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猪冷冻精液的现状及意义
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猪精液常温保存效果观察
& & &猪精液保存技术推广应用的重要性在于通过扩大精液使用的时间和地域范围，提高优秀种公猪的利用效率，从而降低公猪饲养成本，加速猪的遗传改良，避免通过交配传播疾病，同时也在猪品种资源和原始资源及基因库种质资源保存等方面起重要作用。我国于２０１０年－２０１２年分别实施生猪良种补贴计划，以加快生猪改良步伐［１－２］。要推进养猪产业化发展，提高种猪受精率和精液品质至关重要。现行的精液保存方法按保存温度分为３种，即常温保存（１５℃～２５℃）、低温保存（０℃～５℃）和超低温保存（－７９℃或－１９６℃）。由于冷冻猪精液精子成分丢失导致受精率下降［３］，加之冷冻技术难度大，冷冻设备投资高，还不能在生产中广泛应用。& & &而公猪精液的低温保存不如常温保存效果好，因此，公猪精液常温保存在生产上具有很大的实用价值［４－５］。影响常温猪精液保存效果的因素很多，本研究针对我国种猪及商品猪饲养数量大，但主要为小规模和个体饲养，无法发挥优秀种公猪在品种改良中作用的问题，自优秀种公猪采集精液，对影响精液常温保存的主要因素，如抗菌药选择、稀释液比例、光照、振荡、尿液污染等进行了深入研究。１　材料与方法& & &１．１　材料& & &１．１．１　仪器设备　生物显微镜，恒温箱，电子天平，水浴锅。& & &１．１．２　稀释液　稀释液配方：葡萄糖３７ｇ，ＮａＨ－ＣＯ３１．２ｇ，柠檬酸钠６ｇ，ＥＤＴＡ　１．３ｇ，ＫＣｌ　０．７５ｇ，蒸馏水１　０００ｍＬ。准确称量各种成分放在烧杯里，按比例加入双重蒸馏水溶解，如果不易溶解可适当加温；用滤纸过滤溶液，以去掉杂质；把过滤后的溶液密封后进行高压灭菌。& & &１．１．３　采精器材　采用手握法采精，主要器材包括灭菌乳胶手套，集精杯，过滤用灭菌纱布，生理盐水。& & &１．２　方法& & &１．２．１　采精　用手握法采集精液，将集精杯口用灭菌纱布包好，一边采集一边过滤。要保持集精杯温度在３７℃左右。收集精液时要去除前段尿液和稀释部分，收集浓厚部精液。如果精液中检测成分较多要用纱布多过滤几次除去。鲜精要在３０ｍｉｎ内送回实验室。& & &１．２．２　精液活力的测定方法　精液送到实验室后放在３７℃的水浴锅里，加上少许的稀释液。滴在有热台加热到３７℃的血球计数板上，盖上盖玻片，在４０倍光学显微镜下观察，计算精子活力（精子活力＝直线运动精子／精子总数）。要求活力高于０．８，否则应当弃去。在常温保存的条件下要求每隔１２ｈ检查一次，并把精液轻轻的摇匀。& & &１．２．３　精子有效存活时间　有效存活时间是指精子活力不低于０．５的保存时间［６］。& & &１．２．４　精液的稀释　把刚刚送到实验室的精液放在３７℃的水浴锅中，同时也把稀释液放在３７℃水浴锅中，然后将稀释液按要求加入到精液中。注意稀释液与精液的温差不能大于１℃，自然冷却到室温。& & &１．２．５　常温条件下不同种类抗生素的影响　取４个烧杯各加稀释液１００ｍＬ，分别编号１、２、３、４，其中，１号杯中不加抗生素，２、３、４杯分别加入庆大霉素、青霉素、新霉素各１６万单位，水浴锅加热至３７℃。用编号Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ的试管各取５ｍＬ的精液，再按１∶１的比例对应１、２、３、４取５ｍＬ稀释液，常温（１７℃～２０℃）下保存。试验重复４次。& & &１．２．６　常温下不同稀释倍数的对比试验　选用加庆大霉素的稀释液并取５ｍＬ精液按比例混合，在１７℃～２０℃的常温下分别保存在标有Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ的试管中。各管中精液和稀释液比例如下：Ｅ为１∶０．５，Ｆ为１∶１，Ｇ为１∶１．５，Ｈ为１∶２，Ｉ为１∶２．５，Ｊ为１∶３。试验重复４次。& & &１．２．７　其他因素对精液保存的影响试验　在精液常温保存过程中还有很多的不确定因素的影响，选用加庆大霉素的稀释液５ｍＬ与５ｍＬ的精液混合，试管编号Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ。保存环境Ｋ管给予光照；Ｌ管给与强烈振荡；Ｍ管加１滴尿液；Ｎ管不摇动；对照组对照管Ｏ要求避光、无强振、无尿液，每隔１２ｈ轻轻的摇匀。试验重复４次。２　结果& & &２．１　不同抗生素对猪精液的保存效果& & &在常温条件下添加不同抗生素的精液稀释液对精子活力的影响，结果见表１。由表１可见，未添加抗生素的精液稀释液有效保存时间明显比加入抗生素的有效保存时间短，在加入不同的抗生素的保存条件下差异不大，以加入庆大霉素的效果最好，新霉素次之。& && & &将添加不同抗生素的稀释液保存４８ｈ后精子活力进行多重比较，结果详见表２。经方差分析表明，添加庆大霉素、新霉素和青霉素的稀释液与不添加抗生素稀释液差异极显著（Ｐ＜０．０１）；添加庆大霉素的稀释液与添新霉素和青霉素的稀释液差异显著（Ｐ＜０．０５）。&&& & &２．２　稀释倍数的影响& & &在精液没有被稀释的情况下，精子在１ｈ内活力下降一半，在２ｈ内无存活精子，但按不同比例稀释后就明显的延长精子保存的时间。检查结果列于表３。由表３可知，精液在１∶１～１∶２的有效保存时间是最长的，在１∶１～１∶２之前是随着浓度的降低有效保存时间延长和同一时间的精子活力有所增强。在１∶１～１∶２之后的就相反，有效保存时间减少，精子活力减弱，但差异不显著。所以在保证精液的密度情况下尽量的降低稀释比例，既扩大了精液量，又保证了精液的活力。& && & &将不同稀释比例的精液保存６０ｈ后对精子的活力进行多重比较，结果见表４。由表４可知，保存６０ｈ后１∶０．５稀释的试管精子活力极显著的低于其他几组（Ｐ＜０．０１），１∶１．５稀释的精子力最好。& & && & &２．３　其他因素对精液常温保存的影响& & &在常温保存过程中精液很容易受到其他因素影响，检查结果列于表５中。由表５可知，精液在常温保存的条件下，还受到很多因素的限制。在光照条件下精液活力下降很快；在强烈振荡的条件下更加明显，１２ｈ就下降到０．５４，２４ｈ内全部死亡；在采精液的时候容易受到公猪尿液的影响，滴加尿液组的试验结果就表明了公猪尿液混入时很容易使精子死亡；在精液保存过程中至少每隔１２ｈ要轻轻的摇匀一次，否则将对精液的保存有很大的影响。& & &将上面保存条件下的有效保存时间进行多重比较，结果详见表６。由表６可知，对照组的有效保存时间极显著的长于其他试验组（Ｐ＜０．０１）。&&３　讨论& & &３．１　精子活力检测& & &精子的运动能力是射出精子的一个重要功能。这种功能保证了精子在受精过程中与卵子相遇和精子对卵膜的机械穿透作用，因此正确分析精子的运动能力具有重要作用。通常精子的运动能力用精子活力来评价，它是直线运动的精子占视野中精子的百分率。正常运动精子在普通光学显微镜下可直接观察记数。光学显微镜仍然是检测精液的最常用的方法［７］，虽然这种方法不可避免地带有一定人为误差，但这种方法操作简便快捷，不需要昂贵仪器，特别适于临床和现场应用。& & &３．２　抗生素对精液保存的影响& & &没有加抗生素的稀释液有效保存时间明显比加入抗生素的有效保存时间短，而加入不同的抗生素的保存条件下差异不大。但用含不同抗生素的稀释液保存４８ｈ后，在含庆大霉素试管中精子的活力最强，且和含新霉素、青霉素试管中精子的活力差异显著。有研究表明，未发现添加抗生素的精液其保存效果非常好。但是在采精及精液处理过程中难免受到细菌及微生物的污染。精液是微生物很好的培养基，而且保存的温度也非常适合微生物的繁殖。所以，精液稀释液中的抗微生物药物对抑制微生物的繁殖，减少其代谢产物对精子的毒害是非常重要的。受到微生物污染的精液，其保存性因细菌的种类和数量不同而异，其中大肠埃希菌等革兰阴性菌对精液保存影响极大［８］。本研究中选用的３种临床常用抗生素中，庆大霉素对大肠埃希菌、产气杆菌、克雷伯菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、绿脓杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素沙雷菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用，这就决定了庆大霉素的作用效果是最好的。硫酸新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对葡萄球菌属（甲氧西林敏感株）、棒状杆菌属、大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属等肠杆菌科细菌有良好抗菌作用，对各组链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属等活性差，可能决定了硫酸新霉素对精液的保存效果比较差。青霉素作为内酰胺类抗生素效价降低极快。经过１２ｈ后效价降低５０％。即使对这些细菌有效，效价降低过快也会影响其抑菌效果，精子保存时间较短，效果不理想［９］，也决定了青霉素对精液保存效果最差。& & &３．３　稀释倍数和精子浓度的影响& & &根据上面的结果可知，精液与稀释液比例在１∶１～１∶２时效果最好，精液浓度过大和过小都会影响精液在常温下的保存时间。精液里含有精清，而精清中也存在一些损害精子功能的物质，降低浓度或除去更利于精子保存，如精清中的芳基磺胺酶能从对质膜有稳定作用的硫酸盐复合糖上脱去硫酸盐，并促进精子获能加速死亡［１０］，故精子浓度越高，精子保存时间越短。但另一方面，过度稀释导致精子丧失运动能力、代谢活性和受精能力，即稀释效应［１１］。精清中有维持精子运动和存活所必需的离子等，还有维持精子膜稳定和受精能力的蛋白质、抗氧化物质以及其他有益成分，过度稀释使这些成分浓度过低，无法保护精子。过度稀释还将带来大量电解质，造成精子表面电荷过多，产生头对头凝集等有害反应。猪精清中可能存在去获能因子，在体外保存中可抑制精子获能，而稀释会使其浓度下降，使精子过早获能，从而加速死亡［１２］。精液的稀释还应考虑人工授精所需的精子总量和稀释精液的总体积。因此，液态保存猪精液浓度一般为２．０×１０７个精子／ｍＬ～５．０×１０７个精子／ｍＬ，可保证每头母猪人工授精时精子总数为３×１０９个精子／ｍＬ～４×１０９个精子／ｍＬ，以及精液体积为６０ｍＬ～１００ｍＬ的适宜用量［１２］。& & &３．４　其他影响因素& & &光照、振荡、尿液的混入和每隔１２ｈ未摇匀都可以缩短精液在常温下的保存时间。光照对精子的影响是多方面的，消毒用的紫外灯对精子有杀伤作用，可见光会增强精子的代谢，红外线可使精液升温。所以，如果在气温合适的情况下在室内保存精液，要注意防止日光和紫外灯直接照射精液。剧烈的振荡可使精子从颈部断裂，形成有头无尾的畸形精子。所以，在存放或运输中的猪常温精液每天要摇动２次～４次，摇动时动作要轻柔，避免剧烈摇动［１３］。尿液对精子有一定的毒害作用。一部分潴留于尿生殖道内的尿液会随着射精和精液一起排出。另一方面，相当多的公猪都有包皮腔积尿问题，采精时，包皮腔内的尿液可能会顺着阴茎流到采精者的手上，再滴在集精杯中。常温保存时，精子在２ｈ后进入休眠状态，代谢减缓，可以延长其存活时间。放入恒温箱之后，还要经常翻动精液瓶，使沉淀的物质尽量均匀溶于稀释液中，防止代谢废物聚集而对精子产生毒害作用［１４］。液瓶每天被数次拿进拿出恒温箱，精液温度波动很大，这对精子的伤害无疑是巨大的，从而导致试验中的精液保存效果不如资料中介绍得好，这些都是影响保存效果的重要因素。& & &本试验选出了在常温下保存最优的保存方式：①在稀释液中加入庆大霉素等广谱抗菌药；②精液与稀释液比例在１∶１～１∶２（根据精液的密度来确定具体的稀释比例，保证密度的条件下尽量的增加稀释比例）；③避光保存；④避免强烈的振荡；⑤每隔１２ｈ轻轻的摇匀；⑥在采精液时尽量避免尿液的混入。（１．潍坊出入境检验检疫局，张金玲，李　凯，孙　军；２．滨州六和隆达农牧有限公司，房灵军；３．青岛农业大学动物科技学院，刘焕奇
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猪冷冻精液技术研究进展
华夏养猪网 发布时间：
导读：猪冷冻精液技术是指利用干冰（-79℃）、液氮雾等作冷却源，将精液特殊处理后，保存在超低温的液氮（-196℃）状态下，达到长期保存的目的，并且解冻后输精的过程。自Polge等1956年开始猪的冻精研究试验以来，许多国家…
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　　猪冷冻精液技术研究简史
　　1949年英国Polge等发现甘油（丙三醇）对牛精子具有抗冻保护作用，1956年开始应用这个原理进行猪精子的冷冻操作，但在期间的研究结果中，冷冻保存、解冻后的精子具有活力，但无法获得受胎结果。虽然在1970之前有几例猪的冻精成功受胎的报道，但其结果不能被重复。1970年开始，Polge等学者利用外科腹腔授精法将解冻后的精子直接注入输卵管而获得83%的受精卵，其后，多个研究小组如美国的CraboandEinarsson1971；Grahameta11971；PurselandJohnson1971；法国Paquignon&duMesnilduBuissson1973;澳洲Salamon&Visser(，1974)和德国的Westendorfetal（1975）相继报道了以常规的子宫颈输精并成功分娩的冻精技术试验结果，终于阐明低温保存后猪的精子仍具有受精的能力。从此，世界学者为了把猪的冷冻精液技术应用到养猪生产实践中作了许多努力，并对操作程序进行不断优化。迄今为止，人们仍沿用细管(Westendorfeta11975)、颗料(PurselandJohnson1975)及其改良型保存装置进行猪精子的冷冻和保存。虽然冻精仍保持一定的受精能力，但产活仔数、受胎率等繁殖结果明显低于液态保存精液(Johnson1985)。因此，采用长效、低成本、切合实际的液态保存精液技术得到了不断的改进，可以部分解决国际间遗传物质的交流，受胎率也很接近自然交配结果。所以，即使冻精的繁殖效果与液态保存精液达到相似的程度，也不会取代液态保存精液技术的广泛应用地位。所以，猪冷冻精液技术在未来养猪业中的普遍应用的价值仍存在不断地争议之处。
　　冷冻保存方式
　　在一些早期研究中，猪的精子采用玻璃瓶(Polge1956)或玻璃试管(Settergren1958)和较高浓度的甘油溶液进行冷冻保存。后来，牛的粒状干冰方法被应用到猪上(NagaseandNiwa1963)，把甘油溶液浓度降到1~3%的范围，可以执行快速冷冻降温操作(Purse1andJohnson1975)。公猪精子采用5ml大容量保存(Westendorfeta1ml铝袋(Waideeta1ml中型细管(Fazano1986,Baron1986,Leps-2.0mL扁平大容量细管(Leps1988,Moura1988,Ewert1988,Stampa1989,Wegmann1990,Simmet1993),和0.25mL微型细管,和不同类型的5mL塑料袋(Larssonetab,MwanzaandRodriguez-Martinez)。所有这些保存类型既有它的优点又有它的缺点。颗粒和0.25、0.5mL小型细管有较大的表面积/容量比，是适合低温冷冻保存的形状。然而颗粒的冷冻精液较难进行不同头份/来源的区别，容易造成交叉污染且不易解冻。1头份一般需要解冻10-20根小型细管或2-3根扁平细管，这是造成普遍推广应用的首要障碍。5mL的大型细管具有1头份的精子数量，但其表面积/容量比较小，限制了理想的冷冻和解冻过程(Weitzeeta11987)。对塑料袋包装的测试结果一直表明能均匀地冷冻和解冻，并含有1头份精子数量，但其体积太大，不适合放置在液氮罐里保存，因此无法采用。虽然5mL大型细管Maxi-straw保存精子解冻后活力略低，但在实践中易于操作，比颗粒的使用更加广泛(AlmlidandHofmo1996),主要原因是不会引起交叉污染和在使用现场更方便解冻。一些学者证实：微型、小型、中型细管，扁平细管和塑料袋保存的冻精样品经解冻后，比大型细管在精子直线运动、顶体完整性、活力方面均表现得更加优良(详见Simmet1993综述)。大型细管Maxi-straw保存的精子活力低主要原因是位于细管中间的精子受冷不均匀，但从受精率考虑，活力并不是决定性因素，因为一些学者报道了大型、中型、扁平的大型细管保存的冻精受精率无明显的差异(Fazano1986andStampa1989)。尽管资料显示利用扁平细管或5ml塑料袋保存的冻精与大型细管Maxi-straws相比有更高的受精力、输卵管富余精子更多，但这些保存方法在生产实践中均没有被推广使用(Simmet1993)(Bwangaeta11991b)。在目前的实践应用中，仍以传统的颗粒或细管冻精为基础。【往下看，下一页更精彩】
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关注繁殖的朋友应该都很清楚，在全球范围内，牛的冻精技术由于其强大的引种改良效果、纯洁的无疫病来源、较长的保存时间、而得到广泛使用，甚至已经取代了传统配种的方式。而猪的配种方面由于技术原因迟迟没有上线应用。现在，经过长期研发与实践，推出了成熟且稳定的猪冻精产品。
猪冷冻精液保存技术，由河北省三河市盛繁商贸有限公司在河北省各级畜牧主管部门的高度重视和大力支持下，历经7年时间研发成功。
为什么选择百钧达提供的猪冻精
一、优秀公猪基因
1、优秀的公猪的来源
百钧达猪冷冻精液是采用国家核心育种场的顶级公猪，这些公猪100%不对外销售。优秀的种公猪价格极高，数量极少，对品种改良意义重大，用高科技冻精技术与厂家顶级基因进行稼接，把这些公猪利用率大大提高。让普通用户也有机会获得优秀基因，提高生产成绩。
2、严格的公猪选育
育种级冻精：选取核心育种场每个品种年排名前5名的优质公猪，育种价值极高且系谱齐全。
商品级冻精：种公猪是来源于国家百名核心育种场的前5%的顶级终端父本公猪。（单品种组合混精，提高配种亲和力，增加了生产效益）
而市场上生产鲜精的种公猪是来自国内种猪场（核心及普通育种场），其选育强度在40%-50%的条件下生产的种公猪
3、“百钧达”生产冻精公猪的选育强度是生产鲜精公猪的选育强度的10倍以上。
据中国农大张勤教授指导的数据：如果公猪使用数量由100头降低为20头，可望在扩繁场或商品场提高遗传进展约30%（跟用100头公猪相比）。这里所言的遗传进展多指在遗传进展方面所产生的效益，
上述100头种公猪精选20头优秀公猪时选择强度是5倍，既得到了30%遗传进展效益，那百钧达生产冻精所用公猪是市场上的鲜精所用公猪10倍的选择强度，会给养殖户提高45%的遗传效益 。
二、降低配种成本
在商品猪终端父本种公猪的选择上：
百钧达公司选的公猪更侧重于100公斤出栏日龄，优质基因遗传概率会让他们的后代比同期产仔的其他种公猪的后代提前7-16天出栏。以现在的饲料价格，每头育肥猪提前出栏一天可节约8元饲料费用。按提前出栏10天计算，每头育肥猪可节约饲料钱8元*10天=80元。
1.以存栏100头基础母猪为例，每头母猪年出栏育肥猪15--20头计算，17头*80元=1360元。100头母猪可节约1360元*100头=136000元。
2. 提前出栏会降低疾病风险，疾病风险已成为整个养殖行业的盈亏关键点，给养殖户带来无形中的效益。
三、安全有保障
为了控制生物安全，“百钧达”冻精使用“靓精”产品彻底消灭了猪瘟、伪狂犬、蓝耳、细小、圆环、口蹄疫等传染病垂直传染的隐患。
靓精(R)是一种在精液中添加的生化制剂，可以完全杀灭猪精液中可能污染的猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、口蹄疫病毒等多种病毒及大多数细菌。相关数据已经公开发表的靓精(R)病毒杀灭试验、对猪卵子及胚胎的毒性试验和猪体外受精影响试验结果，精液中添加0.75%靓精(R)，可在不影响精子和胚胎活力的前提下，有效杀灭精液中的病毒，避免传染病的传播。
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