册》 和我国 卫生部2002年颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》, 实验室从生物安全防护的角度共分为四级:一级生物安全防护实验室 (BSL-1)为实验室结构设施,安全操作规程,安全设备适用于危险度1级 的微生物,依据标准操作程序可进行开放性操作,如用于教学的普通微 生物实验室即属此类.二级生物安全防护实验室(BSL-2)适用于对人或 环境具有中等潜在危害的微生物,即危险度2级的病原体,该级别实验室 应具备生物安全柜和密封的离心管,以免发生泄漏和产生气溶胶.三级 生物安全防护实验室(BSL-3)适用于有明显危害,可以通过空气传播的 病原微生物(如结核杆菌,伯氏立克次体等),通常已有预防传染的疫苗, 该级别实验室除了有严格的一级和二级安全设施要求外,还需具备合适 的空气净化系统.四级生物安全防护实验室(BSL-4)适用于对人体具有 高度的危险性,通过气溶胶途径传播或传播途径不明,目前尚无有效的 疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素.BSL-4实验室必须与其他实验 室隔离,并具备特殊的空气和废物处理系统,实验操作须在Ⅲ级生物安 全柜内或全身穿戴特制的正压防护服.根据以上定义,医院内的临床实验室因接触可能含有致病微生物的标本, 通常应达到二级生物安全防护实验室要求.根据《实验室生物安全认可 准则》,二级生物安全实验室结构设施需符合以下几点:(1)实验室需具 有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计,有可开启的窗户,有纱窗,实验 室门有可视窗带锁并能自动关闭.(2)每个实验室均应设置洗手池,宜设 置在靠近出口处.(3)实验室工作区域外有足够的存储空间及摆放个人 衣物的设施.(4)实验室内墙壁,地面应平整,防滑,易于清洁,不适宜用 地毯.(5)实验台面应能防水,耐腐蚀,耐热.(6)实验室内应保证工作照 明,避免反光和强光.(7)在实验室内应穿戴隔离衣,帽,手套,必要时戴 防护眼镜.实验室应备有生物安全柜.(8)有适当的消毒设施,如高压蒸 汽灭菌器,并设置洗眼装置,应急喷淋装置,急救药箱,灭火器等.(9)有 可靠的电力供应和应急照明.(10)在实验室出口处设有在黑暗中可明确 辨认方向,通道的标识.(11)在实验室入口处和装有传染性物质的设备 表面贴有生物危险标志. 3.实验室生物安全管理制度 实验室生物安全制度建设对于临床实验室而言是生物安全防护的核心, 实验室生物安全管理制度应包括:实验室准入制度,生物安全培训制度, 生物安全责任制和责任追究制度,生物防护与安全制度,安全检查制度, 个人防护制度,实验室管理制度,清洁消毒制度,安全计划审核制度,废 弃物处理制度,事故报告制度,生物安全防护应急预案,标准操作程序等. 建立健全了各项生物安全制度,还应成立生物安全管理领导小组,加强 生物安全制度实施情况的监督管理,实验室入口处须粘贴生物安全标志,注明危险因素,生物安全级别,负责人姓名和电话,进入实验室的特殊要 求及离开程序,禁止非工作人员进入实验室,如需参观实验室等特殊行 为需经实验室负责人的批准后方可进入. 4.实验室常见生物危险 实验室生物污染的途径包括:空气传播(临床标本中的污染源在空气中 传播,微生物气溶胶的吸入),直接传播(工作中偶然刺伤,割伤,碎玻璃 划伤直接感染),皮肤粘膜接触(临床标本中的传染源通过破损皮肤粘膜 接触造成的感染),其他不明原因的实验室相关感染. 实验室伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误、 不良实验技术 以及仪器使用不当造成的.因此,实验室人员必须提高生物安全意识,认 真学习生物安全相关的各种法规和文件,定期进行生物安全防护知识培 训,熟悉生物防护有关知识,加强基本技能的培养,严格执行操作规程. 实验室管理者应对实验室的风险级别进行分析,尤其对风险级别较高的, 接触高危标本几率较大的区域如微生物和分子生物学室予以高度重视, 保护实验室工作人员和环境的安全. 5.生物废弃材料的管理 实验室内所有用过的样本,培养物及其他生物性材料等废弃物,严禁未 经处理就随意丢弃,应置于贴有生物危害标志的专用废弃物处理容器内, 注意容器的充满量不能超过其设计容量,利器(如针头,小刀,玻璃等)应 置于耐扎锐器盒内,在去污染或最终处置前应存放在指定的安全地方, 经过高压灭菌或其他无害化处理后再安全运出实验室;有害气体,气溶 胶,污水,废液等均需经无害化处理后排放;动物尸体,组织的处置和焚化应符合国家相关要求.处理危险废弃物的人员需经过专业培训,并使 用适当的防护设备. 第一章 微生物学检验基本技术 实验一 细菌的形态结构观察及显微镜油镜的使用 【目的和要求】 1.熟悉微生物实验室规则并自觉遵守. 2.掌握细菌基本形态和特殊结构的观察方法. 3.掌握光学显微镜油镜的使用和维护方法,了解荧光显微镜和暗视野显 微镜的构造和使用方法. 【试剂与器材】 1.示教片:各种球菌,杆菌,弧菌,荚膜,鞭毛,芽胞的示教片. 2.器材及其他:光学显微镜,载玻片,擦镜纸,香柏油,脱油剂等. 【实验内容】 一,细菌基本形态和特殊构造的观察 1.细菌的基本形态(各种球菌,杆菌,弧菌等) 观察要点:注意细菌的染色性,相对大小,形状及排列方式. 2.特殊结构的观察(荚膜,芽胞,鞭毛) 观察要点:注意这些特殊结构的大小,形状及其在菌体中的位置,均有助 于细菌的鉴定. 二,光学显微镜油镜的使用 1.光学显微镜的构造 光学显微镜是观察细菌形态最常用的一种仪器,其构造分为机械部分和光学部分,机械部分包括:镜座,镜臂,载物台,镜筒,镜头转换器,调焦装 置等;光学部分包括:接物镜,接目镜,反光镜,聚光器,光圈等(见图1-1). 图1-1 光学显微镜的构造 显微镜的接物镜有低倍镜,高倍镜,油镜三种,放大倍数依次增高,其识 别方法为: (1)低倍镜:镜头标志为10?或10/0.25,镜头最短,其上常刻有黄色环圈. (2)高倍镜:镜头标志为40?或40/0.65,镜头较长,其上常刻有蓝色环圈. (3)油镜:镜头标志为100?或 100/1.30,镜头最长,其上常刻有白色环 圈,或&oil&字样. 2.油镜的使用原理 图1-2 显微镜油镜的使用原理 油镜的放大倍数高而透镜很小,自标本片透过的光线,因玻片和空气的 折光率不同(玻璃 n=1.52,空气 n=1.0),部分光线经载玻片进入空气后发 生折射,不能进入接物镜,致使射入光线较少,物象不清晰.在油镜和载 玻片之间滴加和玻璃折光率相近的香柏油(n=1.515),则使进入油镜的 光线增多,视野光亮度增强,物象清晰(见图1-2). 3.使用方法 (1)采光:使用显微镜时必须端坐,将显微镜放在胸前适当位置.将低倍 镜转到中央并对准下面的聚光器,打开光圈,转动反光镜,使光线集中于 聚光器(以灯光为光源时,使用凹面反光镜,以自然光为光源时用平面反 光镜).根据所观察的标本,通过升降聚光器和缩放光圈以获得最佳光度. 当用低倍镜或高倍镜观察时,应适当缩小光圈,下降聚光器;当用油镜观察时,光线宜强,应把光圈完全打开,并将聚光器上升到最高位置. (2)低倍镜调焦:将欲观察的标本置载物台上,用弹簧夹和推进器固定, 将待检部位移至视野正中央,上升载物台至不能升高为止.用左眼观察 接目镜,缓慢调节粗调节器,使载物台下降,待看到模糊的图像时,再调 节细调节器,直至看到清晰的图像为止. (3)油镜的使用:低倍镜找到物象并调至清晰之后,转开物镜头,在玻片 的标本上滴加1滴香柏油,将油镜头转换至中央,缓慢调节粗调节器,使 镜头浸入油中,当油镜头几乎接触玻片时停止转动(从侧面观察),边观 察接目镜边轻轻转动粗调节器(此时只能上升镜头,不能下降,防止压坏 玻片及损坏物镜),待看到模糊物象时改调细调节器,直至找到清晰物象. 镜检时应将标本按一定方向呈&弓&形移动,直至整个标本观察完毕,以 防漏检.观察时应将两只眼睛同时睁开,左眼观察,右眼用于绘图或记录. 标本观察完毕后,先将物镜头移开,再转动粗调节器使载物台下降,取下 载玻片,立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净. 4.注意事项 (1)显微镜是精密光学仪器,在搬放时应右手紧握镜臂,左手稳托镜座, 平端在胸前,轻拿轻放. (2)显微镜放到实验台上时,先放镜座的一端,再将镜座全部放稳,切不 可使镜座全面同时与台面接触,这样震动过大,透镜和微调节器的装置 易损坏. (3)避免强酸,强碱,氯仿,乙醚,酒精等化学药品与显微镜接触,避免日 光直射,显微镜须经常保持清洁,勿使油污和灰尘附着.(4)接目镜和接物镜不要随便卸下,必须抽取接目镜时,须将镜筒上口用 布遮盖,避免灰尘落入镜筒内.更换接物镜时,卸下后应倒置在清洁的台 面上,并随即装入木箱的置放接物镜的管内. (5)细调节器是显微镜最精细而脆弱的部分,不要向一个方向连续转动 数周,应轻微地来回旋转. (6)镜头必须保持清洁,油镜使用完后应立即用擦镜纸拭去香柏油.若油 镜镜头上的油迹未擦干净,应先将1:1醇醚混合液或二甲苯滴在擦镜纸 上擦拭镜头,再用干净擦镜纸将镜头上残留的醇醚混合液或二甲苯擦净. (7)显微镜擦净后,取下标本片,下降聚光器,再将物镜转成&品&字形,送 至显微镜室放入镜箱内. 三,暗视野显微镜 1.构造与原理:在显微镜上安装一个特制的聚光器一暗视野聚光器.此 聚光器中央为一黑板所遮,光线不能直接通向镜筒,使视野背景黑暗.这 样,从聚光器周边斜射到载玻片上细菌等微粒上的光线,就因散射作用 而发出亮光,反射到镜简内.故在强光照射下,可在黑色的背景中看到发 亮的菌体.正如我们在暗室内,能看到从隙缝漏入的阳光内,有无数颗尘 埃微粒跳跃飞舞一样. 2.使用方法: (1)将显微镜聚光器御下,装上暗视野聚光器,置暗室,使用人工光源. (2)先用低倍物镜观察,调节光环置中央后,在暗视野聚光器表面滴上香 柏油(或水),再将标本夹在移动尺上. (3)调节暗视野聚光器,使之油滴(或水滴)与镜台上的载玻片底面接触,(4)其余操作同光学显微镜. 四,荧光显微镜 1.构造: (1)荧光显微镜光源:能发射丰富的紫外线光和紫兰光,常用150~200瓦 高压汞灯. (2)滤光片: 1)激发滤光片装于光源与聚光器之问,可选择性使紫外光及紫兰光通过, 激发荧光素发出荧光; 2)吸收滤光片装于物镜与目镜之间,可吸收紫外光及紫兰光,仅让荧光 通过,以便观察标本和保护眼睛. 2.荧光显微镜的使用方法: (1)将荧光显微镜置暗室,开启光源,待光源稳定并达到一定亮度(约 5~10min)后,对准光轴. (2)装好配对的激发滤光片和吸收滤光片后再作观察.操作同光学显微 镜. 3.注意事项 (1)荧光显微镜如用高压汞灯作光源,使用时一经开启不宜中断,断电后 需待汞灯冷却后(约15min)方能再启用. (2)使用荧光显微镜观察标本时间不宜太长.因标本在高压汞灯下照射 超过3min,即有荧光减弱现象. 【结果记录和报告】 实验二 细菌的形态学检查【目的和要求】 1.熟悉细菌染色的常用染料和一般程序. 2.掌握革兰染色的方法,原理,结果观察及意义. 3.熟悉不染色标本检查法(压滴法和悬滴法)的方法与结果观察. 4.熟悉细菌的特殊染色法. 【试剂与器材】 1.菌种:葡萄球菌,大肠埃希菌. 2.试剂:革兰染色液,细胞壁染色液,芽胞染色液,鞭毛染色液,生理盐水 等. 3.其他:载玻片,接种环,酒精灯,显微镜,香柏油,蜡笔,擦镜纸,脱油剂 等. 【实验内容】 一,细菌染色的一般程序 细菌染色法分单染法和复染法.单染法是用一种染料去染,所有细菌都 染成一种颜色;复染法是用多种染料对细菌进行染色,不同细菌可染成 不同的颜色. 大部分细菌染色的基本程序相同,即:涂片→干燥→固定→染色,根据实 验目的选择不同的染色方法,在实际工作中,应用最广泛的是革兰染色 法. 二,革兰染色 1.染色原理 (1)等电点学说:革兰阳性菌的等电点(pI2～3)比革兰阴性菌(pI4～5)低,在同一 pH 条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多,与带正电 荷的碱性染料(结晶紫)结合性牢固,不易脱色. (2)化学学说:革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐,与进入胞浆内的结 晶紫和碘牢固结合成大分子复合物,不易被95%酒精脱色;而革兰阴性菌 含此种物质少,故易被乙醇脱色. (3)通透性学说:革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层较厚,含脂质 少,脱色时,乙醇不易进入,而且95%乙醇可使细胞壁脱水,细胞壁间隙缩 小,通透性降低,阻碍结晶紫和碘复合物渗出. 而革兰阴性菌细胞壁结 构疏松,肽聚糖层较薄,含脂质多,易被乙醇溶解,致使细胞壁通透性增 高,细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色. 2.方法 (1)涂片:取清洁无油迹的载玻片1张,用蜡笔划线将其分成左右两格.用 接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央,再分别挑取大肠杆菌 和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀,涂成直径约1.5cm 的菌膜. (2)干燥:让涂片自然干燥,也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干,但 切勿靠近火焰. (3)固定:干燥后的标本片在酒精灯火焰上来回通过3次(以钟摆的速度), 冷却后染色.固定的目的在于杀死细菌,并使菌膜与玻片牢固粘附,避免 染色过程中被水冲洗掉,通过固定还可凝固细胞质,改变细菌对染料的 通透性,使细菌易与染料结合而着色. (4)染色:分以下四步: 1min,水洗 1min,水洗 约0.5min,水洗 0.5min,水洗结晶紫 卢戈碘液 95%乙醇 稀释石炭酸复红 待干,镜检 (初染) (媒染) (脱色) (复染) 3.结果:革兰阳性菌染成紫色;革兰阴性菌染成红色. 4.注意事项: (1)涂片厚薄要适宜,以菌膜刚好能透过字迹为宜(半透明).如果涂片太 厚有可能将革兰阴性菌染成紫色,涂片太薄则可能将革兰阳性菌染成红 色. (2)脱色时间长短要适宜,如果涂片较厚应相应的延长脱色时间,如涂片 较薄则相应的缩短脱色时间,脱色时应不断旋转玻片摇匀,使其充分脱 色,通常脱到乙醇中没有紫色流下即可. (3)水洗时,水流不能过大,防止水流直接对准菌膜冲洗. (4)所有染液应防止因蒸发而改变浓度,特别是卢戈碘液久存或受光作 用后失去媒染作用;涂片上积水过多会降低染液浓度,影响染色效果. (5)因细菌的菌龄不同染色结果也有差异,一般以18~24h 培养物染色结 果最好. 5.医学意义:通过革兰染色有助于细菌的初步鉴别,并可作为选择药物 的参考,了解细菌的致病性. 三,特殊染色法 细菌的细胞壁,核质,胞浆颗粒和细菌的特殊结构如芽胞,荚膜,鞭毛等, 必须用相应的特殊染色法才能染上颜色. 1.细胞壁染色法 (1)涂片,干燥:同革兰染色法.(2)固定:滴加100g/L 鞣酸固定标本15min,水洗. (3)滴加5g/L 龙胆紫染色3~5min,水洗,待干,镜检. 结果:有细胞壁的细菌仅菌体周边染成紫色,菌体内部无色;无细胞壁的 细菌(如 L 型细菌)整个菌体都染成紫色. 2.鞭毛染色法(改良 Ryu 法) 鞭毛染色可从平板上直接挑取菌落,也可从斜面培养基上刮取菌苔涂片, 必须注意动作尽量轻,以免鞭毛脱落.培养基应为营养较好的琼脂平板 (如血平板,营养琼脂),不可用含抑制剂的选择培养基(如 SS,中国 蓝,MAC 等). (1)玻片的处理:要求用新的载玻片,用前在95%乙醇中浸泡24h 以上,用 时从酒精中取出,用干净的纱布擦干使用.若水滴向周围流散而不形成 水珠表示玻片处理良好. (2)在玻片上加蒸馏水1滴,用接种针蘸取菌落少许,将细菌点在蒸馏水 滴的顶部(一般只需点一下,仅允许极少量细菌进入水滴),使其自然流 散成薄膜,不可搅动,以免鞭毛脱落. (3)室温自然干燥,不可在火焰上烘干. (4)滴加染液(配方见附录二),染色约10~15min 后,将玻片微倾斜,用蒸 馏水缓慢滴加在玻片顶端无菌膜处洗去染液,注意洗净染液表面的金属 光泽液膜. (5)玻片自然干燥后镜检.观察时应从细菌较少的地方寻找鞭毛. 结果:鞭毛染成红色. 3.芽胞染色法(1)涂片,干燥,固定:同革兰染色法. (2)染色:分为以下三步. 1)初染:在菌膜上加石炭酸复红染液,用微火加热使染液冒蒸气5min,注 意不能煮沸或烧干,加热过程中应随时添加染液,冷却后水洗. 2)脱色:用95%乙醇脱色1～2min,水洗. 3)复染:用碱性美蓝染1min,水洗,待干,镜检. 结果:菌体呈蓝色,芽胞染成红色. 4.荚膜染色法 (1)黑斯氏法 1)涂片,自然干燥,加热固定. 2)滴加结晶紫染液,在火焰上微微加热至染液冒蒸气为止. 3)用硫酸铜溶液将玻片上的染液洗去(注:切勿水洗),用吸水纸吸干后 镜检. 结果:菌体及背景均染成紫色,荚膜染成淡紫色或无色. (2)密尔氏法 1)涂片:提前数日于小鼠腹腔注射肺炎链球菌0.2ml,小鼠死亡后取腹腔 液印片,自然干燥,加热固定. 2)滴加石炭酸复红染液,微火加热染色1min,水洗. 3)加媒染剂染0.5min,水洗. 4)加碱性美蓝染色1min,水洗,待干,镜检. 结果:菌体染成鲜红色,荚膜染成蓝色. 5.异染颗粒染色细菌经涂片,干燥,固定,加甲液(见附录二)染色3~5min,水洗后加乙液 染色1min,水洗,待干,镜检. 结果:菌体染成蓝绿色,异染颗粒染成蓝黑色. 四,不染色标本检查法 细菌未经过染色呈无色透明,在显微镜下为有折光性的小点,不能判断 细菌的形态和结构特征.因此,不染色标本检查法主要用于观察细菌的 动力,常用的方法有以下几种. 1.压滴法 用接种环分别取菌液2～3环,置于洁净载玻片中央.用小镊子挟一盖玻 片,先使盖玻片一边接触菌液,然后缓缓放下,覆盖于菌液上,避免菌液 中产生气泡.先用低倍镜找到观察部位,再换高倍镜观察细菌的运动. 2.悬滴法 取一洁净凹玻片,在凹窝四周涂少许凡士林.取一环菌液于盖玻片中央, 将凹玻片凹窝对准盖玻片上的菌液,迅速翻转载玻片,用小镊子轻压盖 玻片,使之与凹玻片粘紧封闭(见图2-1),置显微镜下观察. 图2-1 悬滴法 3.暗视野显微镜观察 将上述经压滴法制成的标本片,置于暗视野显微镜下观察,有鞭毛的细 菌运动活泼,在黑色的背景下闪闪发亮,有明显的位置移动. 观察要点:有鞭毛的细菌运动活泼,可向不同方向迅速运动,位置移动明 显.无鞭毛细菌不能做真正的运动,但受水分子的撞击而呈分子运动(布 朗运动),即在一定范围内作来回颤动,位置移动不大,注意与细菌的鞭毛运动相鉴别. 【结果记录和报告】 实验三 灭菌前的准备与基础培养基的制备 【目的和要求】 1.熟悉常用玻璃器皿的清洗,灭菌前的包装准备. 2.熟悉培养基的种类,主要成分及用途. 3.掌握基础培养基的制备程序,方法和注意事项. 【试剂与器材】 1.试剂:牛肉膏,蛋白胨,氯化钠,琼脂粉,1mol/L NaOH,1mol/L HCl 等. 2.器材:试管,吸管,平皿,锥形瓶,量筒,吸管,精密 PH 试纸,天平,滤纸等. 【实验内容】 一,常用玻璃器材的洗涤和准备 1.玻璃器材的洗涤 玻璃器材若不清洁,常可影响实验结果,如影响培养基的 pH 值,甚至由于 某些化学物质的存在可抑制微生物的生长;试管不清洁也可影响血清学 反应的结果,如在 pH16 mm 为敏感. 3)意义:本试验用于鉴别表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌,前者敏感(S), 后者耐药(R). 四,注意事项 1.触酶试验不宜用血琼脂平板上的菌落,因红细胞内含有触酶,会出现 假阳性反应;此外,陈旧培养物可丢失触酶活性,而出现假阴性反应.因 此每次做触酶试验一定要用阳性菌株和阴性菌株作对照.阳性对照可用金黄色葡萄球菌,阴性对照可用链球菌. 2.在临床检验中,常遇到血浆凝固酶阴性的葡萄球菌,不能轻率作出非 致病性葡萄球菌或污染菌的结论.因血浆凝固酶阴性的葡萄球菌也可引 起菌血症,尿路感染和心内膜炎等. 【鉴定依据】 金黄色葡萄球菌的鉴定依据:①镜下形态特点:G+球菌,葡萄状排列;② 菌落特点:血平板上为中等大小,圆形突起,光滑湿润,有透明的 β -溶血 环,金黄色菌落;③生化反应(血浆凝固酶试验+,发酵甘露醇,耐热核酸 酶试验+).符合以上特征可报告&检出金黄色葡萄球菌&. 【临床意义】 葡萄球菌属中的金黄色葡萄球菌致病性强,常引起局部化脓性感染,脓 毒血症,败血症,食物中毒等.表皮葡萄球菌为条件致病菌,可引起尿路 感染等各种机会感染.腐生葡萄球菌一般不致病. 【结果记录和报告】实验十二 链球菌属检验 【目的和要求】 1.熟悉链球菌的生长现象和镜下形态特点. 2.掌握链球菌属的检验方法. 3.掌握抗&O&试验的原理和方法. 【试剂与器材】 1.菌种:甲,乙,丙型链球菌,肺炎链球菌.2.培养基:兔血琼脂培养基,血清肉汤培养基,马尿酸钠培养基,菊糖发 酵管等. 3.试剂:革兰染色液,苯丙氨酸脱胺酶试剂,100g/L 去氧胆酸钠溶液,链 球菌分群乳胶试剂,溶血素&O&及还原剂,ASO 乳胶试剂,美兰溶液. 4.其他:杆菌肽纸片,Optochin 纸片,无菌生理盐水,人血清,2%兔红细胞, 乳胶反应板,家兔,小白鼠等. 【实验方法】 一,标本采集 根据病情采集不同标本,如脓液,鼻咽拭子,血液等.风湿热患者可取病 人血清进行抗链球菌溶血素&O&试验. 二,检验程序 痰液,脓汁,咽拭子 脑脊液 血液涂片染色镜检 荚膜肿胀试验 分离培养 增菌培养(葡萄糖肉汤等) (血平板) 初步报告 纯培养 可疑菌落(性状,溶血) 鉴定试验 杆菌肽敏 Optochin 敏 胆盐溶 血清学 荚膜肿胀 其他鉴定 药敏试验 感试验 感试验 菌试验 鉴定 试验 试验报告 图12-1 链球菌和肺炎链球菌的检验程序 三,检验方法 1.培养物观察 (1)血平板:将各种链球菌菌种接种于血平板,35℃培养24h 后,菌落呈圆 形,细小,灰白色,光滑湿润,凸起,边缘整齐,不同菌种出现不同溶血现 象.肺炎链球菌菌落与甲型溶血性链球菌菌落相似,但培养2~3天后,因 菌体发生自溶,菌落中心凹陷呈&脐状&. (2)血清肉汤:甲,乙,丙型链球菌呈絮状或颗粒状沉淀,肺炎链球菌呈混 浊生长. 2.形态学检查: 挑取各种链球菌菌落分别涂片革兰染色,镜下观察各种细菌镜下形态. 3.生化反应 (1)触酶试验:链球菌属均为阴性.(葡萄球菌属为阳性) (2)杆菌肽敏感试验: 1)试验原理:A 群链球菌对杆菌肽几乎都敏感,而其他链球菌对杆菌肽通 常耐药.因而此试验可对 A 群链球菌进行鉴别. 2)方法: 先挑取被检的菌落密集涂布于血平板上 , 再将杆菌肽纸片 (0.04U/片)贴于培养基上,35℃培养24h 后观察结果. 3)结果判断:杆菌肽周围如出现明显抑菌环(直径&10mm)为敏感,可推断 待测菌为 A 群链球菌. 4)注意事项:涂布待测菌接种量要大,防止出现假阳性.另外少数的 B群,C 群和 G 群链球菌对杆菌肽也敏感.应结合其他生化反应鉴别. (3)CAMP 试验 1)试验原理:B 群溶血性链球菌(无乳链球菌)能产生&CAMP&因子,可促进 金黄色葡萄球菌 β -溶血素的活性,故在血平板上 B 群溶血性链球菌和 金黄色葡萄球菌的菌落交界处溶血能力增强,出现箭头状透明溶血区. 2)方法:挑取金黄色葡萄球菌在血平板上划种一条横线,再将待测链球 菌在距金黄色葡萄球菌接种线3~5mm 处呈直角接种一短线(两线不能相 交),35℃培养18~24h 观察结果.同时设阳性对照(B 群链球菌)和阴性对 照(A 群或 D 群链球菌). 3)结果判断:接种的两菌交界处溶血能力如增强,出现箭头状透明溶血 区则为阳性,否则为阴性.此试验通常用于鉴别 B 群溶血性链球菌和其他 链球菌. (4)马尿酸钠水解试验: 1)试验原理:B 群链球菌有马尿酸水解酶,可水解马尿酸为苯甲酸和甘氨 酸.产生的苯甲酸可与 FeCl3结合,形成苯甲酸铁沉淀. 2)方法:取待测菌接终于马尿酸钠培养基,35℃培养48h,3000r/min 离心 30min 后吸取上清液0.8ml 加入含 FeCl30.2ml 的试管混匀.15min 后观察 结果. 3)结果判断:出现稳定沉淀物为阳性.如果有沉淀物,但轻摇后消失为阴 性.此试验用于鉴别 B 群链球菌(+)和其他链球菌(―). (5)Optochin 敏感试验 1)试验原理:Optochin(乙基氢化羟基奎宁,ethylhydrocupreine)能干扰肺炎链球菌叶酸合成,抑制肺炎链球菌生长.故肺炎链球菌对 Optochin 敏感,而其他链球菌不敏感. 2)方法:先挑取被检的菌落密集涂布于血琼脂平板上,再将 Optochin 纸 片(5 g/片)贴于培养基上,35℃培养18~24h 后观察结果. 3)结果判断:抑菌圈直径≥14mm 为敏感,可判断为肺炎链球菌;其他链球 菌耐药,直径&14mm. 4)注意事项:近年来已经发现对 Optochin 耐药的肺炎链球菌,如抑菌圈 直径较小应再做胆汁溶菌试验以确认. (6)胆汁溶菌试验 1)试验原理:胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自溶酶,使肺炎链球菌细 胞破损而溶解. 2)方法: ① 平板法:在血琼脂平板上找到呈草绿色溶血环的菌落,然后在此菌落 上加1滴100g/L 去氧胆酸钠溶液,35℃孵育15~30min 后观察结果. 结果判断:若菌落消失则为阳性,不消失为阴性. ② 试管法:取2支试管,一支加入甲型链球菌血清肉汤培养液1ml,另一 支加含肺炎链球菌血清肉汤培养液1ml.再于2管中分别加入100g/L 去氧 胆酸钠溶液0.1ml,混匀后37℃水浴30min 后观察结果. 结果判断:液体变透明为阳性,依然混浊为阴性. 3)意义:此试验通常用于鉴别肺炎链球菌与甲型链球菌. 4.血清学试验(链球菌快速分群乳胶凝集试验) (1)试验原理:对人类致病的链球菌90%属于 A 群,少数属于 B,C,D,F,G 群.用这6群抗原的兔免疫血清分别致敏的乳胶颗粒与链球菌进行间接乳胶 凝集反应,可快速对链球菌做出分群鉴定. (2)方法:挑取2~3个待检菌落转种于含有0.4ml 提取酶的试管中,使其变 为乳化均匀的菌悬液,置37℃水浴10~15min 后备用.在卡片的相应区域 各加1滴 A,B,C,D,F,G 致敏胶乳,再加入菌悬液各1滴分别与6种胶乳轻摇 混匀观察结果. (3)结果判断:发生乳胶凝集为阳性,与6群中哪种乳胶颗粒凝集则待测 菌可鉴定为相应群. 5.抗链球菌溶血素&O&抗体(antistreptolysin O,ASO)的测定(抗&O&试 验)――乳胶法 链球菌溶血素&O&抗原性强,在感染2~3周后可刺激机体产生抗链球菌溶 血素&O&抗体,测定该抗体含量可用于链球菌近期感染或风湿热的辅助 诊断.其检测方法分溶血法和乳胶法,后者方法简便,快速,应用广泛. (1)原理:ASO 高滴度的病人血清被适量的溶血素&O&中和后,抗体量减少, 多余的抗&O&抗体与 ASO 乳胶试剂反应则会出现凝集颗粒. (2)方法:先将病人血清56℃30min 灭活,然后用生理盐水1:15稀释,在反 应板各孔中分别滴加稀释血清,阳性和阴性对照血清1滴,再往各孔中滴 加1滴溶血素&O&溶液,振荡混匀后,往各孔再滴加1滴 ASO 乳胶试剂.轻摇 3min 后观察结果. (3)结果判断:出现凝集为阳性,不凝集为阴性(ASO≤250U/ml). (4)注意事项:当加入 ASO 乳胶后,轻摇至3min 时应该立即记录结果,超 过3min 出现的凝集不作为阳性.另外标本发生溶血,高脂,高胆红素,高胆固醇,类风湿因子或标本被污染都会影响试验结果.若室温低于10℃, 应该由延长反应时间1min,室温每升高10℃应缩短反应时间1min. 【鉴定依据】 1.初步鉴定:根据菌落特点,溶血,菌体形态染色性,触酶试验作出初步 鉴定. 2.最终鉴定:根据杆菌肽敏感试验,Optochin 敏感试验,胆汁溶菌试 验,CAMP 试验,血清学试验等进行进一步鉴定. 【临床意义】 链球菌是一类常见的化脓性球菌,广泛分布于自然界,也是人体的正常 菌群.大多数链球菌不致病,对人致病的链球菌90%以上属于 A 群,引起的 疾病主要有各种化脓性炎症,猩红热,新生儿败血症,细菌性心内膜炎, 风湿热,肾小球肾炎等. 【结果记录和报告】 1.记录各种链球菌的镜下形态和菌落特点. 2.记录各种链球菌生化反应的结果. 实验十三 奈瑟菌属和布兰汉菌属检验 【目的和要求】 1. 掌握脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的形态和培养特性. 2. 掌握脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的鉴别要点. 3.熟悉卡他布兰汉菌的形态和培养特性. 【试剂与器材】 1. 脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌及卡他布兰汉菌菌种和染色示教片.2. 培养基:巧克力色血平板,血平板,葡萄糖,麦芽糖,蔗糖发酵管,硝酸 盐培养基,DNA 琼脂培养基等. 3. 试剂:革兰染色液,氧化酶试剂,硝酸盐还原试剂,1mol/L 盐酸. 【实验内容】 一,标本采集 1.脑膜炎奈瑟菌:根据病情和病程采集不同标本.菌血症期采血液,有出 血点取瘀斑渗出液,有脑膜炎症状者取脑脊液,上呼吸道感染和带菌者 采鼻咽拭子和分泌物等. 2.淋病奈瑟菌:男性患者用无菌棉签取脓性分泌物,非急性期病人可将 棉签插入尿道2~4cm,转动拭子后取出;女性患者取宫颈分泌物;新生儿 眼结膜炎患者取结膜分泌物. 3.卡他布兰汉菌:根据感染部位采集血液,脑脊液,穿刺液等. 二,检验程序 脑脊液 瘀血点穿刺液,鼻咽分泌物,咽喉拭子 血液 离心 上清液 沉淀 分离培养 增菌培养 (血平板或巧克力平板,5%CO2) (葡萄糖肉汤等,5%CO2) 直接凝集 涂片染色 挑取可疑菌落 初报涂片染色 氧化酶试验 糖发酵试验 血清凝集试验 药敏试验报告 图13-1 脑膜炎奈瑟菌的检验程序 注:淋病奈瑟菌的检验程序可参照脑膜炎奈瑟菌. 三,检验方法 1.菌落观察 将脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌及卡他布兰汉菌的菌种分别接种在血平板 和巧克力色血平板上,35℃,5%CO2培养箱中培养24h 后观察菌落. (1)脑膜炎奈瑟菌:在巧克力平板上菌落为圆形,光滑湿润,扁平,半透明, 边缘整齐,大小约1~2在血平板上不溶血. (2)淋病奈瑟菌:菌落呈圆形,凸起,光滑湿润,大小约0.5~1mm,灰白色. 在血平板上不溶血. (3)卡他布兰汉菌:菌落呈浅红棕色,不透明,干燥,大小约1~3mm. 2.形态观察 将脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌及卡他布兰汉菌经革兰染色 后观察镜下形态. 3.生化反应 (1)氧化酶试验:奈瑟菌属氧化酶试验阳性.(原理,方法见实验五) (2)三糖(葡萄糖,麦芽糖,蔗糖)发酵试验 1)试验原理:脑膜炎奈瑟菌可分解葡萄糖和麦芽糖,淋病奈瑟菌只分解 葡萄糖,卡他布兰汉卡菌不分解任何糖类.分解糖后会使发酵管内 ph 值 下降,使发酵管内的指示剂变黄色. 2)方法:将脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌及卡他布兰汉菌分别接种葡萄糖, 麦芽糖,蔗糖发酵管,35℃培养18~24h 后观察结果.3)结果判断:培养基变黄为阳性,不变色(紫色)为阴性. (3)硝酸盐还原试验:奈瑟菌多为阴性而卡他布兰汉菌为阳性,可用于该 菌属间的鉴别.(原理,方法见附录3) (4)DNA 酶试验:卡他布兰汉菌为阳性,奈瑟菌属均为阴性.(原理,方法见 附录3) 表13-1 奈瑟菌和卡他布兰汉菌的主要生化反应 菌种 氧化酶 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 硝酸盐还原 DNA 酶 脑膜炎奈瑟菌 + + + ― ― ― 淋病奈瑟菌 + + ― ― ― ― 卡他布兰汉菌 + ― ― ― + + 四,注意事项 1.脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌对外界抵抗力弱,采集标本后应立即送检, 并注意保温,最好床边接种. 2.淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌在24h 后均可出现自溶,应该及时观察结 果并及时转种. 【鉴定依据】 1.初步鉴定:脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌镜下形态均为 G-球菌,肾形或 豆形,成双排列,位于细胞内外,临床标本直接涂片染色镜检有助于初步 诊断. 2.最终鉴定:根据菌落特点,氧化酶试验,糖发酵试验,硝酸盐还原试 验,DNA 酶试验等生化反应作进一步鉴定. 【临床意义】脑膜炎奈瑟菌的传染源是病人或带菌者,正常情况下可寄居于人体鼻咽 部.经呼吸道感染,感染者以5岁以下儿童为主,引起流行性脑脊髓膜炎. 淋病奈瑟菌传染源是病人,经性接触或垂直传播,引起淋病或新生儿淋 菌性眼结膜炎.卡他布兰汉菌是条件致病菌,当机体免疫力下降时可引 起粘膜卡他性炎症,急性咽喉炎,支气管炎,肺炎,心内膜炎,败血症或脑 膜炎等,是医院内感染的常见病原菌. 【结果记录和报告】 1.记录三种细菌的镜下形态特点. 2.描述三种细菌的菌落形态. 实验十四 大肠埃希菌检验 【目的和要求】 1. 掌握大肠埃希菌的形态,染色特点,培养特性,生化反应,常见类型及 鉴定依据. 2. 熟悉大肠埃希菌的血清学及动物试验. 【试剂与器材】 1. 菌种:大肠埃希菌,EPEC, ETEC ,EIEC ,EHEC. 2. 培养基:克氏双糖铁(KIA),MIU 培养基,葡萄糖蛋白胨水,枸橼酸盐琼 脂斜面,硝酸盐培养基,SS 琼脂培养基,EMB 培养基,SMAC 琼脂培养基. 3.试剂:EPEC 3组多价诊断血清和12种单价诊断血清,EIEC OK I ,II 两 组多价诊断血清和8种单价诊断血清,氧化酶试剂,甲基红试剂,40%KOH 溶液,3%H2O2溶液,革兰染色液. 【实验内容】一,标本采集 根据不同疾病,采集不同部位标本,如:中段尿,脓汁,痰液,血液,胆汁, 脑脊液,粪便,直肠拭子等. 二,检验程序 脓液,痰液, 胆汁,血液,脑脊液 粪便,直肠拭子 分泌物,尿(定量培养) 革兰染色 分离培养 增菌培养 分离培养 镜检 (血平板,MAC) (MAC,EMB) 可疑菌落 肠外感染 肠道感染 菌落特征 系统生化反应 ETEC EPEC,EIEC,EHEC 革兰染色 KIA,MIU 生化反应 肠毒素测定 OK 多价 生化反应 血清学分型 血清凝集 结果报告 结果报告 图14-1 大肠埃希菌的检验程序 三,实验方法 1.形态观察:涂片革兰染色后镜检. 2.菌落观察 取普通大肠埃希菌及 EPEC, ETEC ,EIEC ,EHEC 分别接种在 SS 平板,EMB 培养基上,35℃24h 观察结果.SS 平板:菌落较小,红色,圆形,光滑,凸起,边缘整齐. EMB 培养基:紫黑色,有金属光泽,较大,圆形,凸起,不透明. SMAC 培养基:大肠埃希菌 O157菌落呈无色,中等大小,圆形,光滑凸起. 3.生化反应 (1)氧化酶试验:取氧化酶纸片,用纸片刮取待测菌落,观察纸片的颜色 变化.变为蓝紫色为阳性,不变色为阴性.大肠埃希菌为阴性. (2)其他生化反应:将大肠埃希菌分别接种在克氏双糖铁(KIA),MIU 培养 基,葡萄糖蛋白胨水,枸橼酸盐琼脂斜面,硝酸盐培养基管中,35℃培养 18~24h 后观察结果,并进一步做触酶试验. 表14-1 大肠埃希菌的初步生化反应 KIA MIU 甲基红 VP 枸橼酸盐 触 氧化酶 硝酸盐 乳糖 葡萄糖 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶 试验 试验 利用试验 酶 试 验 还原 + + +/― ― +/― + ― + ― ― + ― + ― + ― ― + + ― + ― ― + ― + ― + ― ― ― + ― + ― ― + ― + ― + + ― +/― + ― + ― ― + ― + 4.血清学反应 (1)EPEC 的鉴定:凡生化反应符合大肠埃希菌特征,怀疑为 EPEC 感染者, 取 KIA 培养基上的培养物分别与 EPEC 的 OK 多价 I ,II,III 组诊断血 清作玻片凝集试验.如与其中某一组多价血清凝集则继续与该组单价分 型血清作玻片凝集试验,若发生凝集,表示细菌具有某型 EPEC 的 K 抗原,需进一步鉴定其 O 抗原型别.先将菌液加热100℃,1h,再与该分型血清进 行玻片凝集试验,以确定 O 抗原型别.根据 O,K 抗原鉴定结果可判断 EPEC 的血清型. (2)EIEC 的鉴定:血清学鉴定方法与 EPEC 相同,血清学分型为 O152和 O124.因与志贺菌的抗血清有交叉反应,且生化反应与临床表现相似,需 注意鉴别,主要鉴别试验为:醋酸盐,葡萄糖铵利用试验,粘质酸盐产酸 试验,EIEC 均为(+),志贺菌为(―). (3)EHEC(O157:H7)鉴定:筛选 SMAC 上的无色,中等大小菌落,且生化反应 符合标准大肠埃希菌生化反应,用 O157抗血清做乳胶凝集试验检测其 O157抗原. (4)ETEC 的鉴定:通过分离培养,生化反应,血清学分型和肠毒素测定作 出鉴定. 【临床意义】 大肠埃希菌是肠道杆菌的重要成员,是一种常见的条件致病菌,常引起 多种肠外感染,如泌尿系统感染,胆囊炎,手术伤口感染,腹膜炎等.致病 性的大肠杆菌引起各种肠道感染. 因大肠埃希菌从粪便排出,故常用作水源或食品被粪便污染的检测指标. 【结果记录和报告】 1.记录大肠埃希菌的镜下形态特点. 2.记录大肠埃希菌的菌落特点.实验十五 沙门菌属检验【目的和要求】 1.掌握沙门菌属的检验程序和检验方法. 2.熟悉沙门菌属检验的报告方法. 3.掌握肥达反应的原理,方法,结果判读及报告方法. 【试剂与器材】 1.菌种:伤寒沙门菌,甲,乙,丙副伤寒沙门菌. 2.培养基:SS 培养基,EMB 培养基或 MAC 培养基,KIA 培养基,MIU 培养基, 葡萄糖 O/F 培养基,蛋白胨水,葡萄糖蛋白胨水,枸椽酸盐培养基,硝酸盐 培养基等. 3.试剂:靛基质试剂,甲基红试剂,V-P 试剂,3% H2O2,革兰染液,氧化酶 试剂,沙门菌属诊断血清,肥达反应试剂等. 4.其它:显微镜,载玻片,接种环,酒精灯,生理盐水,试管,吸管等. 【实验内容】 一,病原学检查 1.标本采集 肠热症第一周取血,第二,三周取大便,尿标本,整个病程均可取骨髓.食 物中毒:取呕吐物,腹泄物或残余食物.败血症取血液.从病程第二周开 始可取病人血清做肥达反应协助诊断肠热症. 2.检验程序 粪便 血液,骨髓增菌培养 分离培养 增菌培养(亚硒酸盐增菌液) (SS, EMB,血平板) (胆盐葡萄糖肉汤) 35℃ 18-24h 可疑菌落 菌落特点 GS 镜检 初步鉴定 O/F,KIA,MIU 生化反应:IMViC 最终鉴定 A-F 多价血清凝集 肠杆菌系统生化反应 单价因子血清定血清型 药敏试验 报告 3.检验方法 (1)培养物观察 将沙门菌属细菌分别接种在 SS,EMB 等肠道选择培养基上35℃培养 18-24h 观察结果.由于本菌不发酵乳糖,故在 SS,EMB 平板上为无色半透 明光滑型小菌落,产生 H2S 的细菌可在 SS 平板上形成中心带黑褐色的小 菌落. (2)形态学观察 取沙门菌属细菌培养物涂片 GS 镜检,为 G-无芽胞杆菌,鞭毛染色标本, 镜下可见周鞭毛. (3)生化反应 从 SS 平板上挑取单个菌落分别接种于 O/F,KIA,MIU 及硝酸盐培养基等 35℃培养18-24h 观察结果,同时做氧化酶试验,触酶试验,靛基质,甲基 红及 V-P 试验,观察并记录结果,最终鉴定需做全面生化反应及血清学鉴定. (4)血清学鉴定 用沙门菌诊断血清与待测菌做玻片凝集试验: 1)先用 A-F 多价 O 血清与待测菌做玻片凝集试验,如凝集,则分别用群特 异性 O 血清(O2,4,7,9……)与待测菌做玻片凝集试验,确定并记录 O 抗 原型别以定群. 2)用该群内 H 第1相抗血清与待测菌做玻片凝集试验,确定凝集后记录 H 抗原的第1相抗原型别以定型(种). 3)根据记录的 O,H 抗原型别,查沙门菌属抗原组成表,以确定待测菌的血 清型和菌名. 4)如果沙门菌属的抗原组成表有2种以上的血清型抗原与本次实验的分 离株相同,则需凝集第2相 H 抗原,确定凝集,记录结果,查沙门菌属抗原 组成表,以确定待测菌的血清型和菌名. 5)如果仍有2种以上的血清型抗原组成相同,则需参照抗原组成表中推 荐的补充生化反应进行鉴定. 6) 若生化反应典型,但与 A-F 多价 O 血清不凝集,则待测菌可能有表面 抗原存在,需刮取菌苔用生理盐水配成浓菌液,100℃水浴加热30min,再 重复①～⑤步骤,以确定菌株的血清型和菌名,如果仍然与 A-F 群多价血 清不凝集,则可能为非 A-F 群沙门菌. 4.注意事项 (1)临床菌落观察需仔细,不要漏检靠近发酵乳糖型菌落周边的可疑菌 落.(2)生化反应典型而不与 A-F 多价血清凝集者,要考虑 Vi-Ag 的存在. (3)如血清学鉴定能定群,但又不能用因子血清定型者,要想到鞭毛变异 的可能性. (4)严格无菌操作,注意生物安全. 二,肥达反应(试管法) 1.原理:用已知的伤寒沙门菌 O 和 H 抗原,甲,乙型副伤寒杆菌的 H 抗原 (PA,PB)与肠热症患者的血清做定量凝集试验,测定患者血清中相应抗 体的含量,以协助诊断肠热症. 2.方法: (1)取28支试管分4排,每排7管排于试管架上,并编号. (2)每管各加生理盐水0.5ml. (3)每排第1管各加1:10待检血清0.5ml,并做对倍稀释,即从每排的第1 管开始轻轻混匀,然后吸取0.5ml 置于第2管,如此类推,直至第6管混匀 弃去0.5ml,第7管不加血清作为阴性对照.此时第1~6管的血清稀释度分 别为1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640. (4)每排的第1~7管加相应诊断菌液(TO,TH,PA,PB)各0.5ml,至此第1~6 管血清最终稀释度分别为1:40～1:1280.(表15-1) 表15-1 肥达试验试管法 试管号 1 2 3 4 5 6 7 生理盐水(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1:10稀释血清(ml)0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃0.5 ― 血清稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 ―诊断菌液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 (每排分别加四种菌液) 血清最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 ― (5)混匀置室温或35℃温箱24h 后观察结果. 3.结果判断及报告 (1)结果判断 先观察对照管,液体均匀混浊无凝集,但管底可有呈同心圆状的点状沉 淀物,轻摇则消失,再分别与对照管比较观察各管的凝集情况.根据液体 透明度和凝集块多少,以++++,+++,++,+,-等符号记录各管结果.以出现 &++&凝集的最高血清稀释度为抗体效价. ++++ 细菌100%凝集,管内液体清亮,可见管底有大片边缘不整的白色凝 集物,轻摇时可见有明显的颗粒,薄片或絮状. +++ 细菌75%的凝集,液体轻度混浊,管底有边缘不整的白色凝集物,轻 摇时也可见明显的颗粒,薄片或絮状. ++ 细菌50%的凝集,液体较混浊,管底有明显可见的少量凝集物呈颗粒 状. + 细菌25%的凝集,液体混浊,管底凝集呈颗粒状,细小不易观察. - 不凝集,液体混浊度及管底沉淀物与对照管相似. (2)报告方式 根据凝集效价判定方法,报告待检血清对 TO,TH,PA,PB 的凝集效价.如果 第1管仍无凝集现象,应报告&1:1280&. 4.注意事项(1)抗原抗体反应在比例适当时,才能出现肉眼可见的反应.如果抗体浓 度高,则无凝集物形成,此为前带现象,需要在判定结果时加以鉴别. (2)判定结果时,应在暗背景下透过强光检查. (3)结果观察时不要摇动试管,先观察.必要时再轻摇试管,使凝集块从 管底升起,然后按液体的清浊,凝集块的大小进行记录. (4)&H&凝集呈絮状,以疏松的棉絮状大团铺于管底,轻摇试管即能荡起, 且极易散开.&O&凝集呈颗粒状,以坚实凝片沉于管底,轻摇试管不易荡 起,且不易散开. (5)注意吸液,移液的量,及温度,PH,电解质等对本试验结果的影响. 【鉴定依据】 1.初步鉴定 根据菌落特点,菌落涂片,GS 镜检,O/F 为发酵型,KIA 及 MIU 的特 点,IMViC 及 A-F 多价抗血清凝集试验作出初步鉴定. 2.最终鉴定 需做全面的生化反应及血清学鉴定. 3.报告方式 (1)阴性报告:分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌 鉴定依据者可报告&未分离出沙门菌&. (2)初步报告:生化反应符合沙门菌,A-F 多价血清,玻片凝集试验阳性, 可初步报告&分离出??沙门菌&或&?群沙门菌&. (3)最终报告:进一步做多种生化反应及因子血清分型后,可报告&分离 出??沙门菌&.【临床意义】 1.沙门菌是引起消化道感染的常见病原菌,可致伤寒,副伤寒,败血症, 食物中毒.病原学检验是确诊的&金标准&. 2.肥达反应常用于肠热症的辅助诊断.分析结果时,如取双份血清进行 肥达反应,第2次比第1次血清抗体效价高4倍以上,则具有重要的诊断意 义.如仅做一次肥达反应,则需结合当地居民的正常抗体水平,病程,以 及 O 抗体,H 抗体效价等进行综合分析. 【结果记录和报告】 1.记录沙门菌的生化反应结果. 2.描述沙门菌在 SS,EMB 平板上的菌落特点. 3.报告本次鉴定结果. 实验十六 志贺菌属检验 【目的和要求】 1.掌握志贺菌属的检验程序和检验方法. 2.熟悉志贺菌属检验的报告方法. 【试剂与器材】 1.菌种:志贺菌属各群(A,B,C,D 群). 2.培养基:SS 培养基,EMB 培养基或 MAC 培养基,KIA 培养基,MIU 培养 基,O/F 培养基,蛋白胨水,葡萄糖蛋白胨水,枸椽酸盐培养基,硝酸盐培 养基等. 3.试剂:靛基质试剂,甲基红试剂,V-P 试剂,革兰染液,氧化酶试剂,3% H2O2,志贺菌诊断血清等.4.其它:显微镜,载玻片,接种环,酒精灯,生理盐水等. 【实验内容】 1.标本采集 粪便或肛门拭子(亦可肛门指检取标本). 2.检验程序 粪便或肛门拭子 增菌培养 分离培养 (GN 肉汤) (SS,EMB,MAC)可疑菌落 菌落特点 GS 镜检 初步鉴定 O/F,KIA,MIU 初步生化反应 最终鉴定 志贺菌多价血清凝集 肠杆菌系统生化反应 血清学鉴定 毒力试验 药敏试验 (因子血清凝集) (必要时)报告 3.检验方法 (1)培养物观察 将志贺菌属细菌分别接种在 SS,EMB 或 MAC 等肠道选择培养基上35℃培 养18-24h 观察结果,由于志贺菌不分解乳糖,形成中等大小,无色,半透明,S 型菌落.宋内氏志贺菌迟缓分解乳糖,培养48h 后转为分解乳糖型有 色菌落. (2)形态学观察 取志贺菌属细菌培养物涂片,GS 镜检为 G-无芽胞杆菌. (3)生化反应 从选择培养基上挑选可疑菌落分别接种于 O/F,KIA,MIU,硝酸盐,蛋白胨 水,葡萄糖蛋白胨水等培养基及甘露醇,枸橼酸盐培养基管,经35℃培养 18-24h 后观察,记录结果.KIA 培养物48h 后再观察一次,是否发生变化. 同时做氧化酶,触酶,靛基质,甲基红,V-P 等试验观察记录结果. (4)血清学鉴定 凡生化反应符合志贺菌属者需做血清学鉴定. 1)血清学鉴定原则 ①待测菌与志贺菌四群多价血清做玻片凝集,确定凝集则为志贺菌属细 菌. ② 待测菌分别与各群多价血清做玻片凝集,确定凝集,以定群,由于 B 群 最常见故先从 B 群做起. ③ 待测菌+该群内各型因子血清做玻片凝集,确定凝集以定型. 2)根据生化反应选做血清学鉴定:为了简化鉴定方法,可参考生化反应 选做血清学鉴定,其方法如下: 甘露醇发酵(-) 靛基质试验(-) 选用 A 群 I 型诊断血清 甘露醇发酵(-) 靛基质试验(+) 选用 A 群 II 型诊断血清 甘露醇发酵(+) 乳糖(-) 选用 B 群多价诊断血清甘露醇发酵(+) 乳糖迟缓(+) 选用 D 群诊断血清 甘露醇发酵(+) B 群及 D 群诊断血清不凝集,再选用 C 群诊断,仍不凝集, 应考虑 K 抗原的存在,取菌苔经100℃水浴30min 破坏 K 抗原,再做血清学 鉴定. 4.注意事项 (1)临床上菌落观察需仔细,不要漏检靠近发酵乳糖型菌落周边的可疑 菌落. (2)生化反应典型而又不与志贺菌四群多价血清凝集者,要考虑 K 抗原的 存在. (3)非典型菌株,可用传代法恢复典型性状,然后鉴定. (4)中毒性痢疾应尽量快速诊断. (5)严格无菌操作,注意生物安全. 【鉴定依据】 1.初步鉴定 根据菌落特点,菌落涂片 GS 镜检,O/F 为发酵型,KIA 及 MIU,甘露醇,靛基 质等生化反应的特点,与志贺菌四群多价血清凝集,可做出初步鉴定. 2.最终鉴定 需做全面的生化反应及血清学鉴定,必要时尚需做毒力试验. 3.报告方式 (1)阴性报告:分离培养未见可疑菌落,或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依 据者,可报告&未分离出志贺菌属细菌&. (2)初步报告:生化反应符合志贺菌,志贺菌四群多价血清玻片凝集试验阳性,可报告&分离出志贺菌&或&?群志贺菌&. (3)最终报告:进一步生化反应及因子血清分型后,可报告&分离出?群 志贺菌?型&. 【临床意义】 志贺菌属是引起细菌性痢疾的病原菌.临床上引起痢疾样症状的病原生 物除志贺菌外,尚有痢疾阿米巴,某些致病性大肠杆菌等,故病原学检测 时需与这些病原生物相鉴别. 【结果记录和报告】 1.记录志贺菌各群的生化反应结果. 2.描述志贺菌在 SS,EMB 平板上的菌落特点. 3.报告本次鉴定结果. 实验十七 其它肠杆菌检验 【目的和要求】 1.熟悉变形杆菌属,克雷伯菌属,肠杆菌属的生物学特性及其培养鉴定 法. 2.熟悉变形杆菌属,克雷伯菌属,肠杆菌属检验的报告方法. 【试剂与器材】 1.示教片:变形杆菌鞭毛染色片,肺炎克雷伯菌荚膜染色片,鼠疫耶尔森 氏菌革兰染色片. 2.菌种:变形杆菌,肺炎克雷伯菌,产气杆菌. 3.培养基:普通平板,SS 平板,EMB 平板,KIA 及 MIU 培养基,蛋白胨水,葡 萄糖蛋白胨水,枸橼酸盐,尿素培养基等.4.试剂:革兰染液,靛基质试剂,甲基红试剂,V-P 试剂,生理盐水. 5.其它:载玻片,接种环,酒精灯,显微镜等. 【实验内容】 1.标本采集 根据不同病变可采集痰,尿,粪,渗出物及血标本等. 2.检验程序 标本 痰,渗出物,尿 粪便 血 (硫酸镁肉汤增菌) 直接涂片 血平板,SS 及 SS,EMB 及 染色镜检 普通平板 普通平板 初报 可疑菌落 菌落特点 初步鉴定 GS 镜检 KIA,MIU 最终鉴定 生化反应 (肠杆菌系统生化反应) 3.检验方法 (1)培养物观察 将变形杆菌,产气杆菌,肺炎克雷伯菌分别接种于 EMB,SS,血平板,普通 平板,35℃培养18-24h.注意观察菌落的大小,形状,颜色,粘度等特征,并注意变形杆菌的迁徙生长现象. (2)形态学观察 1)示教片:变形杆菌鞭毛染色玻片示周鞭毛.肺炎克雷伯菌荚膜染色玻 片示荚膜.鼠疫耶尔森氏菌革兰染色玻片示 G-杆菌. 2)培养物菌落涂片革兰染色镜检,注意它们的形态,排列,染色性. (3)生化反应 1)观察变形杆菌,肺炎克雷伯菌,产气杆菌在 KIA 及 MIU 培养基上的生长 情况. 2)观察产气杆菌和肺炎克雷伯菌的 IMViC 试验结果,注意与大肠埃希菌 区别. 【鉴定依据】 1.根据菌落特征,形态特点,生化反应做出初步鉴定,最终鉴定需做全面 的生化反应. 2.报告方式 (1)初步报告:痰,分泌物,渗出物等标本直接涂片革兰染色镜检,找到 G杆菌,可初步报告&某标本直接镜检找到 G-杆菌&. (2)阴性报告:分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合变形杆菌,克雷 伯菌等可报告为&未分离出肺炎克雷伯菌&等. (3)阳性报告:分离出的菌落经鉴定符合某菌则报告&分离出??细菌&. 【临床意义】 1.变形杆菌属,克雷伯菌属是条件致病菌,好发于免疫力低下的人群,在 临床上可致多部位,多脏器的感染,故检测的标本有多种,各菌的鉴定方法各异. 2.其他肠杆菌种类多,一般不致病或为条件致病菌,引起临床感染的类 型多种多样.如检出菌一时难以鉴定时,要想到其它少见肠杆菌之可能, 可保留菌种送上一级微生物实验室鉴定. 【结果记录和报告】 1.绘出变形杆菌,肺炎克雷伯菌,产气杆菌革兰染色镜下图. 2.记录变形杆菌,产气杆菌,肺炎克雷伯菌在 SS,EMB,血平板,普通平板 的菌落特征及生化反应. 3.报告本次鉴定结果. 实验十八 弧菌属与弯曲属检验 【目的和要求】 1.熟悉霍乱弧菌,副溶血性弧菌,空肠弯曲菌,幽门螺杆菌的生物学特性 及其培养鉴定. 2.熟悉霍乱弧菌的血清学鉴定. 3.掌握上述细菌检验的报告方式. 【试剂与器材】 1.菌种:水弧菌,副溶血性弧菌,空肠弯曲菌,幽门螺杆菌. 2.培养基:碱性蛋白胨水,碱性琼脂平板,TCBS 琼脂平板,血琼脂平 板,3.5%NaCl 普通琼脂平板,KIA,MIU,Skirrow 弯曲菌培养基,快速尿酶 培养基等. 3.试剂:氧化酶试剂,0.5%去氧胆酸钠,O/129纸片(10mg/片及150mg/ 片),3%H2O2,乙酸铅试纸条,1%马尿酸水溶液,尿素酶试剂,生理盐水等.4.其它:显微镜,接种环,载玻片,酒精灯,培养箱等. 【实验内容】 1.标本采集 弧菌检验可取呕吐物,腹泻物,残余的食物或肛拭子. 弯曲菌检验可取大便,血液,脑脊液. 幽门螺杆菌检验可取胃粘膜活组织. 2.检验程序 (1)霍乱弧菌检验程序 粪便,呕吐物 增菌培养(碱性蛋白胨水) 快速诊断 直接涂片,染色,动力及制动试验分离培养(碱性琼脂平板) 血清学鉴定 初步报告 生化鉴定,分型 终报告 (2)幽门螺杆菌检验程序 胃粘膜活检标本 直接涂片染色镜检 分离培养(改良 Skirrow) 快速诊断疑似幽门螺杆菌 可疑菌落 尿素酶试验 初报告 生化反应 终报告 (3)弯曲菌检验程序血液,脑脊液 粪便或肛拭子 增菌(布氏肉汤) 卡布运送培养基 25℃ 37℃ 分离培养 革兰染色镜检 动力试验 7天不生长 生长 (改良弯曲菌血平板) 阴性报告 可疑菌落 革兰染色镜检 动力试验 生化反应 3.检验方法 (1)培养物观察 1)水弧菌接种于碱性蛋白胨水,碱性琼脂平板,KIA, TCBS 琼脂平板等. 副溶血性弧菌接种于35g/L 营养琼脂平板及 TCBS 琼脂平板,35℃培养 18-24h 后观察在各种培养基上的生长现象,注意菌落的形态,大小,颜色, 比较副溶血性弧菌与水弧菌在 TCBS 平板上的不同点. 2) 将弯曲菌,幽门螺杆菌分别接种于 Skirrow 培养基,弯曲菌分别置于 25℃,37℃,42℃微需氧环境中培养1-3天,观察记录菌落特点.幽门螺杆 菌置于37℃微需氧高湿度环境中培养3-5天,观察记录菌落特点. (2)形态学观察 取载玻片1张,加生理盐水少许,取各培养物菌落涂片,革兰染色镜检.注 意它们形态,排列,染色性. 取水弧菌压滴法暗视野看动力(如为霍乱弧菌则加1滴 O-1群抗血清做制 动试验).(3)生化反应 1)取水弧菌分别做: ① 氧化酶试验:取菌落沾在滤纸上滴加氧化酶试剂后观察结果,菌落变 为深紫色者为阳性. ② O/129敏感性试验:在含0.5% NaCl 普通琼脂平板上,弧菌对10mg/片及 150mg/片的 O/129敏感,在纸片周围出现明显的抑菌环. ③ O/F 试验:弧菌均以发酵(F)形式分解葡萄糖. ④ 粘丝试验:取洁净载玻片1张,加1滴0.5%去氧胆酸盐溶液,取待测菌 落少许,碾磨1min,液体变清,提起接种环出现明显的拉丝为阳性. ⑤ 嗜盐性试验:取待测菌接种于含盐浓度分别是0%,3%,6%,10%的蛋白 胨水中,35℃培养18-24h 观察其生长情况. ⑥ 霍乱红试验:取碱性蛋白胨水培养物1管,按每毫升加1滴浓硫酸,出 现红色者为阳性. ⑦ 同时做氨基酸脱羧酶和精氨酸双水解酶的测定及观察 KIA 和 MIU 的 反应情况. 2) 副溶血性弧菌 取副溶血性弧菌,做氧化酶试验,甘露醇,蔗糖发酵及含盐分别为 0%,3%,6%,10%的蛋白胨水生长试验,并观察记录 KIA,MIU 的反应情况. 3) 取幽门螺杆菌做氧化酶,触酶,尿素酶,硝酸盐还原,乙酸铅等试验, 同时做微需氧环境下,不同温度(25℃,37℃,42℃)的生长试验及观察 KIA 的反应情况. (4)血清学鉴定如为霍乱弧菌尚需做血清学鉴定:从 TCBS 琼脂平板挑取可疑菌落与 O1 群抗血清做玻片凝集试验,确定凝集定群,然后用霍乱因子血清(A,B,C 因子血清)定型. (5)幽门螺杆菌快速诊断 取微量反应板一块,每孔加入尿素酶试剂50ul,取1环幽门螺杆菌菌落或 胃粘膜活检组织块加入孔中,用透明胶带将孔口封闭35℃培养,若24h 内 由淡黄色变成粉红色为阳性,表示幽门螺杆菌感染. 4.注意事项 (1)霍乱弧菌所致霍乱属甲类传染病之一,在学习霍乱弧菌的检验时,尚 需了解中华人民共和国传染病防治法有关内容. (2)弯曲菌,幽门螺杆菌的培养必须满足其苛刻的生长条件,故一般实验 室难以开展. 【鉴定依据】 1.霍乱弧菌 (1)从患者标本中检出 G-弧菌,具穿梭状运动,O-1群抗血清制动试验阳 性,玻片凝集试验阳性,菌落典型,可做出初步诊断,确定诊断尚需做一 系列生化反应及鉴定,鉴别试验. (2)报告方式:患者标本镜检时见到形态染色典型,运动活泼动力及制动 试验阳性可初步报告为:&找到 G-弧菌,与某群抗血清制动试验阳性&. 若同时做了培养,并做玻片凝集试验阳性可初步报告为:&经培养有疑似 霍乱弧菌生长&. 若经一系列鉴定鉴别试验确定为霍乱弧菌,应报告为:经?天培养有霍乱弧菌生长. 2.副溶血性弧菌 (1)根据 G-杆菌,两端浓染多形性,端鞭毛运动活泼.在 TCBS 平板上菌落 呈蓝绿色.结合氧化酶试验,在 KIA 及 MIU(含3% NaCl)上反应结果及嗜盐 性试验可做出初步鉴定.最终鉴定尚需做进一步生化反应. (2)报告方式:经培养及生化反应,符合鉴定依据可报告为&培养出副溶 血性弧菌&. 3.幽门螺杆菌 (1)根据形态特点,G-细长呈弧形,S 形或螺旋状.生长缓慢,35℃微需氧 环境生长,尿素酶试验阳性等生化特点作出鉴定. (2)报告方式:胃粘膜活组织标本,经 GS 发现 G-呈 S 形,飞燕形两端较尖 的弯曲杆菌,鱼群状排列,可报告为&检出 G-螺状杆菌形似幽门螺杆菌&. 4.弯曲菌 (1)根据 G-细小弯曲杆菌,单鞭毛,有投镖样或螺旋状运动,微需氧条件 下生长,氧化酶试验阳性,硝酸盐还原,马尿酸水解,硫化氢等生化反应 及不同温度的生长试验作出鉴定. (2)报告方式:经分离培养符合鉴定标准,报告为&培养出??弯曲菌&. 【临床意义】 霍乱弧菌是霍乱的病原菌,副溶血性弧菌引起食物中毒,幽门螺杆菌主 要与上消化道溃疡有关,弯曲菌可致人类肠道内和肠道外感染,临床类 型复杂.对上述细菌进行检测,鉴定,为临床提供病原诊断依据. 【结果记录和报告】1.绘出弧菌,弯曲菌,幽门螺杆菌的镜下形态. 2.记录弧菌,弯曲菌,幽门螺杆菌在不同培养基上的菌落特点. 实验十九 非发酵菌检验 【目的和要求】 1.掌握非发酵菌的鉴定程序. 2.掌握铜绿假单胞菌的形态,培养特征及鉴定要点. 3.熟悉不动杆菌,产碱杆菌的形态,生化反应及培养特征. 【试剂与器材】 1.菌种:铜绿假单胞菌,乙酸钙不动杆菌,洛非不动杆菌,粪产碱杆菌. 2.培养基:普通琼脂平板,血琼脂平板,SS 平板,MAC 平板,葡萄糖 O/F 管 及其它生化反应管. 3.试剂:氧化酶试剂,硝酸盐还原试剂,液体石蜡等. 4.其它:显微镜,接种环,酒精灯,载玻片,温箱等. 【实验内容】 1.标本采集 根据不同病变取各种体液,渗出液,排泄物;医院环境监控时取空气,水, 物体表面采样. 2.检验程序 标本 直接涂片 分离培养 增菌 悬滴法看动力, (普通平板,血平板,MCA 平板) (营养肉汤) GS 镜检35℃ 18-24h 初报 可疑菌落 菌落特点 镜下特点(动力,形态,排列,染色性) 初步鉴定 色素 气味 生化反应(O/F,氧化酶) 最终鉴定 生长试验 (非发酵菌系统生化反应) 3.检验方法 (1)渗出物等标本可直接涂片2张,1张暗视野看动力,1张做 GS 镜检,发初 报告:&找到 G-杆菌&. (2)培养物观察 取铜绿假单胞菌,乙酸钙不动杆菌,洛非不动杆菌,粪产碱杆菌分别接种 于普通平板,血平板,MAC 及肉膏汤等培养基35℃培养18-24h 观察记录生 长情况,注意菌落特点有无色素及气味. (3)菌落涂片镜检 取可疑菌落涂片,分别做动力检查及 GS 镜检,注意镜下形态,排列及染色 性. (4)生化反应 取待测菌做氧化酶,硝酸盐还原,精氨酸双水解酶及接种 O/F,KIA,MIU 培 养基,观察并记录反应结果. 4.注意事项(1)非发酵菌的检测鉴定,首先要确定是否为非发酵菌. (2)非发酵菌种类多,分布广,环境中大量存在,故在标本采集,运送,检 测等全过程中严格无菌操作,防止实验室污染. 标本中检出的非发酵菌是否为致病菌需结合临床考虑. 【鉴定依据】 1.非发酵菌的确定 (1)G-大多有鞭毛,动力试验(+)的无芽胞杆菌. (2)葡萄糖 O/F 试验:开口管产酸,封口管不产酸. (3)除个别菌外,氧化酶试验均为阳性. (4)绝大多数菌种 MAC 琼脂平板生长. 2.非发酵菌内常见菌种的鉴定 (1)铜绿假单胞菌 1)根据菌落特征,水溶性绿色色素,特殊的生姜味,细菌形态特点,氧化 酶及糖类发酵试验可做出鉴定. 2)对不产色素的铜绿假单胞菌应具备以下几点: ① 极端鞭毛有动力. ② O/F 开口管产酸,封口管不产酸. ③ 氧化酶试验阳性. ④ 精氨酸双水解酶阳性. ⑤ 42℃生长. ⑥ 其它:硝酸盐还原产氮,麦康凯琼脂平板生长,多粘菌素敏感. (2)不动杆菌根据形态特点为 G-成双排列的球杆菌酷似奈瑟菌,无鞭毛,动力试验 (一).KIA 底层及斜面均不变色.氧化酶试验(一),硝酸盐还原(一),不发 酵糖类等可做出鉴定. (3)产碱杆菌 1)菌落特点,无色素,可有水果香味. 2)形态特点:G-短杆菌,成单,成双或成链排列有周鞭毛. 3)KIA 为产碱型,即底层,斜面均为红色. 4)葡萄糖 O/F 培养基呈碱性反应,氧化酶试验阳性. 3.报告方式:经培养鉴定符合各自的鉴定依据,可报告为:检出???菌. 【临床意义】 非发酵菌种类多,是临床标本中分离出的常见病原菌之一,也是引起医 院内感染的主要因素,掌握非发酵菌的检测,鉴定,对控制其所致的临床 感染及医院内感染具十分重要的意义. 【结果记录和报告】 1.绘出铜绿假单胞菌,乙酸钙不动杆菌,洛非不动杆菌,粪产碱杆菌的镜 下形态. 2.记录铜绿假单胞菌,不动杆菌,产碱杆菌在各种培养基上的生长现象.实验二十 棒状杆菌与需氧芽胞杆菌检验 一,白喉棒状杆菌检验 【目的和要求】 1.掌握白喉棒状杆菌的形态特征,常用染色法,分离培养方法及菌落特点. 2.熟悉白喉棒状杆菌的鉴定试验. 3.了解白喉毒素测定方法. 【试剂与器材】 1.培养基:血液琼脂平板,吕氏血清斜面,亚碲酸钾血平板等. 3.试剂:革兰染色液,阿伯特(Albert)染色液,白喉抗毒素(DAT)等. 4.其他:1ml 注射器,剃刀,豚鼠(或家兔)等. 【实验内容】 一,标本采集:用无菌棉拭从患者咽喉假膜边缘及鼻和鼻咽部位,或其他 可疑病灶处取分泌物送检.若不能立即检查,需将标本浸于无菌生理盐 水或15%甘油盐水中保存. 二,检验程序 咽喉,鼻咽拭子 直接涂片染色 吕氏血清斜面 亚碲酸钾血平板 血平板 (革兰染色+异染 37℃12~48h 37℃24~48h 37℃18~24h 颗粒染色) 涂片染色 观察菌落特点 (革兰染色+异染颗粒染色) 涂片染色镜检 生化反应 毒力试验 图20-1 白喉棒状杆菌检验程序 三,检验方法 1.染色镜检 取标本(咽拭子)或白喉棒状杆菌培养物制成两张涂片,分别作革兰染色和异染颗粒染色(Albert 染色法或 Neisser 染色法),然后 镜检. 2.分离培养 取白喉患者咽拭,鼻咽拭子分别接种于血液琼脂平板,亚碲 酸钾血平板,吕氏血清斜面,35℃孵育48h. 3.生化反应 挑取白喉棒状杆菌菌落分别接种于糖发酵培养基,尿素培 养基等,35℃孵育18~24h.若呈阴性反应则延长至72h 观察结果. 4.毒力试验 白喉棒状杆菌的致病物质是白喉外毒素,毒力试验可检测 临床标本中分离出的白喉棒状杆菌能否产生毒素,因而是鉴定白喉致病 菌株的重要依据. (1)平板毒力法(Elek 平板毒力试验) 白喉外毒素与白喉抗毒素在琼脂平板中扩散,当两者相遇并特异性结合 后,可在平板中形成白色沉淀线.试验方法为: 1)将 Elek 培养基加热融化,冷至55℃左右,加入无菌小牛血清(培养基与 小牛血清之比为5:1),混匀后倾注于无菌平皿制得 Elek 平板. 2)将已浸有白喉抗毒素(500~1000IU/ml)的无菌滤纸条(60?10mm)贴于 平板中央,置37C 孵箱内约30min,烘干表面水分. 3)用接种环取待检菌菌苔划线接种于平板,使划线与抗毒素滤纸条成直 角.线条宽约6mm,线条两端与平皿接触.再以同样方式将阳性对照菌株 (标准产毒白喉棒状杆菌)和阴性对照菌株(不产毒白喉棒状杆菌)平行 划线接种于待检菌两侧,线条间距10~15mm. 4)将平板置于35℃孵育24~72h. (2)动物毒力试验白喉外毒素可导致敏感动物死亡.若体内含有一定量的白喉抗毒素,则 可中和外毒素的毒性,使动物免于死亡.试验方法如下: 1)将待检菌株接种吕氏血清斜面,于37℃培养16～18h,加肉汤1ml,刮下 菌苔,使成悬液,吸取此菌液0.5ml,加入3.5ml 肉汤中,混匀后即可应用. 2)选体重250g 左右豚鼠两只,一只在试验前24h 腹腔注射 DAT 1000U,使 其获得免疫力作为对照动物;另一只不注射 DAT,作为试验动物.接种前 先将动物腹部向上固定在架上,以温水洗净腹部后剃毛.剃毛后再用无 菌生理盐水擦洗一次,待干后用1ml 注射器吸取待检菌液,分别注射 0.1ml 于对照动物和试验动物皮内.注射4h 后,给试验动物注射 DAT 400U, 以免因毒株毒力太强而致死.可同时接种6～8株菌. 3)于注射后24h,48h,72h 观察皮内反应. 四,注意事项 1.为保持白喉棒状杆菌毒力,细菌培养物在室温下放置时间不超过2h, 在4℃不超过4h. 2.毒力试验时,须以标准菌株(中间型 park William No.8菌株)作对照. 3.因白喉棒状杆菌在盐水中易丧失活力,故宜用肉汤制备菌悬液. 【结果判断】 1.染色镜检:经革兰染色,典型白喉棒状杆菌为革兰阳性,菌体一端或两 端膨大呈棒状;经 Albert 染色,白喉棒状杆菌菌体呈绿色,异染颗粒呈蓝 黑色;Neisser 染色菌体呈黄褐色,异染颗粒呈紫黑色. 2.分离培养:白喉棒状杆菌在血平板上形成灰白色不透明 S 型菌落,轻型 菌株有狭窄透明溶血环;在亚碲酸钾血平板上的菌落为黑色或灰黑色;在吕氏血清斜面上形成细小的灰白色菌落. 3.生化反应:白喉棒状杆菌及其他常见棒状杆菌的主要生化反应见下表. 触酶 硝酸盐还原 明胶液化 脲酶 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 甘露醇 木糖 白喉棒状杆菌 + + + + 干燥棒状杆菌+ + + + + 溃疡棒状杆菌 + -/+ + + + 4.毒力试验 (1)平板毒力法:若待检菌菌苔两侧出现白色沉淀线,且与标准产毒株的 沉淀线相吻合,则为阳性.无毒株不出现沉淀线.(2)动物毒力试验:对照动物无论接种有毒或无毒菌株,均应无局部反应, 即阴性;试验动物若注射产毒株,则于24h 左右在腹壁注射部位出现红 肿,48h 在红肿部位边缘有化脓性病变,72h 可见硬块,出现灰黑色坏死斑; 无毒菌株呈阴性,72h 后注射部位无明显病变.若试验动物和对照动物的 注射部位均出现病变,则结果为可疑,可能因注射量过多,抗毒素量过少 或失效所致,应重新试验. 【临床意义】 白喉棒状杆菌是呼吸道传染病白喉的病原菌.此菌主要经飞沫或接触污 染物品而传染,侵入上呼吸道,在鼻咽部黏膜繁殖并产生外毒素.毒素可 使局部毛细血管扩张,充血,上皮细胞发生坏死,白细胞及纤维素渗出, 形成灰白色假膜;亦可侵入血流引起心肌和神经系统损害. 【结果记录和报告】 二,炭疽芽胞杆菌检验 【目的和要求】 1.掌握炭疽芽胞杆菌的形态染色和菌落特征. 2.熟悉炭疽芽胞杆菌的主要生化反应及其他鉴定方法. 【试剂与器材】 1. 培 养 基 : 营 养 琼 脂 平 板 , 血 液 琼 脂 平 板 ,0.5%NaHCO3 血 平 板 , 含 0.05~0.5IU/ml,l5IU/ml,10IU/ml,100IU/ml 青霉素的琼脂平板,各种生 化反应培养基等. 2.其他:青霉素(1IU/片)纸片,炭疽芽胞杆菌噬菌体(AP631)等. 【实验内容】一,标本采集与处理 皮肤炭疽取病灶分泌物,肺炭疽取痰液,肠炭疽取粪便或呕吐物,脑膜炎 炭疽取脑脊液,各型炭疽均可取血液.尸兽可取脏器,但为防止芽胞形成 及扩散,严禁解剖,可在消毒皮肤后割取动物耳朵,舌尖,置于无菌容器 内立即送检.疑被污染的物品或环境等,固体标本取20g,液体标本取 50~100ml. 新鲜渗出液,血液和脏器标本以无菌操作技术制成乳剂,于肉汤中增菌 后在接种至平板分离培养;固体标本按1:20加入生理盐水浸泡研磨成乳 状,水浴加热60℃30min 或80℃5min(杀死繁殖体及其他杂菌,保留炭疽 芽胞活性),再进行增菌和分离培养;脑脊液标本经3 000r/min 离心 30min 后,取沉渣增菌及分离培养;污水标本经3 000r/min 离心30min,弃 去上清,加入0.5%洗涤剂振荡10~15min 后再离心,弃去上清取沉淀增菌 及分离培养. 二,检验程序 皮毛,腐败 血液 痰,呕吐物, 脏器等标本 脑脊液等 肉汤增菌培养Ascoli 试验 以生理盐水制成悬液经 2%兔血清肉 荚膜肿 直接染色镜 检 加温或饱和尿素处理 汤快速增菌 胀试验 (荚膜染色, 血平板或戊烷脒 (37℃,4h) 革兰染色)琼脂平板 动物试验 2%兔血清肉汤增菌 革兰染色镜检 菌落特征 动力观察 生化反应 串珠试验 噬菌体裂解试验 青霉素抑制试验 毒力 试验 图20-2 炭疽杆菌的检验程序 三,检验方法 1.染色镜检 取标本或炭疽芽胞杆菌培养物,涂片作革兰染色,荚膜染色 镜检. 2.菌落观察 取待检标本接种于普通琼脂平板,血平板,重碳酸盐平板. 将普通琼脂平板,血平板置35℃孵育18~24h,重碳酸盐平板置5%CO2环境 中,35℃孵育18~24h. 3.生化反应 取可疑炭疽芽胞杆菌菌落接种于葡萄糖,麦芽糖,果糖,硝 酸盐,葡萄糖蛋白胨水,尿素,柠檬酸盐,明胶等培养基,35℃孵育18~24h. 4.动物试验 动物实验对鉴定炭疽杆菌有无致病性及致病性强弱有重要 意义.将炭疽杆菌纯培养物接种于肉汤培养基,35℃孵育24h 后,吸取细 菌悬液0.1ml 注射于小鼠皮下. 5.其他鉴定试验 (1)青霉素抑制试验 将待检菌分别接种于含青霉素5,10,100IU/ml 的琼 脂平板,35℃孵育18~24h. (2) 串 珠 试 验 将 待 检 菌 接 种 于 含 0.05~0.5IU/ml 青 霉 素 的 琼 脂 平 板,35℃孵育6h. (3)串珠和青霉素抑制联合试验 取待检菌新鲜肉汤培养物0.1ml 滴于已预温的2%兔血清琼脂平板上,用灭菌 L 型棒均匀涂布,稍干后夹取含青霉 素1IU/片的纸片贴于平板上,35℃孵育2h. (4)噬菌体裂解试验 取待检菌的4~6h 肉汤培养物,均匀涂布于含2%血清 的琼脂平板,稍干后滴加炭疽芽胞杆菌噬菌体(AP631),于平板另一处滴 加不含噬菌体的肉汤作阴性对照.35℃孵育18~24h. 四,注意事项 炭疽芽胞杆菌能在有氧的条件下产生芽胞,抵抗力强,能经多途径传染. 检验时除遵守常规实验室规则外,还应注意:①必须按烈性传染病检验 守则操作;②不得用解剖的方式采取标本,所需的血液与组织标本均应 以穿刺方式获取;③操作台应铺来苏尔湿布,操作后将湿布及用过的器 械高压蒸汽灭菌;动物尸体,病变脏器必须火化,以防污染环境;涂片染 色过程中用水冲洗时应冲入专门容器,经高压蒸汽灭菌后再倾倒;④从 事炭疽芽胞杆菌检验的人员应定期接种炭疽杆菌疫苗. 【结果判断】 1.形态染色 炭疽芽胞杆菌镜检呈革兰阳性大杆菌,菌体两端平截,呈链 状或竹节状排列,无鞭毛,芽胞椭圆小于菌体,有毒株在体内或血清培养 基中可形成荚膜. 2.菌落观察 (1)普通琼脂平板 炭疽杆菌经培养形成直径2~4mm,扁平粗糙,不透明灰 白色,无光泽,边缘不整齐的菌落,低倍镜下可见菌落呈卷发状. (2)血平板 35℃孵育12~15h 时无溶血现象,孵育至18~24h 后可见轻微溶 血.(3)重碳酸盐平板 炭疽芽胞杆菌有毒株在该平板上的菌落呈粘液状,圆 形,凸起,有光泽,以接种针挑取菌落可出现拉丝现象. 3.生化反应 葡萄糖 麦芽糖 果糖 硝酸盐还原 VP 尿酶 C 明胶液化 炭疽芽胞杆菌 + + + + 4.动物试验 有毒炭疽杆菌菌液注射于小鼠皮下72~96h 后,动物死亡,解 剖动物见接种部位呈胶样水肿,肝脾肿大,出血,血液呈黑色且不凝固.取心血,肝,脾渗出液涂片染色镜检及分离培养,可检出本菌. 5.其他鉴定试验 (1)青霉素抑制试验 炭疽芽胞杆菌在含5IU/ml 青霉素的琼脂平板上能 生长;在含10,100IU/ml 青霉素的琼脂平板上因受抑制而不能生长. (2)串珠试验 取平板上菌落涂片染色,若镜下见菌体呈大而均匀成串的 圆球状,则为阳性. (3)串珠和青霉素抑制联合试验 揭开平皿盖,将平板置低倍显微镜下观 察,可见青霉素纸片周围出现抑菌环,抑菌环边缘由于青霉素浓度低,菌 体细胞壁受损而呈串珠状.炭疽芽胞杆菌经此试验,出现明显抑菌环,串 珠试验阳性. (4)噬菌体裂解试验 阴性对照处应有菌苔生长;滴加噬菌体处无菌生长 为阳性. 【临床意义】 由炭疽芽胞杆菌引起的人畜共患的炭疽病,属烈性传染病,牛,羊等食草 动物发病率最高.人因食用或接触患病动物及畜产品而感染,其感染途 径多样,临床类型主要有皮肤炭疽,也可见肺炭疽,肠炭疽等,均可并发 败血症或脑膜炎而致患者而死亡. 【结果记录和报告】 三,蜡样芽胞杆菌检验 【目的和要求】 1.熟悉蜡样芽胞杆菌形态染色及菌落特点,常用生化反应及鉴定试验, 活菌计数方法.2.了解蜡样芽胞杆菌肠毒素测定方法. 【试剂与器材】 1.培养基:营养琼脂,血液琼脂,卵黄琼脂,葡萄糖发酵管,甘露醇发酵管, 木糖发酵管,葡萄糖蛋白胨水,柠檬酸盐培养基,醋酸铅明胶培养基等. 2.试剂:革兰染色液,3%H2O2,有关生化试剂,无菌生理盐水等. 3.其他:小鼠,家兔,菌落计数器等. 【实验内容】 一,标本采集 取可疑食物,患者呕吐物及粪便进行检查. 二,检验程序 标本 活菌计数 普通琼脂平板,血平板 直接镜检 可疑菌落 生化反应 报告 图20-3 蜡样芽胞杆菌检验程序 三,检验方法 1.染色镜检 将检样或纯培养物涂片,作革兰染色,镜检. 2.分离培养 将待检标本接种于营养琼脂,血液琼脂,置35℃孵育18~24h. 3.活菌计数 (1)倾注平板法 详见实验四. (2)乳光反应计数法 按&倾注平板法&将检样稀释成不同稀释度,取各稀 释液0.1ml 加于卵黄琼脂平板上,再用 L 型玻棒均匀涂补,置35℃孵育6h.4.生化反应 (1)碳水化合物试验 将蜡样芽胞杆菌分别接种于葡萄糖,甘露醇,蔗糖, 木糖,麦芽糖,水杨苷等发酵管,及葡萄糖蛋白胨水培养基,柠檬酸盐培 养基,置35℃孵育18~24h. (2)含氮化合物试验 将蜡样芽胞杆菌接种于醋酸铅明胶培养基,置35℃ 孵育18~24h. (3)乳光反应 本菌能产生卵磷脂酶,在有 Ca2+存在时,可迅速分解卵磷 脂,生成甘油酯和水溶性磷脂胆碱,形成乳白色混浊环.此即乳光反应或 卵黄反应. 试验方法:用接种针取待检蜡样芽胞杆菌菌落,点种于10%卵黄琼脂平板 上,置35℃孵育3h. 四,注意事项 1.为避免杂菌生长,食物中毒检样在分离培养基时宜使用选择性培养基 (如甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板). 2.对蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的细菌学检验,除分离鉴定细菌及活菌 计数外,必要时还应进行肠毒素测定. 【结果判断】 1.形态观察:镜下可见蜡样芽胞杆菌为革兰阳性大杆菌,两端钝圆,链状 排列,无荚膜.培养6h 后形成芽胞,芽胞位于菌体中央或次末端,小于菌 体.鞭毛染色可见周鞭毛. 2.菌落观察:蜡样芽胞杆菌在营养琼脂平板上生长良好,菌落圆形,隆起, 灰白色,表面粗糙似毛玻璃或蜡滴样;在血液琼脂平板上,菌落周围形成β 溶血环. 3.活菌计数:因暴露于空气中的食品在一定程度上受到蜡样芽胞杆菌的 污染,故不能因分离出本菌就认为是引起食物中毒的病原菌.一般认为, 蜡样芽胞杆菌数大于105个/g(或105个/ml),即有发生食物中毒的可能 性. 4.生化反应 葡萄 糖 甘露 醇 蔗 糖 木 糖 麦芽 糖 水杨 苷 VP 触 酶 醋酸铅明胶培养基H2S 明胶液化 蜡样芽胞杆菌 + + + + + + - + 乳光反应:蜡样芽胞杆菌在卵黄平板上生长迅速,经3h 培养后,虽看不见 菌落,但因卵磷脂被分解,在点种细菌处可见白色混浊环. 【临床意义】 蜡样芽胞杆菌是我国常见的食物中毒病原菌之一.当其在食品中未繁殖 且数量较少时,则无特殊意义.在20~40℃,pH4.0~9.3条件下,本菌污染 食品后可迅速繁殖,并产生大量肠毒素,进食后可引起食物中毒. 【结果记录和报告】 实验二十一 分枝杆菌检验 【目的和要求】 1.掌握结核分枝杆菌的形态学检查法及形态学特征. 2.熟悉结核分枝杆菌的培养特性,常用鉴定方法.3.了解非结核分枝杆菌的鉴定方法. 【试剂与器材】 1.培养基:改良罗氏(L-J)培养基等. 2.试剂:抗酸染色液,金胺&O&染色液,N-乙酰-L-半光胺酸(NALC)溶液等. 3.其他:离心机,水浴箱等. 【实验内容】 一,标本采集 采集肺结核病人痰液,置无菌痰盒或试管内送检.痰液以清晨第一口痰 为佳,且应来自病人肺部,可瞩患者作深呼吸,使肺部充满空气,然后使 劲从肺部深处咳出. 二,检验程序 标本 涂片 分离培养 分子生物学鉴定 处理过的标本直接涂片 集菌涂片 接种固体培养基 染色 鉴定 抗酸染色 荧光染色 报告种别 报告抗酸菌 报告分枝杆菌 图21-1 结核杆菌的检验程序 三,检验方法 1.形态学检查(1)涂片 1)直接涂片法 用接种环挑取肺结核病人痰标本中脓性或干酪样部分, 于载玻片中央均匀涂抹成2.0cm?2.5cm 大小痰膜;若干燥后再涂抹一层 则制成厚膜涂片. 2)集菌涂片法 取痰标本约10ml 装入已消毒的广口瓶中,加5倍量无菌蒸 馏水,121℃高压蒸汽灭菌20min,冷却后供集菌涂片检查. ①离心集菌法 取上述经处理的痰液10ml 放入50ml 离心管内,加蒸馏水 稀释至50ml,3 000r/min 离心30min,弃去上清液,取沉淀物涂片. ②漂浮集菌法 取取上述经处理的痰液10ml 放入100ml 细口玻璃容器中, 加入灭菌蒸馏水30ml,混匀后加入二甲苯0.3ml,置震荡器或手摇震荡 10min,再加灭菌蒸馏水至满瓶口而又不外溢,静置15min,取载玻片盖于 瓶口,静置15min,取下玻片,干燥后染色. (2)染色 1)抗酸染色法(萋-纳染色法) ①初染:将涂片以火焰固定后平放于染色 架或用染色夹子夹住,滴加石炭酸复红染液覆盖痰膜,于载玻片下方以 微火加热至出现蒸汽(勿煮沸或煮干),持续5~10min,冷却,水洗;②脱色: 加3%盐酸酒精脱色至无红色染液脱下为止(勿超过10min),水洗;③复染: 加吕氏美蓝染液复染,直接涂片染0.5min,集菌涂片染1~3min,水洗,待 干后镜检. 2)荧光染色法(金胺&O&染色) ①荧光染色:于标本涂片上滴加荧光染液 金胺&O&,染色10~15min,水洗;②脱色:加3%盐酸酒精脱色3~5min,至无 黄色,水洗;③复染:用对比染液0.5%高锰酸钾复染1~3min,水洗,干后镜检. 2.菌落观察 (1)标本处理(N-乙酰-L-半光胺酸-NaOH 法) 1)试剂配制:0.1mol/L 枸橼酸钠溶液50ml,加4%NaOH 溶液50ml,混匀.临 用前加入0.5g N-乙酰-L-半光胺酸(NALC),混匀得标本消化液.置室温 24~48h 内使用. 2)处理方法:取待检标本10ml,加等量上述消化液,震荡0.5min(若标本 粘稠,可适当延长消化时间),室温放置15min 后加入0.067mol/L 磷酸盐 缓冲液20ml,混匀,2 000r/min 离心15min,弃去上清液.加入少许 PBS 缓 冲液,混匀,接种.也可消化后,不中和,不离心,直接接种. (2)标本接种 取上述经消化处理的标本0.1ml,均匀接种于 L-J 培养基斜面,每份标本 接种2支培养基.将试管倾斜15°角斜置,37℃孵育1周后再直立于试管 架上,继续培养至第8周(初次分离培养需5%~10%CO2). 3.生化反应 耐热触酶试验:某些分枝杆菌细胞内含有耐热触酶,经68℃加热依然保 持活性,能够分解 H2O2 产生大量气泡.从固体培养基上取5~10mg 菌落, 加入含0.067mol/L 磷酸盐缓冲液0.5~1.0ml 的小试管中,制成菌悬液.将 该试管放入68℃水浴20min,取出冷却至室温后,沿试管壁缓缓加入30% H2O2与10%Tween80的等量混合液0.5ml(需新鲜配制).勿摇动,于20min 内观察结果. 四,注意事项1.抗酸染色初染加热时,勿使染液煮沸或煮干,应随时补充染液以防干 涸. 2.染色完毕,可用吸水纸吸干载玻片上的水分,但用过的吸水纸上可能 沾有染色的结核分枝杆菌,故不宜再用于吸干第二份标本,以免发生错 误诊断. 3.接种标本于 L-J 斜面培养基后,应反复倾斜培养基,使标本均匀分布于 培养基表面. 4.为防止结核分枝杆菌引起医源性传播,所有涉及标本的涂片,接种,生 化试验等操作均应在生物安全柜中进行;接种环用后应先放入沸水中灭 菌1min,再于火焰中烧灼,不可直接在火焰上灼,以防止环上菌液爆炸造 成污染. 5.痰标本在培养前进行处理时,不可随意提高试剂的浓度或延长处理时 间,以防止杀伤大多数结核分枝杆菌. 【结果判断】 1.形态观察 镜下观察,在淡蓝色背景下呈红色细长或略带弯曲的杆菌,为抗酸染色 阳性菌.其他细菌和细胞呈蓝色.直接涂片标本中常见菌体单独存在,偶 见团聚呈堆者.若在痰,脑脊液或胸,腹水中查见抗酸菌,其诊断意义较 大.镜下所见结果的报告标准如下: 直接涂片和厚涂片法 表21-1 结核杆菌涂片结果报告方式 染色方法报告方式 镜检结果 抗酸染色法(油镜观察) 仔细观察300个视野(不少于4min)未发现抗酸菌 ± 300个视野内发现1~2条抗酸菌(全部涂膜镜检查3遍) + 100个视野内发现1~9条抗酸菌(全部涂膜镜检查3遍) 2+ 10个视野内发现1~9条抗酸菌 3+ 每个视野内发现1~9条抗酸菌 4+ 每个视野内发现1~9条抗酸菌 荧光染色法(高倍镜观察) 仔细观察300个视野(不少于4min)未发现抗酸菌 ± 70个视野内发现1~2条抗酸菌(全部涂膜镜检查1~2遍) + 50个视野内发现2~18条抗酸菌(全部涂膜镜检查一遍)2+ 10个视野内发现4~36条抗酸菌 3+ 每个视野内发现4~36条抗酸菌 4+ 每个视野内发现36条以上抗酸菌 (2)集菌涂片法 根据镜检结果,按&发现抗酸染色阳性细菌&或&未发现 抗酸染色阳性细菌&报告. 2.菌落观察 结核分枝杆菌在 L-J 培养基上的菌落呈乳白色或米黄色,菌落凸起,表面 干燥,粗糙,颗粒状,形似花菜心. 标本接种后应每天观察细菌生长情况,若发现可疑菌落,经涂片染色检 查见抗酸杆菌,则随时报告&分枝杆菌培养阳性&;培养8周未见菌落生长 者,报告&分枝杆菌培养阴性&.培养阳性者应同时报告生长程度: 表21-2 结核杆菌培养结果报告方式 报告方式 生长结果 菌落个数 斜面上的菌落在20个以下 + 生长的菌落在20个以上,占斜面1/4以下 2+生长的菌落占斜面1/4以上,1/2以下 3+ 生长的菌落占斜面1/2以上,3/4以下 4+ 生长的菌落密集呈菌苔 3.生化反应 耐热触酶试验:加入 H2O2试剂后,液面出现气泡者为阳性,20min 内未出 现气泡者为阴性.人型,牛型结核分枝杆菌为阴性,堪萨斯分枝杆菌呈强 阳性,其他大多数非结核分枝杆菌也呈阳性. 【临床意义】 对人有致病性的主要是人型和牛型结核杆菌.结核分枝杆菌主要通过呼 吸道,消化道和受损伤的皮肤侵入易感机体,引起多种组织和器官的结 核病,其中以通过呼吸道引起的肺结核最多见.部分患者结核分枝杆菌 可进入血液循环引起肺内,外播散,导致肺外感染,如脑,肾结核;若痰菌 被咽入消化道,可引起肠结核,结核性腹膜炎等. 【结果记录和报告】 实验二十二 厌氧菌检验 一,厌氧芽胞梭菌 【目的和要求】 1.掌握破伤风梭菌,产气荚膜梭菌,肉毒梭菌及艰难梭菌的形态特性和 培养特性. 2.熟悉破伤风梭菌,产气荚膜梭菌,肉毒梭菌及艰难梭菌的一般鉴定原则和鉴别要点. 【试剂与器材】 1.培养基:庖肉培养基,血液琼脂平板,牛乳培养基,CCFA(环丝氨素-头 孢甲氧噻吩-果糖-卵黄琼脂)平板,卵黄琼脂平板,五糖(葡萄糖,乳糖, 麦牙糖,甘露醇,蔗糖)发酵管,溴甲酚紫牛乳培养基等. 2.试剂:革兰染色液,芽胞染色液等. 3.其他:凡士林,厌氧袋或厌氧罐,水浴锅,366nm 紫外线灯等. 【实验内容】 一,标本采集 1.破伤风梭菌检验:可疑破伤风患者取感染伤口脓液或坏死组织块. 2.产气荚膜梭菌检验:气性坏疽病患者可采集创伤深部分泌物,穿刺物, 坏死组织块;菌血症患者取血液;食物中毒取剩余食物,患者粪便或呕吐 物. 3.肉毒梭菌检验:取剩余食物,患者粪便或呕吐物. 4.艰难梭菌检验:取患者粪便. 二,检验程序 1.破伤风梭菌的检验程序 直接涂片染色镜检 革兰染色镜检 标本 增菌培养 分离培养 可疑菌落 鉴定 生化反应 其他鉴定试验 动物试验 2.产气荚膜梭菌的检验程序直接涂片镜检 革兰染色镜检 生化试验 标本 分离培养 可疑菌落 鉴定 汹涌发酵试验 卵磷脂酶试验 增菌培养 动物实验 Nagler 试验 3.肉毒梭菌检验程序 直接涂片染色镜检 革兰染色 标本 增菌培养 分离培养 可疑菌落 鉴定 生化试验 动物实验 4.艰难梭菌检验程序 直接镜检 鉴定 标本 分离培养 (CCFA 培养基) 可疑菌落 毒素测定 毒素测定 三,检验方法 1.形态观察:取标本或破伤风梭菌,产气荚膜梭菌,肉毒梭菌及艰难梭菌 的培养物,分别涂片作革兰染色与芽胞染色后,镜检. 2.培养特性观察:将可疑破伤风梭菌,产气荚膜梭菌,肉毒梭菌分别接种 于庖肉培