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聚乙烯亚胺与表面活性剂相互作用的性质研究
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3秒自动关闭窗口几种手性化合物的色谱分离方法研究
陕西师范大学 硕士学位论文 几种手性化合物的色谱分离方法研究 姓名：闫焕英 申请学位级别：硕士 专业：有机化学 指导教师：王伟
几种手性化合物的色谱分离方法研究闫焕英 摘要：手性化合物的存在是自然界的一种普遍现象。随着科学和技术的发展，人们对对映体的分离有了更加深入的认识，在生物化学、药物化学及有机化学中的不对称合成和催化技术中，对映体的分离与分析显得越来越重要。因此对手性 对映体的拆分是很有必要的。目前，用于手性化合物拆分的主要色谱分离方法有 薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳法等。其中薄层色谱、高效液 相和毛细管电泳在目前手性化合物的分离中发挥着极其重要的作用。 本文首先利用毛细管电泳成功地对七种手性化合物进行了拆分，并考察了影 响分离的因素。另外，合成了三种纤维素的衍生物，把它们制成薄层板或将其涂 布在硅胶上，即可得到一类分离范围极广的手性固定相。通过实验条件的优化， 使被分离物质在纤维素衍生物薄层板上得到了很好的分离，并且探讨了纤维素衍 生物手性固定相的分离机理。 本论文研究主要分为四部分： 第一章内容；介绍了手性化合物对映体分离研究的背景、意义和手性化合物 对映体分离的方法。对Ｐｉｒｋｌｅ型手性ＣＳＰＳ，纤维素衍生物类手性ＣＳＰＳ，环糊精 型ＣＳＰＳ，大环抗生素类ＣＳＰＳ等进行了简要的评述。 第二章内容：本章以本实验室合成的ＨＰ．Ｂ．ＣＤ作为毛细管电泳手性分离的手 性选择剂，采用正极进样，利用高效毛细管电泳对氧氟沙星、扑尔敏、苯丙氨酸 等七种手性化合物的分离进行了研究，获得较文献报道要好的分离结果。其中， 组氨酸在没有用荧光试剂对其进行柱前衍生化的情况下，使其达到基线分离。在 手性化合物的毛细管电泳分离过程中，关键的问题是最佳分离条件的选择，在实 际研究中需要大量的实验摸索，我们考察了背景电解质的ｐＨ、手性选择剂浓度及 电解液种类和操作电压等对分离的影响。 第三章内容：以微晶纤维素为原料，苯甲酰氯、对氯苯甲酰氯和邻氯苯甲酰 氯为改性试剂，采用超声方法合成了３种纤维素手性固定相。在合成三（４．氯苯甲 酰基）纤维素和三（２．氯苯甲酰基）纤维素反应中，优化工艺条件，加入催化剂 禾二甲基胺基吡啶，使反应产率大大提高。产物用核磁共振氢谱、红外光谱和元素 分析对它们进行了结构表征。分别将三种手性固定相与一定比例的微晶纤维素混 合制备手性薄层板，得到机械性能好、表面均匀光滑的手性薄层板，用来拆分了８ 种手性化合物，通过色谱条件的优化使２一（９一蒽基）一２一甲氧基乙酸、２一（９一蒽基）一２一 羟基乙酸、苯丙氨酸和萘普生等８种手性对映体达到了完全分离，并探讨了纤维 素衍生物手性固定相的分离机理。第四章内容：合成了手性填料纤维素衍生物，并涂敷于氨丙基硅胶上，制备 成手性固定相。我们通过电子透射显微分析考察了不同涂敷方式（沉积法和蒸发 法）对涂敷型硅胶质量的影响。 最后，对整个论文做了总结。 关键词： 手性固定相纤维素衍生物薄层色谱毛细管电泳手性拆分玎Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｃｈｉｒａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＹａｎ Ｈｕａｎｙｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｔ ｉｓａｎｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｔｈａｔ ｃｈｉｒａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ．ａＷｉｔｈｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｅｏｐｌｅ ｈａｖｅ ｈａｄｄｅｅｐ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏｔｈｅ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔ ｉｓ ｂｅｃｏｍｉｎｇ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏａｎａｌｙｚｅ ａｎｄｓｅｐａｒａｔｅａｓｅｈｉｒａｌｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍｅｄｉｃｉｎａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙｗｅｌｌ ａｓ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｓｉｓ．Ｓｏ ｆａｒ，ａｒｅｃｈｉｌ褂ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓｍａｉｎｌｙｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｔｈｉｎ―ｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＴＬＣ），ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＣ），ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄｈｉｇｈｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ａｎｄＴＬＣ．ＨＰＬＣｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＨＰＣＥ），ｅｔｃ．ａｎｄＨＰＣＥａｒｅｔｈｅ ｍｏｓｔ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｕｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ 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有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。作者签名：！塑壅基第一章手性化合物分离的研究进展１．１引言 手性（英文名为ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，源自希腊文ｅｈｅｉｒ）是用来表达化合物分子结构不对 称性的术语，被认为是三维物体的一个基本属性。如果一个物体不能与其镜像重 合，就称其为手性物体。正如一个人的左手和右手在三维空间中可以对称，但是 不能重合，即左手不能与左手的镜像重合，彼此是实物和镜像的关系。这种关系 在化学中称为“对映关系”，具有对映关系的两个物体互为“对映体”。有很多化合物 分子，构成它们的元素完全相同，但原子排列方式不同，彼此如同镜子内外世界 的对应，也就是具有手性，它们就互称为“对映体”，统称光学异构体，对它们的识 别与区分，通过判别其光学特征进行，分别叫做右旋（Ｄ）、左旋（Ｌ）和外消旋（ＤＬ）。 在自然界中，手性现象无处不在。化合物分子含有某些不对称因素时，该化 合物被称为手性化合物。随着人类在生物工程和生命科学上的发展，科学家己经 认识到，手性化合物例如手性药物异构体尽管其物理和化学性质几乎完全相同， 只有旋光性不同，但他们在生物体内的生理活性和药理作用却存在很大的差别。最经典的例子是ｔＩｌａｌｉｄ锄ｉｄｅｕｌ，也叫反应停，曾在欧洲广泛使用，为孕妇减缓妊娠反应用于临床。结果此后几年中，发现许多早期服用这种药物的孕妇，其婴儿有 严重的畸形现象。１９６１年被禁用。通过研究发现，其Ｒ构型具有良好的镇静作用而 Ｓ构型却导致胎儿畸形。还有像抗心率失常药物心得安（Ｐｒｏｐａｎｏｌ０１）的Ｌ－（一）－异构体药 理活性比Ｄ．（＋）．异构体大１００倍；又如熟知的外消旋的氯霉素的疗效仅为Ｄ－（－）氯霉 素的一半；Ｄ．天门冬素是甜味，而Ｌ坝Ⅱ是苦味１２１；（．）美沙酮是强止痛剂而（＋）美沙 酮则无效，这些研究唤醒了人们对异构体的重视。据统计１３４］，目前所用的各种药 物中，５２３种天然及半合成药中手性药有５１７种，１３２７种全合成药中手性药有５２８种。 而这些手性药物中的７５％－９０％是以外消旋体的形式在市场上销售的Ｉ”。在农药方 面，手性问题也受到广泛的关注。这主要是因为在外消旋体的农药中，其中一半 可能是没有活性的，如果用于洒播在农田，既造成资源浪费，又污染环境。在市 售的近６５０种农药品种中，经证实有１７３个有手性结构，市售的光学性农药只有几 十种。但随着对环境安全、高效、安全的要求，含单一对映体的手性农药将会不 断的发展。鉴于有机分子的构型与其生物活性的的特殊关系，有必要对手性化合 物的各个异构体分别进行考察，了解他们各自的生理活性，以便达到高效、安全、 无污染的用药目的。为此，许多国家都先后规定，在申报手性药物时，必须对不 同光学异构体的生理活性叙述清楚：在制药工业中，必须对有效成分的对映体进 行拆分，而不能将其作为单一药物出售。美国食品与药物管理局（ＦＤＡ）在１９９２年颁布了手性药物指导原则【６】，要求所有在美国上市的外消旋新药，其生产者均需说明 药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。因此建立高专属性，高 灵敏度，高分离度的对映体拆分和测定方法具有重要的理论和实际意义，并且已 成为当今科学领域中的研究前沿。 １．２手性化合物拆分的方法 手性化合物的拆分，就是将一个外消旋体的两个对映体分开，使之成为纯净的 状态［７１。外消旋体的拆分方法有很多种，早期用的大多是直接结晶拆分法：像机械 拆分法、手性溶剂结晶法、接种结晶拆分法；随后又出现了分级结晶法、化学拆 分、生物化学拆分、色谱拆分、萃取拆分以及手性膜拆分，他们都有各自的优点 和缺陷。 直接结晶法是应用最早的手性拆分技术，有多种体系已完成了工业化，但是， 其操作烦琐、流程过长、热量消耗大等缺陷直接制约了它的发展。 分级结晶法是手性化合物的经典拆分方法，即通过与一光学纯试剂反应，生 成非对映异构体，利用他们物理性质的差异达到分离的目的。但这种方法有很多 缺点：光学纯试剂较昂贵、操作费时、后处理麻烦、局限性较大。 化学拆分法是目前应用最广的拆分方法，从简单的化工原料到结构复杂的手 性药物都有化学拆分法的报道，但是由于化学拆分试剂的应用，不但使这种方法 成本高，对环境也有相当大的破坏作用，而且大部分化学拆分法过程冗长，产率 通常不高，对映体光学纯度不高，适用的化合物类型不多，所以化学拆分法的应 用范围在不断缩小滞Ｊ。 生物化学拆分技术的优点是反应条件温和、收率高，并且一般不会造成环境 污染。但不足之处是可利用的酶制剂品种有限、酶易被破坏、容易失活等，限制 了生物化学拆分的推广１９Ｊ。 随着现代科学技术特别是仪器分析技术的发展，科学家们已经把注意力集中 在手性化合物的色谱分离方法的研究上。不对称合成的发展也促进了手性色谱法 的建立以测定合成的起始物、中间体和最终产物。色谱技术已成为当前手性分离 的主要工具，手性分离也成为色谱科学的重要的研究对象。 目前，常用的有薄层色谱（ＴＬＣ），高效液相色谱（ＨＰＬＣ），气相色谱（ＧＣ）以及最 新发展的高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ），ＨＰＣＥ集分离与测定于一体，可实现复杂基质下 对映体的定性、定量及纯度的测定。其中，高效液相色谱（ＨＰＬＣ）手性分离研究开 展较早，其分析范围广，速度快，操作简单，几乎可以分析所有手性化合物，对 手性物质的分析及分离方面具有决定性优势，因此一直成为研究的热点。气相色 谱虽然也是Ｅ１前用于分析的主要手段，但是它限于挥发性组分的分析，限制了其２应用。这里重点介绍薄层色谱（ＴＬＣ）拆分法、高效液相色谱（ＨＰＬＣ）拆分法和高效毛 细管电泳（ＨＰＣＥ）拆分法。 １．２．１薄层色谱（ＴＬｃ）拆分法 ＴＬＣ是最简便的色谱技术之一，其分离方式有手性试剂衍生化（ＣＤＲ），手性流 动相添加剂法（ＣＭＰＡ）和手性固定相法（ｃｓＰ）等，用的较多的是ＣＳＰ法。薄层色谱具 有操作简便、设备简单、分析速度快、结果直观、能快速更换流动相系统等特点， 已在化学、化工、生化、医药卫生等各个领域广泛使用。董先明等利用薄层色谱 定性分析萘普生合成中的十种中间体监测反应程度的进行，分析效果较好［１０ｌ。 尽管手性固定相价格、紫外背景、显色剂等原因使的目前能用于ＴＬＣ的手性载 体和能被ＴＬＣ分离的手性化合物很少，但可以预见它将会成为手性拆分的重要手段 之一，在光学异构体的分离、分析及光学纯度的测定中发挥重要的作用。 手性固定相薄层板常用的有：（１）纤维素板及预涂纤维素的薄层板，可用于 拆分氨基酸及其衍生物，二肽等对映体。（２）浸渍手性选择剂的手性薄层板，主 要是浸渍有ａ．氨基酸烷基衍生物的铜（１１）复合物的薄层板。（３）分子印迹法是 制各具有高选择性的合成高分子的方法。戎非【ｌｌ】等分别以右旋扁桃酸、右旋邻氯 扁桃酸和右旋对氯扁桃酸为模板，丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯为功能单体 和交联剂合成分子印迹聚合物，并以此作为薄层色谱手性固定相。研究了模板分 子消旋体在手性固定相上的分离情况。（４）将手性选择剂化学键合到载体上，进 行对映体分离的化学键合手性薄层板主要有Ｂ．环糊精键合相薄层板、Ｐｒｉｃｋｌｅ型薄 层板和萘乙基脲型薄层板，朱全红将ｐ．ＣＤ键合相用苯基异氰酸及３，５．二硝基苯 甲酰氯进行衍生化，制备了衍生化的Ｂ．ＣＤ键合相薄层板，在反相色谱条件下分离 了氨基酸对映体及一些临床常用的手性药物对映体【坦’１３１。徐莉等用三一（３，５一二硝基 苯甲酰基）纤维素薄层色谱分离了６种手性对映体，取得了很好的分离效果１１４Ｊ。 １．２．２毛细管电泳（ＣＥ）拆分法 ＣＥ又叫高效毛细管电泳（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＥｌｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＨＰＬＣ），是近年来发展最快的分析方法之一ｌ”１，是８０年代经典电泳技术和现代微柱分离相结 合的产物。近年来，ＨＰＣＥ已经发展成为可以与２０世纪５０年代末、６０年代初出现的 气相色谱（ＧＣ）以及２０世纪７０年代初出现的液相色谱（ＨＰＬＣ）相媲美的一种分离技 术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究领域之一。其所以如此，主要 是因为ＨＰＣＥ具有五个方面的突出特点： （１）更适合分析大分子样品。ＨＰＣＥ不仅能分析ＨＰＬＣ胜任的中小型分子样品， 而且还能更快速、高效地分离分析ＨＰＬＣ等技术不易分析的大分子样品（如核酸、蛋 白质、多肽类药物等）。（２）基本不存在柱污染的问题。ＨＰＣＥ所采用的毛细管柱易于全面清洗，不需考 虑中药样品、生物样品和蛋白质样品对柱子造成的污染，只需进行简单的样品前 处理或不需进行样品前处理。 （３）分析速度快、分离效率高。ＨＰＣＥ的分析时间ＬＥＨＰＬＣ短，而且柱效高，通 常理论塔板数在１０５以上。 （４）实验成本低，消耗少。ＨＰＣＥ分离多在水介质中进行，消耗的大多为价格低 廉的无机盐类，毛细管长度仅为６０．７０ｃｍ，内径２０．７５ Ｉ．ｔｍ，容积仅有几此，进样量 在“Ｌ级或ｎｇ级。 （５）操作模式多。只需更换毛细管内溶液的种类、浓度、酸度或添加剂，就可 实现一台仪器多种分离模式。下面简单回顾一下ＨＰＣＥ的发展历史，并总结了ＨＰＣＥ 的分离模式，综述了ＨＰＣＥ在药物分析中的应用。 如果以毛细管区带电泳的出现为起点，毛细管电泳（ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）技术的起源可以追溯到２０世纪６０年代中期，瑞典科学家Ｈ．ｅｒｔｅｎ首先提出毛细管 区带电泳的概念。我们今天所说的现代毛细管电泳是由Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ和Ｌｕｋａｅｓ［临１８ｌ 在１９８１年创立的。他们使用７５１ａｍ内径的玻璃毛细管，用电迁移法窄带进样，以 荧光检测器进行在线检测，使丹酰化氨基酸得到了高效的分离，其理论塔板数超 过４００，０００／ｍ，这样高的柱效是以前的分离方法从未达到的。正是他们十分成功的 实验和异常出色的理论工作，使高效毛细管电泳技术跨入了飞速发展的黄金时期。 特别是１９８４年Ｔｅｒａｔ）ｅ１１９１开创了以胶束电动毛细管色谱（ＭＥＫＣ）以来，在ＣＥ中应 用环糊精（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，简称ＣＤ）分离手性异构体的研究日益增多。此后，毛细管 电泳技术得到飞速发展，在常规药物分析和其他药物研究中发挥着独特的作用， 如以治疗为目的的某一类药物的代谢物组学、药代动力学研究、药品质量控制、 生物制品、毒物及滥用药物的定性定量分析等。ＣＥ具有高效、快速、微量、多模 式、经济、自动化及洁净等优点【２０ｌ。随着与之相关的一系列分析方法和检测联用 技术的不断改进，ＣＥ在化学、生命科学、临床医学、药学等领域得到了广泛的应 用。按分离原理的不同，电泳可分为四种类型：区带电泳（Ｚｏｎｅ）、移动界面电泳（ＭｏｖｉｎｇＢｏｕｎｄａｒｙ）、等速电泳（ＩＴＰ，Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）和等电聚焦电泳（ＩＮ，Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）。对于它们的原理在此作一简单介绍： （１）区带电泳是不同的溶质在均一的缓冲溶液系统中分离成独立的区带，如 果用光密度计扫描可以得出一个个互相分离的峰，与洗脱色谱的图形相似。电泳 的区带随时间延长和距离加大扩散严重，影响分辨率。 （２）移界电泳，它只能起到部分分离的作用，迁移到毛细管最前面的成分有 部分是纯的，其他则互相重叠，各界面可用光学方法显示。４（３）等速电泳原理是，样品离子置于前导和终末电解质之『自ｊ，在电泳达到平 衡后，各迁移率不同的离子前后相随，以等速移动。它的区带没有重叠，是依次 排列。 （４）等电聚焦电泳的原理是被分离的离子和两性电解质溶液混合装入毛细管， 在电场的作用下，不同等电点的两性载体电解质自动形成梯度，被分离离子各自 移至其等电点，形成很窄的区带，分辨率很高１２ｌＪ。 毛细管电泳手性分离有两种基本策略，一是构建手性分离环境，二是手性消 除。手性消除反应需要昂贵的手性反应试剂，产物的手性不易恢复。构建手性环 境只需将手性物质引人至ｔＪＣＥ分离通道中，样品通过手性相互作用来改变迁移速度， 最终获得分离，不触及样品本身，具有简便、快速、高效、发展空间大等特点， 已被普遍采用并迅速发展。较常用的有毛细管区带电泳法（ｃｚＥ）。胶束电动色谱法 （ＭＥＣＣ）和毛细管电色谱法（ＣＥＣ）。 毛细管区带电泳法ＣＺＥ是ＣＥ中最基本、最普遍的一种模式。各类手性试剂加 入到缓冲液中，实现多种手性异构体的分离：胶束电动色谱法（ＭＥＣＣ）涉及电渗电 泳和色谱分配过程，在缓冲液中加入表面活性剂形成胶束相，分离机理为分析物 在水相和胶束相中多次分配以达到分离目的。胶束体系可分为单一胶束、混合胶 束和微乳体系［２２１。ＣＥＣ是将固定相填充于毛细管柱内或涂布、键合于其内壁，以 电渗流或电渗流结合压力流推动流动相、溶质，根据它们在固定相和流动相之间 的分配及自身电泳淌度的差异而得以分离。ＣＥＣ具备ＨＰＬＣ高选择性，同时具备近 于ＨＰＣＥ的高柱效。 随着毛细管电泳技术的发展，它除了在分析对象和应用广度上有很大的拓展， 还在分离理论、人工智能优化分离参数、毛细管电泳结合动力学和热力学等理论 研究方面有很大的发展１２３１。如Ｔｒａｐｐ利用动力学色谱和毛细管电泳技术测定了速率常数，进而直接计算得到甲琉丙脯酸异构化的势垒刚；Ｍｕｚｉｋａ等采用实验设计和人工神经网（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｎｅｕｒａｌｎｅｔｗｏｒｋ，ＡＮＮ）相结合的方法，优化了三乙醇胺铬酸盐的缓冲液，对高浓度氯离子的溶液中含有的硫酸盐进行了测定瞄Ｊ。黄芳理论计算出 扑尔敏对映体与Ｂ．环糊精的结合常数，从理论上优化扑尔敏的最佳分离条件１２６ｊ。 １．２３高效液相色谱（ＨＰＬＣ） 高效液相色谱手性固定相分离测定对映体速度快、柱效高、适用范围广（可以 用于对热稳定性差和极性农药的分析）且分离能力强，ＨＰＬＣ比ＧＣ法更具有优越性 ［２７－３３１。于是也就成了手性药物分离的首选技术平台之一。高效液相色谱较气相色 谱和电泳技术应用广泛的原因，一是由于所有药物，当然包括手性药物，进入生 物体都是经由生物体的体液来运输而进一步产生作用而决定的，所以几乎所有手５性药物都能在高效液相色谱方法中找到适合于其本身特点的分离环境，从这一点 说高效液相色谱优于气相色谱；二是高效液相色谱更易实现生物样品的在线预处 理肩ｇ实现高度的自动化，现在已经发展成对映体分离比较迅速的领域之一。高效 液相色谱直接拆分法包括手性固定相法和手性流动相添加剂法：手性固定相法是 基于样品与键合到或涂敷于载体表面的手性选择剂间形成暂时的非对映体络合物 的能量差或稳定性不同而达到手性分离；手性固定相法具有很强的特征性，一个 固定相往往只能拆分一类或几类对映体。手性流动相添加剂法是通过对映体与添 加剂流动相中的手性物质形成一对非对映体络合物，由于非对映体络合物的稳定 性在流动相中溶剂化作用或络合物与固定相的键合等性质的差异而得到分离。 利用ＨＰＬＣ拆分对映体的方法通常有３种：一是利用手性试剂与被拆分物进行 柱外衍生化反应生成非对应异构体，从而可被传统的非手性ＨＰＬＣ拆分：二是在流 动相中加入手性添加剂，其可产生非对映体离子对或络合物，便可在色谱上进行 分离；三是利用手性固定相（简称ＣＳＰＳ）直接对对映体进行拆分。最简便和最有效 的方法是手性固定相法（ＣＳＰＳ．ＨＰＬＣ）１３４】。ＣＳＰＳ．ＨＰＬＣ法之所以能拆分对映体，是 因为在ＣＳＰＳ与外消旋体相互作用时，其中一个对映体与ＣＳＰＳ生成不稳定的对映体 复合物，造成在柱淋洗时保留时间不同，从而达到拆分的目的。目前，高效液相 色谱直接拆分手性化合物在药物工业，不对称合成和生物化学方面起着非常重要 的作用。具有不对称手性中心或手性识别能力的手性固定相的开发与研制，是手 性色谱研究的前沿。 目前，手性固定相法直接用于对映体的拆分，具有操作简单，对映体不用衍 生化、定量分析准确、手性色谱柱可长期使用等优点。但手性柱制备困难、实验 成本高；手性流动相添加剂法拆分光学对映异构体不需手性试剂衍生，也不需价 格昂贵的手性柱，而是将手性试剂添加到流动相中，用普通的正相或反相柱分离， 方法简单有效，但需价格不菲的手性添加剂。因此，开发能拆分范围广、价格能 被普遍接受的新型手性选择剂、或几种不同手性选择剂的联合使用、对分离机理 的研究以及新型、高灵敏度的检测方法和联用技术是这一领域研究的热点。可以 预见，随着ＨＰＬＣ的不断完善，它必将成为色谱技术发展的一个新方向，手性分离 也将会进入一个新的发展阶段。 １．３常见手性固定相和手性添加剂 手性固定相可由具有光学活性的小分子和聚合物来制备，将手性化合物通过 化学键合到或吸附到硅胶载体上而得至ＩＪＣＳＰ。在过去的２０．３０年中，已开发出多种 类型的商效液相色谱手性固定相【３ ５１。ＨＰＬＣ手性固定相的分类，根据不同的目的， 有不同的分类方法，如被广泛采用的Ｗａｉｎｃｒ分类方法，是按照手性固定相与溶质６之间的相互作用机理而分为五类。第一类为给体一受体ＣＳＰ［３””，如Ｐｉｒｋｌｅ型ＣＳＰ， 被分析物与ＣＳＰ之间通过吸引．排斥作用，主要是丌电子给体－受体机理，形成短暂 的络合物。第二类为纤维素衍生物类ＣＳＰＳ［３ｓ－３９１被分析物是通过吸引作用被包容到 固定相的手性空腔中。第三类为主客体络合ＣＳＰＳ［４¨”，如环糊精ＣＳＰＳ、冠醚类 ＣＳＰＳ，形成的是包容络合物。第四类为手性配体交换色谱ＣＳＰＳｌ４２Ｊ，溶质是所形成 的非对映异构金属络合物的一部分。它是将一个手性氨基酸接到苯乙烯一二乙烯 苯聚合物载体上，经吸附Ｃｕ２＋ｇＪ￡Ｎｉ２＋之类的中心金属离子，来拆分氨基酸对映体。 另外还可以拆分一些药物。第五类为蛋白质类ＣＳＰＳ，溶质与ＣＳＰＳ通过疏水和极性作 用的结合形成化合物。Ａｌｌｅｎｍａｒｋ等以牛血清蛋白（ＢＳＡ）通过氨基同硅胶键合作为 ＨＰＬＣ的ＣＳＰＳｌ４３１，可以分离一系列氨基酸对映体，在许多氨基酸对映体的拆分中 这类ＣＳＰ都显示了很好的对映体选择性和拆分效果。 下面仅就蛋白质型ＣＳＰＳ，刷型（又称Ｐｉｒｋｌｃ型）ＣＳＰＳ，纤维素衍生物ＣＳＰＳ，环 糊精型ＣＳＰＳ，大环抗生素类ＣＳＰＳ，以及其它类型的ＣＳＰＳ［４４１作一简单介绍。 １．３．１蛋白质型ＣＳＰＳ 许多小的手性分子与血清白蛋白、Ｑ．酸性糖蛋白等具有立体选择性的亲和力。 用化学的方法将蛋白质键合到硅胶或其它基质上，即可得到一类很有发展前景的 蛋白质手性固定相。在这一类手性固定相分离手性对映体时，其流动相在绝大多 数情况下是含有低浓度的有机溶剂的缓冲液。当蛋白质手性固定相的柱效很好时， 与蛋白质的亲和力差别很小的对映体都可以得到良好的分离。蛋白质手性固定相 色谱的另一优点是在键合蛋白质保持其原有的结合能力和流动相不影响其手性作 用时，通过色谱参数的测定可以推断蛋白质与药物相互作用的信息１４”。１．３．２Ｐｉｒｋｌｅ型ＣＳＰＳ这类固定相的研究，主要贡献应归功于美国Ｉｌｌｉｎｏｉｓ大学的Ｐｉｒｋｌｅ ｗ．Ｈ．研究组， 因此称为Ｐｉｒｋｌｃ型或多种作用手性固定相。而且，Ｐｉｒｋｌｃ还运用非对映异构体化合物 作用的分子模型和对同一系列的各种外消旋体物质的研究，阐明了这类ＣＳＰ的手性 识别机理，其立体识别基于三点作用原理。图１．１给出了３，５一二硝基苯酰基苯甘氨酸 离子（ａ）或共价（ｂ）键合到氨丙基硅胶上的一种Ｐｉｒｋｌｃ型ＣＳＰ的结构。 在手性液相色谱领域，Ｐｉｒｌｄｅ型ＣＳＰＳ是目前使用量大、适用面广、对手性识别 机理揭示较深的一类重要ＣＳＰＳ。它们具有确定的化学结构，其共同结构特征是在 手性中心附近至少含有下列基团之一：ｎ．酸或Ⅱ．碱芳基：极性氢键给体一受体； 形成偶极相互作用的极性基团；大体积非极性基团，提供立体位阻、范德华力作 用或构型控制作用。在该类ＣＳＰＳ上的对映体分离通常通过以下几种作用而发生： （１）被分离溶质与ＣＳＰＳ芳环的舡受体和舟授体之间的丌嘎作用；（２）ＣＳＰＳＪ２的仲胺、７羰基基团与溶质的酸性质子、羟基、氨基之间的氢键作用；（３）偶极一偶极作用；（４） 大体积非极性基团靠近ＣＳＰＳ手性中心而产生的空间立体效应。删ｌ礼ｐｐ。心ｉ～妒、ｐ。１．３．３纤维素衍生物类ｃｓＰＳ １．３．３．１纤维素乙酸酯衍生物手性固定相 纤维素和直链淀粉本身具有手性识别能力，Ｄａｌｇｌｉｅｓｈｌ４６１曾用纤维素作为手性 吸附剂直接分离氨基酸对映体。但不能作为实际适用的固定相，然而它们的衍生 物作为ＣＳＰＳ具有较高的手性识别能力，能拆分大量的对映体。纤维素三醋酸酯 （ｃＴＡ）是第一个被研究的纤维素衍生物手性固定相，可由微晶纤维素的乙酰化得到。 尽管部分乙酰化的纤维素手性识别能力很低，但１９７３年，ＨＥＳＳＥ和ＨＡＧＥＬ［４７－４９］ 发现非均相条件下制备的具有微晶结构的纤维素三乙酯（ＭＣｎ显示较高的手性识 别能力，对映体化合物可以结合到ＭＣＴ的空穴而达到手性分离。ＴｒＯｇｅｒ７Ｓ碱在这种手性固定相上得到了完全的分离，这种手性固定相特别适合于分离芳香手性化 合物１４””。Ｈｅｓｓｅ和Ｈａｇｅｌ认为ＣＴＡ．Ｉ的微晶结构对于手性识别是必须的，但后 来发现，当ＭＣＴ溶于溶剂并吸着到硅胶上，或者将在均相条件下反应获得的ＣＴＡ－ ＩＩ直接装柱，虽然手性选择性有所降低，但仍然对很多外消旋体表现出了不同于 ＭＣＴ原来的手性识别能力【５２－５３１。他们把这一改变归因于纤维素三乙酯的构象发生 改变。另外将ＣＴ缸Ｉ涂敷到硅胶上，Ｘ．射线晶体分析表明，涂敷在硅胶上的ＣＴＡ 主要是无定形的Ｉ州，这种涂敷型的ＣＴＡ由于传质阻力减小，柱效大大提高，也更 加耐用。这一结果清楚地表明，纤维素衍生物手性固定相光学拆分能力很大程度 上依赖于高度有序的结构。纤维素三乙酯的晶体结构与手性识别能力归结有如下 关系：（一）ＭｃＴ手性识别能力随结晶度的增加而降低；（－－）ＭＣＴ即使在均相条件 下制备也有手性识别能力；（三）通过涂敷于硅胶会产生高的柱效。 １．３．３－２纤维素苯甲酸酯衍生物手性固定相 纤维素苯甲酸酯衍生物手性固定相是研究较多的纤维素类衍生物，结构如图 １．２。在各种纤维素苯甲酸酯中，纤维素三苯甲酸酯和它们的衍生物被吸附在大孔８硅胶时，显示很好的手性识别能力【５５－５６】，羰基是最重要的活性点，苯环上的取代 基可以改变羰基的极性。苯基上有给电子基（如甲基）时比吸电子基（如氨基）手性识 别能力高，因此增加羰基氧原子上电子云密度可能是重要的。这类ＣＳＰＳ可以与有 羰基的消旋化合物通过偶极相互作用，与有氨基的化合物通过氢键相互作用而达 到拆分对映异构体。纤维素的３．或４．甲苯基甲酸酯也能拆分各类外消旋体。此外， 这类衍生物的手性识别能力还受到制备过程的影响。Ｃｈａｎｋｖｅｔａｄｚｅ等人１５ ７Ｊ研究了涂 敷型和键合型纤维素三（４．甲基苯甲酸酯）ＣＳＰ，得到正相条件下，涂敷型纤维素三（４． 甲基苯甲酯）ｃｓＰ优于键合型。■１－２坪畸ｔ掌，■膏舯生●Ⅲ１ｊ爵ｔ蠹摹■■ｔ■ｔ膏＊生韵１．３．３．３纤维素苯基氨基甲酸酯类衍生物手性固定相 纤维素三（苯基氨基甲酸酯）（ＣＴＰＣ）及其衍生物是目前研究最多的手性固定相 领域，结构如图１．３。这类衍生物可以容易地由苯基异氰酸酯以及苯环上取代的苯 基异氰酸酯制备出来，将其涂敷于硅胶上即可【５８－５９］。苯基氨基甲酸酯的光学分辨 能力，也依赖与苯环上的取代基，对于给电子基，如烷基特别是叔丁基衍生物或 吸电子基如卤素的衍生物，比非取代基的苯基氨基甲酸酯衍生物显示出更高的手 性识别能力１６０１。ＣＴＰＣ上最重要的吸附位点是邻近手性单元的氨基甲酸酯残基，这 种残基极性还受到苯环上取代基影响【６”。如果苯环上存在给电子基，羰基电子云 密度增高；若有吸电子基，－ＮＨ的酸性增高，存在极性基团的对映体主要通过氢键 与氨基甲酸酯相互作用；另一方面苯基上引入甲氧基或硝基，手性识别能力低。 可能是由于对映体与远离手性多糖主链的取代基相互作用，降低了ＣＳＰ的手性识别 能力。可见在苯环上引入体积大的烷基如异丙基，由于立体障碍抑制对映体与醚 氧键相互作用，从而改善了ＣＳＰ光学拆分能力。在纤维素苯基氨基甲酸酯的苯基不 同位处引入甲基，结果表明：在３．或４一位时手性识别能力提高，在２－位时低，这可 能由于２．位上甲基立体效应阻碍了高度有序纤维素苯基氨基甲酸酯衍生物的形成。 在纤维素苯基氨基甲酸酯系统中，规则有序的结构有利于获得高的手性识别能力， 而不规则的高分子则总是难以达到有效的分离１６２－６４１。 １．３．３．４混合型纤维素酯和芳烷基氨基甲酸酯（ＣＳＰＳ） 由于纤维素葡萄糖结构单元上的一个伯羟基和两个仲羟基的反应活性不同，９若采用区域选择非均一衍生化方法，分别将伯羟基与仲羟基与不同底物反应，则 可得到混合型纤维素衍生物。１９９３年，Ｋａｉｄａ等１６５】首先在纤维素上引入混合取代基， 结果表明这些手性固定相对许多对映体具有良好的拆分能力。Ｃｈａｓｓａｉｎｇｔ删比较了 氨基甲酰化和苯甲酰化纤维素ＣＳＰ的分离性能，结果表明６位的取代基对手性识别 非常重要，在６位增加手性碳可以增加对映体选择性。他们还制备出新的纤维素６． （Ｒ－苯乙基氨基甲酸酯）－２，３－（３，５－二甲基氨基甲酸酯）ＣＳＰ，其拆分对映体的 效果甚至好于相应的Ｃｈｉｒａｃｅｌ商品ＣＳＰ。Ｍｕｒａｔ等采用区域选择性取代法，合成了纤 维素一２，３一双芳基氨基甲酸酯．６．Ｏ．芳基酯类和纤维素．２，３．双芳基酯．６．Ｏ．芳基氨基 甲酸酯类，它们比纤维素三（３，５．二甲基苯氨基甲酸酯）ＣＳＰ具有更高的对映体选 择性。Ｏｋａｍｏｔｏ等曾经研究了纤维素芳烷基氨基甲酸酯类手性固定相，发现甲基和 异丙基衍生物手性识别能力低，而苯基、１．苯乙基、１．苯丙基、甲基１．苯丙基、１．１． 二苯甲基氨基甲酸酯衍生物用作ＣＳＰ时，苯乙基和苯丙基对光学异构体拆分能力较高。１．３．４环糊精型ＣＳＰＳ 环糊精（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｄｎ，简称ＣＤ）是由环糊精葡萄糖基转移酶（ＣＧＴ）作用于淀粉 所产生的一组环状低聚糖。最早由Ｖｉｌｌｉｅｒ于１８９１年发现，１９５２年Ｃｒａｍｅｒ首先提出环 糊精对光学异构体具有良好的手性识别作用。环糊精独特的环状分子结构具有选 择性包合化合物（包括手性化合物）的特点，并且多个手性Ｃ原子构成了良好的不对 称环境，使其在分离对映体方面取得一系列成果。天然的环糊精熔点高，结构单 一，直接应用于气相色谱固定相受到限制，因此常常将其衍生化【６７－６９］。许多环糊 精衍生物已被设计和合成，以便扩展原有的分子识别能力１７＂¨。环糊精取代基的 位置及引人基团的性质将深刻影响改性后的环糊精的各种性状，成为影响其手性 选择性的主要因素。环糊精是使用最多的一类手性拆分剂，常用做毛细管的手性 添加剂，它是由多个Ｄ．（＋）．吡喃葡萄糖单元以伍．１，４一糖苷键首尾相连形成的环状低 聚糖，最常见的三种ＣＤ是ａ．，Ｂ．和Ｙ．ＣＤ，分别含有６，７，８个葡萄糖单元及３０， ３５和４０个手性中心【７２－７３１。有关这三种ＣＤ的结构参数和物理化学特性见表１．１，三者 的化学结构图见图１．１。表Ｉ－Ｉ ａ．，８一，Ｔ－ＣＤ的一些主要物理性质ＣＤ类型 葡萄糖单元数分子量水中溶解度（ｇ／１００ｍＬ，室温）ａ－ＣＤ ６ ９７２ １４．５Ｂ―ＣＯ７ １１３４ １．８５ ２９８ｙ－ＣＤ８ １２９６ ２３．２ ２６７熔点（℃）２７８１０比旋光度【ａ】Ｄ２’笼穴直径（Ａ） 筒高度（Ａ） 筒外径（Ａ） 笼穴体积（Ａ）＋１５０．５＋１６２．Ｏ ６．０－６．５＋１７７．４ ７．５?８．３４．７．５．３ ７．９ １４．６１７４７．９ １５．５ ２６２７．９ １７．５ ４７２蛰谗Ｂ―ＣＯ ＿卜ＣＤ田１?＇??，－－和Ｙ?耳椭的持构录ｔ田从环糊精的ＣＰＫ模型看，环糊精分子颇象一个内空去顶的锥型圆筒（图１．２）为 ８．ＣＤ立体模型），根据ｘ射线分析，ａ．ＣＤ，８－ＣＤ，Ｙ．ＣＤ的分子空腔内大约为４．５Ａ， ７．０Ａ和８．５Ａ［７４１，不过能够自由旋转的伯羟基基团通常会影响环糊精分子内腔的有 效尺寸１７钉。在环糊精分子的环形结构中，极性羟基位于环糊精单位的边缘，仲位 和伯位极性羟基从边缘伸出，因此单体的外表面（顶部和底部）具有亲水性。又由于 氢和配糖的氧位于空洞内部，因此单体内部的空洞具有较高的电子密度和疏水性。啊１．２ Ｉ．ＣＯ的立体结柯蠢所以环糊精是腔内疏水、腔外亲水的两性分子。这表明ＣＤ的上、中、下三层分别 由不同的基团组成。通常情况下，ＣＤ分子中一个葡萄糖单元上的２．ＯＨ易与相邻葡 萄糖单元上的３．ＯＨ形成氢键。在１３－ＣＤ中，整个分子中的仲羟基可形成一个首尾 相接的分子内氢键【７６１；在ａ．ＣＤ中，因为有一个葡萄糖单元处于扭曲的位置【７７Ｊ整 个分子只能形成四个氢键，在Ｙ．ＣＤ中，整个分子的结构柔性较大，分子内的氢键 作用也相对较弱，这也是Ｄ．ＣＤ在三个常见的环糊精分子中刚性最强而溶解性最差 的原因。Ｂ．环糊精的特殊分子结构，致使其具有有限的溶解度，并且可以使具有 与适当大小、形状和疏水性分子非共价地与之相互作用而形成稳定的包合物。因 此，环糊精可以与各种生理活性物质形成包囊物，可以加强活性物质的稳定性， 改善其色泽、外观、气味等物理性质，还可以使一些液体活性物质传变成固体粉 末状，以满足某些场合下的特殊要求。由于ｎ．ＣＤ空腔较小、Ｙ．ＣＤ空腔较大但刚 性不足，１３．ＣＤ的空腔较适宜且在生产中最易获取，因此，１３．ＣＤ的应用最为广泛， 也是目前世界上产量最大的环糊精衍生物。由于含有多个羟基，故能溶于水。连 接两个葡萄糖单元的氧原子的孤对电子朝向内腔，产生高电子云密度，与多种有 机化合物有偶极．偶极作用，因而形成包合化合物。关于环糊精的手性拆分的主要 依据是对映体分子与环糊精分子形成包合物，衍生化环糊精对对映体的识别时起 作用点主要在ＣＤ的手性部位。主要做为手性添加剂应用于ＨＰＣＥ中，下面简单介 绍各种类型环糊精衍生物在ＨＰＣＥ中的具体应用。 １．３．４．１阴离子修饰ＣＤｓ 负电性环糊精衍生物是最常用的手性选择剂，磺烷基醚衍生化ＣＤｓ，磺化ＣＤｓ 和羧基衍生化ＣＤｓ磺丁基一ｐ．ＣＤ（ＳＢＥ．ｐ－ＣＤ）是一种在ｃＥ中应用较广泛的带负电的 环糊精衍生物｜７引。它在很宽的ｐＨ范围内均能解离而带负电，且紫外和荧光透明， 已被用于多种手性化合物的分离。且磺酸基团的亲水性使其在水中溶解度大大提 高，ＳＢＥ一１３＿ＣＤ在ｃＥ中的电泳迁移方向和电渗流相反，可同时分离酸性和碱性的手 性药物，尤其是对除草剂有很好的立体选择性１７９１，并且在拆分ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐｉｐｅｒｄｉｎｅ对映体时比天然ｐ．ＣＤ或烷基化．ｐ．ＣＤ更加有效脚ｊ，仅５ｍｇ／ｍｌ的ＳＢＥ―ｐ―ＣＤ就可使草萘胺和哗啶草对映体完全分离。Ｔａｉｔｌ８ｌｍ肄研究了中性ｃＤ衍生物（ＤＭ―Ｂ―ＣＤ）和带负电的ＳＢＥ．Ｂ．ＣＤ手性选择性的差别，实验结果表明，要获得同样的分离 所需的ＳＢＥ．ｐ．ＣＤ的浓度比ＤＭ．１３．ＣＤ低得多。这是由于ＳＢＥ－争ＣＤ所表现大的逆流 迁移率而不是使用ＳＢＥ．８．ＣＤ时键常数的增加。在手性分离衍生化哌啶时， ＳＢＥ．ｐ．ＣＤ被发现比ｐ．ＣＤ和烷基化的ｐ．ＣＤ更合适有效ｍｌ。在分离麻黄生物碱时， 他们对手性选择剂ＤＭ．ｐ．ＣＤ和ＳＢＥ．ｐ．ＣＤ进行了比较【鲫。结果表明，在碱性条件下， 用ＳＢＥ．ｐ．ＣＤ作为选择剂，获得了最好的分离。在碱性ｐＨ值下，碱性药物拥有自己１２的电泳迁移率，且不会吸附在毛细管壁上。与ＤＭ．ｐ．ＣＤ相比，ＳＢＥ．ｐ．ＣＤ可以在更 宽的ｐＨ范围内使用，因此可以选择一个ｐＨ不仅对手性分离是足够的，而且使相似 的物质同时得到了分离。磺酸化环糊精在整个ｐＨ范围内均呈负电性，Ｓｔａｌｃｕｐ等人 合成了取代度在７．１ｌ之间的磺酸化环糊精Ｓ０３．８．ＣＤ，并在ｐＨ为３．８时对５６个外消旋 体进行了拆分【ｓ埘。Ａｕｍａｔｅｌｌ等用ＨＰ．Ｂ．ＣＤ或ＳＢＥ．Ｂ．ＣＤ作为手性选择剂分离了几种 １３－ａｇｏｎｉｓｔｓ激动剂，ｐ－ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ拮抗剂，ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅｓ苯异丙胺类，ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ镇静 剂和它的代谢物。他们发现，ｐｎ＝２．５时，用ＳＢＥ．Ｂ．ＣＤ作为手性选择剂，只有带正 电的化合物才能获得手性分离。ｍ，ｑ３．ＣＤ比ＳＢＥ．Ｂ．ＣＤ具有更好的手性选择性，用 ＨＰ。ｐ．ＣＤ可以分离４２种药物，而ＳＢＢＢ．ＣＤ仅仅能分离２０种药物［８６１。有关磺化．争ＣＤ （Ｓ．Ｂ．ＣＤ）作为手性选择剂的报道较少，磺化ＣＤｓ在整个ｐＨ范围内带负电，且运动 方向与电渗流方向相反。其取代度大约为７．１１。在中性或碱性条件下，用未经处理 的毛细管，ｓ－１３．ＣＤ作为手性选择剂，在阴极端检测，许多药物获得的手性分离１８”。 随着手性选择剂浓度增加，迁移时间、手性选择性和缓冲溶液的离子强度都有所 增加，后者导致了电渗流的减少。研究表明，Ｓ一１３．ＣＤ可以分离大量的结构不同的 电中性的和阳离子的分析物。ＣＤ的电荷对手性识别起着重要的作用，Ｓｃｈｉｍｉｔｔ和 Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ［”ｌ使用ＨＰ．ｐｃＤ研究了电荷对手性分离的影响，发现在低ｐＨ下（ｐＨｄ，于 ４），羧甲基基本上不电离，其分离类似于中性ｃＤ衍生物。当ｐＨ增加（ｐＨ大于５）－ 时，羧基发生解离，得到一个带负电的衍生物，以假固定相的方式移动。这种迁 移率随ｐＨ改变的优点之一在于可以使对映体迁移顺序发生逆转。 １．３．４．２阳离子修饰ＣＤｓ 阳离子修饰ＣＤｓ在实际中应用的不多，主要有含氨基ＣＤｓ、烷氧基ＣＤｓ。 Ｔｅｒａｂｅ［８９１首次使用带正电荷的环糊精６．【（３一氨基一乙基）氨基］－６一脱氧基－ｐ－ＣＤ （６．【（３一ａｍｉｎｏ－ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］－６一ｄｅｏｘｙ―ｐ―ＣＤ，ＡＥＡ－ｐ―ＣＤ）分离了丹酰化氨基酸。６一氨基 ．６．去氧．ｐ．ＣＤ（６０ＮＨ２．ｐ．ＣＤ）作为手性选择剂，识别联萘衍生物的轴平性效果很好 １９０１。Ｈａｙｎｅｓ［９１１等人合成了一种新的带正电的ｃＤ衍生物七（６一甲氧基乙基氨基一６一脱 氧基）．ＩＢ－ＣＤ（Ｅｔ－ＮＨ－１３．ＣＤ），它能使一些非甾族的、具抗炎作用的手性药物得到很 好的分离，如对布洛芬、酮洛芬两种药物的分离度分别高达１１和１４。Ｇａｌａｖｅｒａｎ等 人合成了两种带正电的３－ＣＤ衍生物１９２１：６．脱氧基．６．氮一组胺基－１３－ＣＤ。 （６－ｄｅｏｘｙ．６－Ｎ．ｈｉｓｔａｍｉｎｏ．ｐＣＤ，ＨＭ．ｐ．ＣＤ）和６一脱氧基．６－［４．（２．氨基乙基）咪唑基．争ＣＤ（６－ｄｅｏｘｙ－６－（“２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｙ］一ｐＣＤ，ＭＨ―ＩＢ－ＣＤ），并成功的分离了丹酰化氨基酸，实验表明后者的分离能力高于前者，且出峰次序与前者正好相反。 最近，林秀丽【９３ｌ等人合成了一种新型阳离子型Ｂ．ＣＤ衍生物：２．（Ｎ．胺乙基一Ｎ一代丙酮 基）．２．羟丙基一Ｂ．ＣＤ，它对于一些酸性手性药物如华法令、萘普生等有很好的分离能力。 １．３．４．３中性ＣＤｓ 这一类ＣＤｓ主要有甲基化ＣＤ（Ｍｅ－ＣＤ），羟丙基ＣＤ（ＨＰ．ＣＤ），羟乙基ＣＤ（ＨＥ－Ｃ Ｄ）。Ｆａｎａｌｉ等【９４】研究了几种药物麻黄碱、降麻黄碱等的分离，研究表明，在手性选 择剂ｐ．ＣＤ，ＤＭ．ｐ．ＣＤ和ＴＭ．ｐ．ＣＤ当中，只有ＤＭ．ｐ．ＣＤ可以使被研究的化合物获得 基线分离，并且随着手性选择剂浓度的增加，分离度提高。此外，ＣＤ棱上羟基和 甲基同时词在对对立体选择性至关重要。Ｖａｌｋｏ等用取代度在３．７．３之间的不同的 ＨＰ．ｐ―ＣＤ，分离了几种衍生的羟基酸对映体，结果显示，取代度最高的ＨＰ．ｐ．ＣＤ在 最高的浓度显示了最低的手性分离能力。王志等１９５］应用ＣＤ．ＣＺＥ对手性药物盐酸美 西律和盐酸异博定的对映体进行分离时发现ＨＰ．Ｂ．ＣＤ的分离效果最好。Ｇｕｔｔｍａｎ等 用ＤＭ－１３．ＣＤ作为手性选择剂，在有效长度为７ｃｍ的毛细管内，仅用４０ｓ的时『自ｊ基线 分离ＴＭｅｔａｐｒｏ－ｔｃｒｅｎｏｌ对映体，被称为超速分离［９６１。与中性ＣＤｓ衍生物比较，带电 的ＣＤｓ用于毛细管电泳手性分离更有效，发展也很迅速。 １．３．４．４两性ＣＤｓ Ｌｅｌｉｅｖｒｅ［９７１等人合成了两性的环糊精：单一（６一谷氨酰基氨基一６一脱氧基）．Ｂ．ＣＤ （Ｍｏｎｏ一（６－ｇｌｕｔａｍｙｌａｍｉｎｏ一６一ｄｃｏｘｙ）一１３一ＣＤ，简写为ｐ?ＣＤ―Ｇｌｕ），因为它在ｐＨ＝２．３时带 正电，在ｐＨ＝１０．３．１１．２时带负电。１３－ＣＤ．Ｇｌｕ成功地分离了一些中性对映体。 １．３．５大环抗生素ＣＳＰｓ大环抗生素自１９９４年由Ａ肌ｓ仃ｏｎｇ及其合作者最先将利福霉素Ｂ（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ Ｂ）用于毛细管电泳手性添加剂，自此在分离科学领域中立即引起高度重视［ｇｓ－９９１。它 们不仅像环糊精一样可拆分许多化合物，还具有多个手性中心和化学官能团，可 与被拆分物之问产生多种相互作用，从而使许多手性化合物有更大的选择性，得 到更好的拆分效果。目前用于ＣＥ中的大环抗生素主要有两类：安莎霉素类（Ａｎｓａｒ ｎｙｃｉｎｓ）和糖肽类化合物（Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）。安莎霉素类主要是利福霉素Ｂ（Ｒｉｆａｍｙｃｉｎ Ｂ．） 与利福霉素ＳＶ（Ｒｉｆａｍｙｃｉｎ ＳＶ．）糖肽类化合物包括阿福霉素（Ａｖｏｐａｒｃｉｎ）、太古霉（Ｔｅｉ ｃｏｐｌａｎｉｎ）／１００１。瑞斯托菌素Ａ（Ｒｉｓｔｏｃｅｔｉｎ Ａ．Ｖ１０１１及其衍生物阿可他霉素Ａ（ＡｃｔａｐｌａｎｉｎＡ．）、万古霉素（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）及其衍生物Ａ８２８４６Ｂ和ＬＹ３０７５９９。这些化合物均有多个立体中心和官能团可与手性分子多方面作用，在水中呈现碱性、酸性或中性， 特别是糖肽类大环抗生素，可以通过疏水性、偶极匹配、ｎ．Ⅱ键、氢键等与手性 分予相互作用，从而达到良好的拆分效果。此外，氨基糖苷类抗生素卡那霉素 （Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、新霉素（Ｆｒａｄｉｏｍｙｃｉｎ）、链霉素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）也已作为手性选择剂应 用在ＣＥ手性拆分中。１４１．３．６其它类型ＣＳＰｓ １．３．６．１低聚和多聚糖类 低聚糖是由环状己糖通过糖苷键连接而成的线型低聚物，与环糊精不同的是 没有疏水空腔，一般随链的增长分离效率增加，这可能是链增加．手性作用点增加 的结果，但链增长，聚合度升高，水溶性会下降，低聚或聚合糖对阳离子型药物 以及一些具有生理活性的化合物的选择性与环糊精相似，但仍然有环糊精不能分 离而糖类能分离的报道，特别分离一些具有手性基团的单糖时，一般的手性选择 剂很难达到目的，而使用低聚糖却能很好的分离。 一些学者对水溶性好的低聚糖进行了筛选发现只有麦芽糖糊精具有良好的分 离性能，这是由玉米淀粉经过水解得到的一类以Ｄ．葡萄糖通过ａ－（１，４）糖苷键结合 相连接而成的线性低聚物，通常为混合物。Ｓｏｉｎｉ等证实了麦芽糖糊精的螺旋结构 和对映体相互作用导致手性分离。此外有的学者用肝素和带电的低聚糖衍生物作 为手性选择剂。 １．３．６．２金属离子络合物 １９８６年Ｇａｓｓｍａｎ等首先以【广组氨酸作配体，Ｃｕ作中心离子分离１０种丹酰化氨基 酸。这是利用手性金属络合物能与手性分子发生配体交换络合作用而达到分离目’的Ｉ１０２１。１．３．６．３蛋白质 常用的蛋白质有人血清蛋白、牛血清蛋白、卵类粘蛋白半清蛋白等等。近来 国内有部分学者利用鸡蛋清也达到对部分手性化合物分离目的，蛋白质通常作为 添加剂的形式加入到缓冲溶液中，成为亲合毛细管电泳形式。也有人将其吸附到 毛细管上，类似于开管电色谱由于蛋白质有很强的紫外吸收，使用浓度有一定的 限制。 １．３．６．４手性杯环芳烃类 杯芳烃是酚类通过醛结合在一起具有类似于冠醚和环糊精的洞穴结构的一类 化合物，洞穴内部是苯环电子云高度集中区域，上口小，带有极性经基，下部开 口大，是亲脂性烃基。同冠醚和环糊精一样对其他化合物具有包结作用，被称为 第三代主客体化合物。已经广泛用于气相色谱【肼Ｊ，由于大多杯芳烃是疏水的，往 往引入亲水性基团才能在毛细管电泳中利用，目前国内的报道主要以磺化杯芳烃 为主１１０４１。另一方面杯芳烃刚性较差，由于具有紫外吸收而限制了它的应用。除了 上述选择剂外，分子印迹聚合物以及其它带手性碳原予的化合物也作为手性选择 剂用于毛细管电泳或其它色谱方法中１１０５。吲。另一方面人们将结构与上述选择剂相 似的化合物或将它们进行改造达到了许多新的选择剂。目前的主要工作集中在仪器的改进、寻找新的手性选择剂以及在生物学领域的应用几方面【ｌ¨１０８１。 １．４小结 由前面的综述可知：ＣＥ无需使用价格昂贵的手性色谱柱或大量的手性流动相 添加剂，且具有耗费少、方法灵活、分离效率高适应性广等优点。在手性拆分中 已经显示了强大的实力。具有广阔的应用前景。尤其环糊精应用于手性拆分技术 进行对映体拆分是近期手性拆分领域的一个热点。另一方面高效液相色谱手性固 定相法拆分对映体有高效、快速、准确的特点，开发适用范围广或针对性强的手 性固定相，对手性化合物的合成监测及其研究等具有重要的意义，也是我们研究 的主要方向。涂敷型是高效液相色谱固定相的一种主要形式，以纤维素衍生物为 代表的涂敷型固定相拆分能力强，实用范围广，针对进口国外商品化手性柱价格 昂贵的现实，本论文的立题在于制备具有一定拆分能力、成本较低的色谱柱替代品。１６第二章高效毛细管电泳法拆分手性化合物２．１引言高效毛细管电泳（ＣＥ）统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依 据样品各组分之间趟度和分配行为的差异而实现分离的方法，高效毛细管电泳ＣＥ 仪器组成及其简单，只要有一个高压电源、一根内径为５０．１００１ｘｍ的石英毛细管柱、 一个检测器和两个缓冲溶液瓶，就能进行毛细管电泳实验。下面对毛细管电泳分 离主要的基础理论进行简单的介绍。 ２．１．１基本原理 ２．１．１．１双电层和Ｚｅｔａ电势 由界面化学可知，固体与液体接触时，固体表面分子离解或表面吸附溶液中 的离子，在固液界面上形成双电层。双电层【１０９１是浸没在液体中的所有固体表面都 具有的一种特性。在一般的缓冲溶液中，毛细管中的熔融二氧化硅表面带负电荷， 负电荷表面在溶液中积聚相反电荷的阳离子，形成双电层，不论是带电粒子的表 面还是毛细管壁的表面都有双电层。 在电解质中的任何带电粒子都可被看成是一个双电层系统的一部分，在这个 系统中，粒子自身的电荷被异号的带电粒子中和，这些异号离子中有一些被不可 逆的吸附到粒子上：而另一些则游离在粒子附近，并扩散到电介质中进行离子交 换。“固定”粒子有一个切平面，它和离得最近的游离离子之间的电势则被称为 粒子的Ｚｅｔａ电势（０。可表示为：Ｆ：！坐’（２一１）￡其中６．扩散层厚度；ｃ．溶液中每单位面积总的过剩电荷；￡－介质的介电常数 由公式（２．１）可以看出，熔融二氧化硅表面的Ｚｅｔａ电势正比于它表面上的电 荷数与扩散层厚度的乘积，同时又受到管壁材料及其特性、电解液成份及浓度、 电解液ｐＨ值、电解液中阳离子和熔融二氧化硅表面间的平衡等因素的影响。Ｚｅｔａ 电势是毛细管电泳中的一个重要参数，对控制电渗流、优化分离条件有实际指导 意义。 ２．１．１．２电泳 导电流体中，荷电粒子在外加电场作用下的泳动现象叫电泳。由于电泳速度 与外加电场强度有关，所以在毛细管电泳中常用淌度ｌｌ来描述荷电粒子的电泳行 为与特性。电泳淌度定义为单位场强下离子的平均电泳速度，即１７Ｅ“ｅｆ＝――Ｖｃｆ（２．２）附：上’（２－３）６ｎＴＩＲ其中ｑ一离子电荷，１１一溶液粘度，卜离子半径。对给定的粒子和介质，迁移率是常数， 只是与粒子本身的性质有关，小的、高电荷的粒子具有高的电泳迁移率，反之， 具有小的迁移率，溶质的有效迁移率，与缓冲溶液的ｐＨ值和溶质的ｐＫａ有关。 ２．１．１．３电渗 毛细管中电渗流（ＥＯＦ）是这样形成的：处于扩散层中的阳离子在外加电场作 用下，以剪切面为分界面，朝向阴极与紧密层（Ｓｔｅｍ层）作相对运动，但这些阳 离子是溶剂化的，当它们沿剪切面作相对运动时，就携带着电解质溶液一起向阴 极迁移，从而形成电渗流，ＥＯＦ速度Ｖｃｏ与Ｚｅｔａ电势有如下关系：ｖ铲三坐（２－４）ｑ其中Ｅ、ｅ、ｇｏ、％、ｑ分别为电场强度，介电常数，真空介电常数、Ｚｅｔａ电位、介质 粘度。 由公式（２－４）可见，影响ＥＯＦ速度的主要因素有：电场强度、管壁Ｚｅｔａ电势 和溶液特性，因此常用以下几种方法来控￥１］ＥＯＦ：（１）改变电解液的成分和浓度；（２） 改变电解液ｐＨ值；（３）］ＪＩＡ．添加剂；（４）改变温度等。电渗是伴随电泳产生的一种电 动现象，在毛细管电泳分离中扮演着重要角色。多数情况下，ＥＯＦ速度比电泳速度 快５―７倍，因此，在毛细管电泳中利用ＥＯＦ可将正、负离子和中性分子一起朝一个 方向产生差速迁移，同时完成正、负离子的分离分析，其示意图如下图所示：样品Ａ。和Ｂ＋ ＝，蕾Ｅ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝Ａ‘ＥＯＦ ｔ＝０ ｔ＝ｔｍ釜Ｂ＋２．１．２毛细管电泳的分析参数 ２．１．２．１迁移时间 溶质从进样端迁移到检测点所需要的时间称为迁移时问ｔ仁――ｍＶ ＩＬ （２－５）１８Ｉ．毛细管有效长度；Ｌ．毛细管总长；Ｖ－分析电压：ｕａ－表观迁移率 毛细管电泳使用在柱光学检测器，毛细管的有效长度，是指从进样点到检测 点的长度。 ２．１．２．２柱效 电泳是基于溶质的迁移率不同而进行分离的，两个电泳区带的分辨率与区带 宽度有关，而区带宽度在很大程度上取决于扩散过程，因此柱效主要与分子扩散 有关，柱效用理论塔板数Ｎ表示：Ｎ＿Ｐ，，ＥＬ （２．６）‰．表观迁移率；Ｅ＿电场强度；Ｌ毛细管有效长度：Ｄ．溶质分子的扩散系数。公式 表明高电场可以使柱效增加，这是因为在高电场下溶质在毛细管中的时间短，扩 散小。另外，方程也表明了大分子（如蛋白质）由于扩散系数小，在同样条件下 其柱效比小分子大。 实际理论板数可直接由电泳图测得：Ｎ＝５．５４（彘）２ｔ－迁移时间；ｗｌ，２．半峰宽‘２?７’实际上，公式（２．７）测得的柱效总是小于方程（２．６）计算的柱效，主要是由 于理论计算仅考虑分子扩散而在实际电泳过程中还存在其他因素的影响。 ２．１．２．３分辨率 ＣＥ与色谱一样，用分辨率表示分离的好坏，分辨率Ｒｓ定义为：Ｒｓ：！！！！＝尘（２．８）ＷＩ＋Ｗ２ｔ一迁移实际；ｗ．基线峰宽（时间）；脚标ｌ、２９别代表两个峰。公式（２＿８）中的 分子代表迁移时间之差，分母代表其扩散大小。 ２．２实验部分 ２．２．１试剂与仪器 ｐ．环糊精（ｐＣＤ）， 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 浓磷酸，三乙醇胺超纯水（Ａ．Ｒ．） （Ａ．Ｒ．） （Ａ．Ｒ．）， （Ａ．Ｒ．）上海山普化工有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 西安化学试剂厂仪器ＰＨＳ．３Ｃ型精密ｐＨ计，上海精密科学仪器有限公司； ＣＡＰＥＬ．１０５型高效毛细管电泳仪，俄罗斯Ｌｕｍｅｘ公司：１９未涂层石英毛细管柱６０ｃｍ×７５ｔｔｍ（Ｌ，Ｄ）（有效长度５５ｃｍ），河北永年光导纤维 厂： Ｍｉｌｌｉ．ＱＡｃａｄｅｍｉｃ超纯水制备系统，美国密里博公司： ＫＱ－４００ＫＤＥ型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司） 样品：普萘洛尔，氧氟沙星，扑尔敏，苯丙氨酸，萘普生，托品酸和组氨酸 对映体 ２．２．２实验方法 ２．２．２．１样品和缓冲溶液的配制 样品预先配制成］ｇ／Ｌ的储备液，使用时稀释到Ｏ．０２９／Ｌ 缓冲液配￥１Ｊ３种体系：Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４；Ｈ３Ｐ０４－Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ）３：ＮａＨ２Ｐ０４－ Ｎａ２ＨＰ０４。样品和缓冲溶液在使用前用０．４５ｐｒｏ的滤膜（水系）过滤，使用前在超声 波上脱气５．１０ｒａｉｎ。 ２．２．２．２电泳条件 毛细管使用前用０．Ｉｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液、Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸和超纯水各冲洗３ｍｉｎ， 缓冲液平衡３ｍｉｎ，每次分析后用超纯水和缓冲液各冲洗３ｍｉｎ，再进行下次分析， 进样压力３０ｍｂａｒ，进样时间３ｓ： ２．２．２．３所研究的手性化合物的结构ＣＩＨ３ｃ、Ｎ７、、Ｌｌ！ｌＦｈ（２）＠Ｖ”、Ｈ，／ｃＨ。ｒ乔驯ＯＨＩ毗眦‰．，ＣＨａ飘犬： 乏ＮＨ叉犬：！Ｉ： ｅ扩洲州№‰３（４）２０邺。ｏ了洲∞洲心≮吖洲Ｏ（５）ｏ＠（’７）图２．１手性化合物的结构式 （１）：氧氟沙星（２）：扑尔敏（３）：普萘洛尔（４）：组氨酸（５）：托品酸（６）：萘普生 （７）：苯丙氨酸２．２．２．４电解液种类的选择 电泳过程是在电解液中进行的，因此电解液的种类对于粒子的迁移、分离效 率和分离度都有很大的影响，故电解液是毛细管电泳分离条件选择中首先要考虑 的问题。目前电解液的选择尚无严格的规律可循，一般而言，应考虑以下问题： （１）Ｚｅｔａ电势对ｐＨ很敏感，而分离过程是在一个相对稳定的ｐＨ条件下进行的， 所以要求电解质有一定的ｐＨ调节范围，并在该ｐＨ范围有足够的缓冲容量。 （２）组成电解液的物质在所用检测波长处无紫外吸收或吸收较小。这样可以使 背景无吸收或吸收小，检测灵敏度高。 （３）组成电解液的物质电导尽量小，以减少焦耳热的产生，这样就允许使用较 高的外加电压，以提高分离度。 （４）尽量使电解液的电渗淌度与溶质电泳淌度相匹配，以减小由电分散作用引 起的区带展宽，提高分离的柱效率。 基于以上要求，因此本实验选择了磷酸．磷酸二氢钠、磷酸．三乙醇胺和磷酸二 氢钠．磷酸氢二钠三种缓冲盐体系。 ２．３结果与讨论 ２．３．１磷酸．磷酸二氢钠缓冲体系对手性化合物毛细管电泳分离的研究 我们考察了在Ｈ３Ｐ０４一ＮａＨ２Ｐ０４体系中影响手性对映体拆分的几个因素。 （一）环糊精分子不同取代度对分离的影响 以环糊精为手性选择剂的毛细管区带电泳手性分离的拆分机理主要是基于包 合络合机理，在电泳过程中对映体与环糊精之问形成非对映异构体的包合络合物，２ｌ包合络合物稳定常数的不同决定了它们的分离。所以取代程度的不同必然会影响 其对手性对映体的拆分能力，本节采用ｐＨ值为２．７的５０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｉ－．１．，；Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４磷 酸盐缓冲体系为背景电解质，分别考察了１５ｍｍｏｌ／１＿，羟丙基一Ｂ．环糊精（ＨＰ．Ｂ．ＣＤ） （１）（２）（３）（４）（５）（６）（７）（８）（９）（１０）共十种不同取代度的环糊精对几种手性化合物分离的 影响，结果如图２－．１所示。表２一ｌ环糊精不同取代度对手性化合物分离的结果图２－２环糊精取代度对手性化合物分离的影响 电泳条件：５０ｒｅｔ００１．Ｌ＿ｌＨ３Ｐ０４．Ｎａｌｌ：脚ｌＳｍｍｏｌ／ＬｌｉＰ－Ｂ．－ＣＤ，．１５ＫＶ．，ｐＨ＝２．７，２５＂Ｃ，２１４ｒｉｍ，３０ｍｂａｒ压力进样，３ｓ由表２－１和图２－２可以看出，随着取代度的增加，手性化合物的分离度不是呈线 性增加的，这与文献报道的分离度随取代程度的增加而增大的结果不一致，氧氟 沙星、扑尔敏和普萘洛尔是随着环糊精取代度的增加，分离度先增大后减少，中 等取代度的环糊精有利于分离，原因可能是随着取代程度的增加，环糊精分子中２，３，６位取代同时增加，三个取代位置的作用不一致，另一方面，环糊精的ＨＰＣＥ拆 分机理是包含络合作用，取代基增多到一定程度，使其空间位阻增大，不利于ＨＰ． Ｂ．ＣＤ与手性化合物之间发生作用。而组氨酸随着环糊精取代度的增加，分离度也 是先增大后减小，但是低取代度环糊精对它的拆分有效。原因可能是组氨酸的分 子小，在低取代的时候，包合络合作用已经很强，取代程度的增加反而不利于组 氨酸对映体的拆分。 （－－）背景电解质ｐＨ对手性化合物分离的影响 ｐＨ值在分离过程中是一个重要参数，电解液ｐＨ值会影响溶质所带电荷的数目 和电性，进而影响其电泳行为。不同的电解液ｐＨ值会使溶质带有不同的有效电荷， 而离子的电泳淌度直接正比于它的有效电荷，这样就会影响其在电场中的迁移速 率。对于有等电点（ＰＤ的溶质，ｐＨ值的变化还会改变其电性，当缓冲液的ｐＨ低于 溶质的ＰＩ值时，溶质荷净正电荷，粒子朝阴极迁移，电泳淌度与电渗流（ＥＯＦ）同向， 粒子迁移的总速度为电泳淌度和电渗流之和；当电解液的ｐＨ值高于溶质的ＰＩ值时， 溶质荷净负电荷，粒子朝阳极迁移，电泳淌度与ＥＯＦ反向，粒子迁移的总速度为二 者之差。 对于碱性药物的分离，【ｏＨ］越小，对映体之间的迁移率差值越大，即当ｐＨ值 越低时，分离度越大，越有利于对映体的分离。在本章选用ｐＨ值为２．７左右的缓冲 液，因为在低ｐＨ时，碱性药物及其与环糊精所形成的配合物均带正电，在电场中 向负极迁移，同时未结合的中性环糊精与电渗流同速亦向负极移动，由于在此ｐＨ 下电渗流变得更小，使得待分离药物在电泳过程中与环糊精的作用时间变长，从 而有利于分离，另一方面，此ｐｎ值接近缓冲液的ｐＫａ－值，此时缓冲溶液具有较大 的缓冲容量，从而可以减小在电泳过程中由于电解作用所引起的ｐＨ变化。 本章节考察了缓冲液ｐＨ对几种碱性药物对映体的迁移时间和分离度的影响。结果见图２．３。图２―３背景电解质ｐＨ对手性化台物拆分的影响 电泳条件：前三者５０ｍｍ０１．Ｌ～Ｈ３Ｐ０４．ＮａＨ２Ｐ０４＋２０ 组氨酸：５０ｍｍ０１．Ｌ－１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ＝８．７ＨＰ．Ｂ．ＣＤ，Ｈ３Ｐ０４．ＮａＨ２Ｐ０４＋２０ ｍｍｏＶＬ ＤＳ＝４．８ＨＰ．１３一ＣＤ，１５ＫＶ，２５＂Ｃ＇２１４ｎｍ，３０ｍｂａｒ，压力进样，３ｓ图２．３显示了背景电解质ｐＨ值对氧氟沙星，扑尔敏，普萘洛尔，组氨酸等分离 度的影响。前三者随着ｐＨ的增加，分离度先增大再减小，ｐＨ在３左右时分离度最 大。ｐＨ值对分离时间的影响也呈先增大后减小的趋势。这是因为碱性化合物的有 效迁移率随ｐＨ值的增大而减小，相反，电渗流迁移率随ｐＨ值的增大而增大，当两 者之和最小时，迁移时间最长。由于组氨酸的等电点是７．５９，不属于碱性物质，它 受ｐＨ值的影响与前三者不同，随着ｐＨ值的增加，组氨酸的分离度有增加的趋势， 其原因有待于进一步探讨。 （三）分析电压对手性化合物分离的影响 在焦耳热可以忽略的前提下（如低电解液浓度，小孔径毛细管），外加电压与迁 移时间、柱效和分离度的关系式如下所示风：占ｆ卦２ｆ耵牟 ４√２ ＬＤ／Ｌｔ：／ｔ：分离度，ｋ．两组分区带迁移时间差。 由公式（２－５），（：－９）其中ｔｍ．迁移时间，Ｌ．毛细管的总长度，ｌ一毛细管有效长度，Ｄ．溶质的扩散系数，Ｒｓ．（２－６）和（２－９）可知，溶质迁移时间随电压的升高而减小，而柱效和分离度随电压的升高而增大，且与外加电压存在近似的线性关系。但在 较高电解液浓度下（如高于７０ｍｍｏｌ／Ｌ），由于焦耳热效应的影响，电压与分离度就 会大大地偏离线性，且电压的升高会导致产生的焦耳热增多，使毛细管在不能有 效地驱散所产生的焦耳热情况下，柱温显著升高，从而导致电解液电导增加，电 流增大，粘度减小，双电层增厚，使毛细管内形成径向温度梯度，这些变化的综 合效应就使得柱效和分离度降低。我们试验以取代度为８．７的ＨＰ．Ｂ。ＣＤ作为手性选 择剂，在恒温下，考察了分离电压对手性化合物分离的影响。结果见图２．４。图２－４操作电压对手性化合物分离的影响 电泳条件：前三者５０ｒｅｔ００１．Ｌ．１Ｈ３ＰＯ，－ＮａＨ２ＰＯ，＋２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ＝８．７ ＨＰ－１３－ＣＤ， Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４＋２０ ｍｍｏｌ／Ｉ．，ＤＳ＝４．８ ＨＰ－ｐ－ＣＤ，组氨酸：５０ｍｍ０１．Ｌ＂１ｐＨ＝３．０，２５＂Ｃ，２１４ｎｍ，３０ｍｂａｒ压力进样，３ｓ由图２４可以看出，当电压过高或过低时都不能达到分离的目的，电压过高时， 一方面电流强度大，焦耳热导致温度升高，一般认为样品和手性选择剂形成络合 物的过程为放热过程，从而会导致选择性随温度的升高而减小，而且缓冲溶液温 度升高时样品易扩散，使柱效降低，从而影响分离。另一方面，由原理可知电场 强度大，电渗速度快，故样品迁移速度变快，从而选择性降低。电压过低则迁移 时间延长，样品扩散，分离效率降低。这个可以从图２．５看出。图２－５电压对迁移时间的影响 电泳条件：前三者５０ｍｍ０１．Ｌ－ＩＨ，ＰＯ，－ＮａＩ－１２Ｐ０４＋２０ ｍｍｏＦＬ Ｄｓ＝８．７ ＨＰ．Ｂ．－ＣＤ， Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４＋２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ＝４．８组氨酸：５０ｍｍ０１．Ｌ．１ｌｉＰ－Ｂ毛Ｄ，ｐＨ＝３．０，２５＂Ｃ，２１４ｒｉｍ，３０ｍｂａｒ压力进样，３ｓ （四）环糊精浓度对手性化合物拆分的影响环糊精浓度是影响分离的另一个主要原因，我们研究了ＨＰ．Ｂ―ＣＤ不同浓度对 几种手性化合物分离的影响，结果见图２．６。 从图２．６可以看出：在我们考察的浓度范围内，几种手性化合物基本上都有一 个相应的最佳的ＨＰ．１３－ＣＤ浓度，原因可能是随着环糊精浓度的增加，对映体和ＣＤ接 触几率逐渐增大，形成包合物的趋势亦增加，达到某一ＣＤ浓度时，分离达到最大， 但随ＣＤ浓度继续增加，溶液的粘度也随之增加，迁移率减小，迁移时间增加，同 时对映体的平均迁移率之差也随之减小，此时对映体趟度差的减小成为主要因素， 对分离不利，所以达到最佳浓度后继续增加ＣＤ的浓度，分离度往往无所改善甚至 变差。图２－６环糊精浓度对手性化合物拆分的影响 电泳条件：前三者５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７ＨＰ－Ｂ－ＣＤ， 组氨酸：５０ｍｍｏｌ／ＬＨ３ＰＯ，－ＮａＨ２Ｐ（）４＋ＤＳ＝４．８ＨＰ．Ｂ－ＣＤ，１５ＫＶ，ｐｌａ＝３．０，２５℃，２１４ｎｍ，３０ｍｂａｒ压力进样，３ｓ（五）小结 本节建立了环糊精．毛细管区带电泳对氧氟沙星、扑尔敏、普萘洛尔和组氨酸 的分离和分析方法。讨论了在Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４缓冲体系中各种因素对色谱行为的影 响。得出其以下色谱条件： 毛细管材料及规格：未涂层石英毛细管柱６０ｅｍＸ７５１．ｔｒｎ（Ｌ，Ｄ）（有效长度５５ｅｍ）电 电压：１５ＫＶ 极：正向度：２５℃温进样方式：压力进样（３０ｍｂａｒ）进样时问：３ｓ 缓冲液体系： 氧氟沙星一Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７，４０ｍｍｏｌ／ＬＨＰ．１３．ＣＤ。ｐＨ＝３．０，Ｒｓ＝３．１１ 扑尔敏－Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７，３０ｍｍｏｌ／ＬＨＰ．１３．ＣＤ，ｐＨ＝３．０，Ｒｓ＝２．０８普萘洛尔－Ｈ３Ｐ０４一ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７，２０ｍｒａｏｌ／ＬＨＰ－８一ＣＤ，ｐＨ＝３．０，Ｒｓ＝Ｉ．０７ 组氨酸．Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝４．８，３０ｍｍｏｌ／ＬＨＰ－Ｂ－ＣＤ，ｐＨ＝６．０，Ｒｓ＝１．０８Ｃ ｍ＇－ｆ．ＣＤ：３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ２８．７ ｐＨ＝３．０ Ｒｓ－－２．０８（扑尔敏）ＣＨＶ＂＇Ｏ：２０ｍｍｏｉ／Ｌ ＤＳ－－８．７ｐＨ＝３．０Ｃ加Ⅶ．ｃＤ：３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ＝８?‘７Ｒｓ＝１．０７（普萘洛尔）ｐＨ＝６．０ Ｒｓ＝１．０ｓ（舒ｌ氨酸）图２．７ Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２１＞０４缓冲盐体系各手性化合物的电泳分离图２．３．２磷酸．三乙醇胺体系下对手性化合物毛细管电泳分离的影响 前面用磷酸盐缓冲体系，对四种手性化合物的分离进行了研究，给出了比文 献报道更好的分离结果。我们改变缓冲体系，试图用最低浓度的手性选择剂来获 得最好的分离。用ｐＨ＝３．０的１００ｍｍｏｌ／ＬＨ３Ｐ０４－Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２０Ｈｂ作为缓冲体系，在 ｐＨ＝３．０时，三乙醇胺被吸附在毛细管壁上，产生了一个指向阳极的低的电渗流， 且减少了分析物与毛细管壁之间的相互作用，因此本实验采用ｐＨ＝３．０的１００ｍｍｏｌ／ＬＨ３Ｐ０４．三乙醇胺缓冲体系，采用前节优化好的电泳条件，对四种手性 压：１５ＫＶ化合物进行电泳分离，获得了更好的分离度。其色谱条件为：电电极：正向温度：２５℃进样方式：压力进样（３０ｍｂａｒ）进样时间：３ｓ 氧氟沙星一Ｈ３Ｐ０４－ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７，４０ｍｍｏｌ／ＬＨＰ一１３?ＣＤ，ｐＨ＝３．０ 扑尔敏一Ｈ３Ｐ０４一ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７，３０ｍｍｏｌ／ＬＨＰ―Ｂ―ＣＤ，ｐＨ＝３．０ 普萘洛尔．Ｈ３Ｐ０４．ＮａＨ２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７，２０ｍｍｏｌ／ＬＨＰ．ｐ―ＣＤ，ｐＨ＝３．０ 组氨酸．Ｈ３Ｐ０４－ＮａＩ－１２Ｐ０４＋ＤＳ＝４．８，３０ｍｍｏｌ／ＬＨＰ－ｐ－ＣＤ，ｐＨ＝６．０ 分离结果见图２．８。：㈠３２¨，‘，●棚矗ＣＨｐ－争ＣＤ：４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ２８．７ ｐＨ＝３．０Ｒｓ＝３．３ｓ（氧氟沙星）ｍ＾Ｕ，Ⅱ２口１口、―、～．Ⅱ４Ⅱ４２ ４４ ４６ｍｔｎ“｛¨ＣｒＷ－ｐ－ＣＤ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ２８．７ｐＨ＝３，０Ｒｓ＝１．１６（普萘洛尔）图２－８ Ｈ３Ｐ０４－（ＣＨ３ｃＨ２０）３Ｎ缓冲盐体系各手性化合物的电泳分离图２．３．３酸性物质托品酸及萘普生对映体的毛细管区带电泳分离 碱性手性化合物的毛细管电泳分离，一般采用低的ｐＨ值条件，使碱性对映体 溶质带正电荷，其电泳方向与电渗流方向一致。对酸性物质，由于其电泳方向与 电渗流方向相反，报道较多的方法是在缓冲溶液中加入电渗流抑制剂，采用负电 源，负极进样，使对映体依靠自身的电泳向正极迁移，在正极得以检测。另一种 方法是选择合适的ｐＨ值，使电渗流速度大于酸性物质本身的电泳速度，从而使酸 性物质在负极流出。我们采用后一种方法，对酸性物质萘普生和托品酸的毛细管 电泳分离进行了研究，使两者获得了基线分离。 缓冲溶液的ｐＨ值是影响酸性物质分离的关键，主要表现在三个方面：（１）ｐＨ 增加，‘电渗流迁移率增加，酸性物质的表观迁移率增加，迁移时间减少；（２）ｐＨ 增加，酸性物质电离度增加，有效电泳迁移率增加，表观迁移率降低，导致迁移 时间增加；（３）ｐＨ值变化，未电离的以及已电离的酸性物质的摩尔分数之比发生 变化，影响到对映体包合作用大小，导致分离度的变化。本小节以取代度为８．７的 ＨＰ．Ｂ．ＣＤ为手性拆分剂，考察－Ｔ４０ｍｍｏｌ／ＬＮａ！－１２Ｐ０４－Ｎａ２ＨＰ０４缓冲体系ＰＨ值的变化 对托品酸及萘普生分离的影响。结果如图２―９和图２―１０。图２．９ ｐＨ值对托品酸和萘普生分离度的影响ＩＣ口蝴：２０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ＝Ｓ．５ＤＳ。８．７Ｃｍ－ｍＣＤ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＳ＝８．７ｐＨ＝５．５Ｒｓ＝Ｉ．４２（托品酸）Ｒｓ＝２．０７（萘普生）图２．１０托品酸和萘普生的电泳分离图２．３．４苯丙氨酸对映体的毛细管区带电泳分离 大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，一般需经衍生化才能进行分离、 分析【ｌｌ ｏ】。但像苯丙氨酸这样含有苯环的氨基酸，在较低的波长下才有较强的紫外 吸收，经测定苯丙氨酸在１９０ｎｍ处有最大吸收值，只不过在１９０～２００ｎｍ处是苯丙氨 酸的末端吸收，会出现吸收值不太稳定的现象，从而影响分离。所以，综合考虑 我们选择２１０ｎｍ作为检测波长，在实际分离检测中稳定性较好。苯丙氨酸的 ＰＩ＝５．４８，一般是ｐＨ值低于ＰＩ的电解液才有手性分离能力，我们选择４０ｍｍｏｌ／Ｌ的 Ｈ３Ｐ０４制ａＨ２Ｐ０４内加取代度为８．７的ＨＰ．８．ＣＤ作为缓冲液。考虑到缓冲溶液的ｐＨ是 影响酸性物质分离的关键，所以考察ＴｐＨ值的变化对苯丙氨酸对映体分离度的影 响。分离结果见图２．１ｌ。 从图２．１ｌ可以看ｆｌ｛ｐＨ值在２．ＯＯ．２．２０之间时，随ｐＨ值的增加，分离度增大，分 离度一旦大于３．０时分离度会急剧下降，得到的都是单峰色谱图，原应可能是ｐＨ值 的改变影响未涂层的石英毛细管管壁的表面特性，在高ｐＨ值下，毛细管壁表面的硅羟基（ｓｉ．ＯＨ）电离趋于饱和，ＥＯＦ达到最大且变化平缓；ｐＨ值在４巧范围内，Ｓｉ．ＯＨ基的电离对ｐＨ值非常敏感，表面电荷变化非常大，ＥＯＦ对ｐＨ值表现出很强的依赖 性。当ｐＨ值减小至３以下时，壁表面带负电荷的ｓｉ．Ｏ’完全被氢离子中和，使壁表面 呈电中性，Ｚｅｔａ电势趋于零，ＥＯＦ也趋于零。在这种情况下，ｐＨ值的变化对ＥＯＦ 影响不大，主要影响电解液的离子强度。在本实验的ｐＨ值范围内，电解液ｐＨ值的 变化主要影响的是离子强度，随ｐＨ值降低，电解液的离子强度增大，进而使分离 度有明显改变，当ｐＨ值到达一定值时，分离度趋于稳定。图２―１１ｐＨ值对苯丙氨酸分离度的影响３０ｍＡＵ４Ⅱ２１１ｂＬ一口２２ ２４ ２６ ２量１１１ｉａ图２．１２苯丙氨酸的电泳分离图电泳条件：缓冲液４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨｓＰ０４－ＮａＩ－１２Ｐ０４＋ＤＳ＝８．７，２０ｒｅｔｏｏｌ／１ 分析条件：电压：１５ＫＶ，Ａ．＝２１０ｎｍ，电极：正向，温度：２５＂（２ 进样方式：压力进样（３０ｍｂａｒ）进样时问：３ｓＲｓ＝２．２６ｌｉＰ－ｐ－ＣＤ２．４小结 本章采用本实验室自制的不同取代度的ＨＰ．［３－ＣＤ为手性选择试剂，利用ＨＰＣＥ 在磷酸一磷酸二氢钠、磷酸一三乙醇胺和磷酸二氢钠一磷酸氢二钠缓冲液体系中成功 地拆分了某些手性化合物，结果显示三种缓冲液体系可以实现７种手性化合物的 拆分，三者之间存在较强的互补性，建立了手性化合物各自的分离分析方法，讨 论了各种因素对其色谱行为的影响。对于碱性手性化合物，ｐＨ值约等于３左右的 磷酸液电解质有利于它们的分离。ＮａＨ２Ｐ０４－Ｎａ２ＨＰ０４缓冲液体系对酸性物质分离 有利。另外根据苯丙氨酸的特殊性，建立了它的环糊精一毛细管区带电泳的分析方 法。为今后应用此体系拆分其它氨基酸乃至手性药物奠定了初步的基础。第三章薄层色谱法拆分手性化合物３．１引言 薄层色谱（ＴｈｉｎＬａｙｅｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）常用ＴＬＣ表示，又称薄层层析，属于固．液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱 色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至０．０１肛ｇ）的分 离：另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离 多达５００ｒａｇ的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较 高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。最主要的优点是对实验条件要 求不高，而且还可以为其它色谱技术提供一个很好的色谱分离参考条件。在此， 我们采用ＴＬＣ技术中的手性固定相法（ｃｓＰ），制各了三种不同的纤维素衍生物的手 性ＣＳＰ。通过核磁共振氢谱、红外光谱和元素分析等方法对它们的结构和性能进行 了表征。将它们与微晶纤维素（ＭＣ）混合制成手性薄层板，成功拆分了８种手性 化合物，取得了良好的分离效果。 ３．２实验部分 ３．２．１试剂与仪器 微晶纤维素 吡啶 （拄层析用）（Ａ．Ｒ．）上海恒信化学试剂有限公司 西安试剂厂（用ＫＯＨ干燥过夜，常压蒸馏， 收集１１４．１１５℃馏分备用） 天津市化学试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 上海金山亭新化工试剂厂 西安试剂厂苯甲酰氯 ４．氯苯甲酰氯 ２－氯苯甲酰氯（Ａ．Ｒ．） （Ａ．Ｒ．） （Ａ．Ｒ．）乙醚、甲醛，氯仿（Ａ．Ｒ．）手性化合物（分子结构图见图３－６）：２－（９－葸基）－２－甲氧基乙酸，２－（９－葸 基）一２一羟基乙酸、苯丙氨酸、组氨酸、扑尔敏、普萘洛尔、沙丁胺醇和萘普生。 以上各种手性化合物用乙醇或水配成浓度为ｌｍｇ／ｍＬ的溶液，在硅胶薄层板上用不 同极性溶剂展开，未见其它斑点，说明都是纯度较高的化合物。 ＫＱ－４００ＫＤＥ型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） Ａ、值ＮＣＦ３００ＭＨＺ超导傅立叶数字化核磁共振仪（瑞士Ｂｒｕｋｅｒ公司）Ｖａｒｉｏ ＥＬＩＩＩ元素分析仪（德国Ｂｒｕｃｈｅｒ公司）ＥＱＵＩＮＸ５５型傅立叶变换红外光谱仪（德国Ｂｒｕｃｈｅｒ公司）。３．２．２对映体的拆分 各手性化合物均用乙醇或水配成Ｉｍｇ／ｍＬ的溶液，用毛细管在距板边缘ｌｃｍ 处点样，在展开剂系统饱和的广口瓶中室温上行展开。观察样品斑点的分离情况 有以下方式：（１）紫外灯下（ｋ＝２５４或ｋ＝３６５）观察；（２）碘蒸气显色（３）香草醛 硫酸溶液。薄层板展完后，自然晾干后，向薄层板上均匀喷洒香草醛硫酸溶液， 放入烘箱１００℃烘烤１０．１５ｍｉｎ，经此处理，样品斑点显色效果好。 ３．２．３纤维素苯甲酸酯类衍生物的合成 如图３．１所示，分别将ＭＣ与苯甲酰氯、对氯苯甲酰氯和邻氯苯甲酰氯反应，合 成了ＣＴＢ、ＣＴＰＣＢ和ＣＴＯＣＢ