大鼠动脉粥样硬化模型脑缺血模型是将鱼线插入动脉里吗

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蜂胶黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
蜂胶黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用作者:袁丽杰 赵蕾 张悦 凌春莹 【摘要】 目的 探讨蜂胶黄酮对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 SD 大鼠分为假手术 组、模型组及蜂胶黄酮高、中、低三个剂量组,大脑中动脉栓塞(MCAO)制作模型,检测各 组大鼠脑组织含水量和脑梗死体积,脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)活 性及丙二醛(MDA)的含量。结果
与模型组比较,蜂胶黄酮三个剂量组脑含水量明显降低 (P&0.01),脑梗死体积明显缩小(P&0.01),SOD、CAT 活性明显升高(P&0.01),MDA 的含量 明显降低(P&0.01)。结论 蜂胶黄酮具有抗自由基损伤和保护缺血脑组织的作用。 【关键词】 蜂胶黄酮;脑缺血再灌注;自由基 蜂胶乙醇提取物(EEP)可以改善血管的弹性和渗透性, 舒张血管、 清除血管内壁积存物 〔1〕 , 具有抗氧化、清除自由基和对缺血再灌注损伤保护等作用〔2〕。然而蜂胶黄酮对缺血性脑 损伤是否具有保护作用报道极少, 本研究复制大鼠缺血再灌注损伤模型, 通过脑组织含水量、 脑梗死体积和脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)和丙二醛(MDA)的测定来 探讨蜂胶黄酮防治脑缺血再灌注损伤的机制,为脑缺血防治提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 SOD、CTA、MDA 剂盒均购自南京建成生物制剂研究所,其余试剂均系国产 分析纯;蜂胶黄酮由黑龙江中医药大学生物化学教研室提供。 大鼠, SD 雌雄各半, 体重 250~ 300 g,由哈尔滨医科大学动物中心提供。 1.2 实验仪器 紫外可见分光光度计(WF2800 ? D3A,北京第二光学仪器厂),超声波细胞 粉碎机(JY98 ?Ⅲ,宁波科生仪器厂),高速冷冻离心机(D ? 37520 型,德国 HERAEUS 公司)。1.3 动物分组 150 只大鼠随机分为 5 组,即假手术组、模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂 量组(200、100、50 mg/kg),每组 30 只。除假手术组不插线外,其余 4 组造模。蜂胶黄酮各 剂量组每天灌胃 1 次,连续 10 d。术前 1 d 再给药 1 次。 1.4 动物模型 根据 Longa 等〔3〕的方法制备大鼠缺血再灌注损伤模型。大鼠称重,6% 水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉,颈部正中切开,分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。 结扎颈总动脉近心端、颈外动脉起始端后,在颈总动脉处剪 “V”形口,沿颈总动脉插入直 径为 0.235 mm 的标记鱼线。经颈内动脉向颅内插至大脑中动脉分叉处,插入深度为 18~20 mm,将线与颈内动脉一起结扎。术中维持体温。再灌注时外拉线使标记端回至颈外动脉, 拔除插线,结扎颈外动脉。假手术组不插线外,其余同前。大脑中动脉栓塞后 2 h 恢复血供, 神经行为学评分参照 ZeaLonga 5 分制标准〔3〕,术后出现左前肢屈曲,行走时向左侧转圈 即视为造模成功,然后保温常规饲养,至 24 h 断头处死取材。 1.5 脑组织含水量的测定 大鼠造模 24 h 后断头取脑,称量两侧半脑湿重。再置于烘箱 中, 100℃烘烤 24 h 至恒重, 称量干重, 计算含水量。 脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重× 100%。 1.6 脑梗死体积测定 断头取脑,将大脑作连续 2 mm 冠状切片,共 5 片,然后将脑片 放入 2%TTC 磷酸盐缓冲液中 37℃恒温孵育 30 min,正常脑组织染为红色,梗死灶呈白色。 用电子天平称重着色和未着色部分, 计算脑片中梗死部分的质量百分比, 以此反映梗死体积 比。 1.7 脑组织匀浆 SOD、CAT 活性、MDA 含量检测 将大鼠立即断头取脑,切取缺血侧 MCA 区脑组织 0.1 g,用 0℃生理盐水制成 10%的脑组织匀浆,按 SOD、CAT、MDA 试剂 盒说明书检测脑组织中 SOD、CAT、MDA 含量。 1.8 统计学处理 所有数据均以 x± 表示,应用 SPSS11.5 版统计学软件进行处理。各组 s 间比较采用单因素方差分析,成组数据比较采用 t 检验。 2 结 果 2.1 脑组织含水量 左脑组织含水量各组间比较无差异,模型组右脑组织含水量明显高 于假手术组(P&0.01),蜂胶黄酮各剂量组右脑组织含量均明显低于模型组(P&0.01),表 1。 2.2 脑梗死体积 模型组脑组织梗死体积大于假手术组(P&0.01)。 蜂胶黄酮各剂量组脑组 织梗死体积明显低于模型组(P&0.01),见表 1。 2.3 脑组织 SOD、CAT 活力及 MDA 含量检测 与假手术组相比,脑缺血再灌注模型组 脑组织 MDA 含量增加(P&0.01),SOD、CAT 活性明显减弱(P&0.01);与假手术组比较,蜂胶黄 酮各治疗组脑组织中 MDA 含量明显降低(P&0.01),SOD、CAT 活性明显增加(P&0.01),见 表 1。 1 蜂胶黄酮对脑组织含水量、 表 梗死体积、 SOD、 CAT 活力及 MDA 含量的影响(x± s,n=10) 与模型组比较:1)P&0.01;与假手术组比较:2)P&0.01 3 讨 论 脑组织一定时间缺血后恢复血流供应, 功能不但未见改善相反出现缺血性损伤进一步加 重的现象称为脑缺血?再灌注损伤。脑缺血再灌注后,引起神经细胞的死亡和凋亡,导致脑 组织的损伤和功能障碍。脑缺血早期,内皮细胞间隙紧密连接疏松开放,通透性增高,血脑 屏障损害,引起脑组织的潴留和脑水肿。本研究结果表明蜂胶黄酮有维护血脑屏障的功能, 减轻脑水肿程度, 保护脑缺血损伤。 局部脑血流降低的程度和缺血持续的时间决定脑缺血损 伤的程度。本研究结果发现蜂胶黄酮治疗组梗死区明显小于模型组。 再灌注使损伤加重的主要机制之一是自由基的产生〔4〕。研究表明,在缺血性脑损伤 中可产生大量氧自由基(OFR),而再灌注期间 OFR 生成加剧〔5〕。OFR 损伤细胞内最敏感 的靶位就是磷脂膜多价不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化反应,使神经细胞损伤甚至坏死。寻 找有效的自由基清除剂, 保护缺血半暗带内神经元免受进一步损害及促进病变恢复是实施脑 保护治疗、改善缺血性脑损伤预后的重要措施之一〔6〕。脂质过氧化代谢产物 MDA 的含 量可以反应机体受自由基攻击的程度。 SOD 是体内主要自由基清除酶,能够有效地清除并 终止超氧阴离子引发的连锁反应。 CAT 末端氧化酶,其功能是催化细胞内过氧化氢分解,防止 膜脂过氧化。MDA 显著升高,说明脑组织缺血后氧自由基脂质过氧化反应增强;SOD、CAT 下降可能是增强的脂质过氧化反应消耗了过多的抗氧化酶, 氧化?抗氧化平衡被打破。 大量 生成的 OFR 首先破坏脂质生物膜,使细胞膜对钠离子及大分子物质的通透性增加,神经元 发生细胞毒性水肿和兴奋性递质的释放;线粒体膜受损,能量代谢障碍,并使其内部的钙离 子溢出,同时 DNA 链断裂,引起染色体的畸变和断裂,以上共同作用最终使神经元死亡。 尤其重要的是它可使初始缺血损伤不严重的神经元发生不可逆的坏死, 诱导凋亡的发生。 本 研究表明蜂胶黄酮可以减轻自由基对脑组织的损伤,机制可能与其分子中含有酚羟基有关, 该结构可能是清除自由基的结构基础。 总之,蜂胶黄酮可减少脑缺血后脑组织水肿,缩小梗死体积,增加 SOD、CAT 活性, 降低 MDA 含量,增强对自由基的清除,减轻脂质过氧化反应,保护神经细胞膜的完整性和 稳定性。 【参考文献】 1 Castaldo S, Capasso F.Propolis,an old remedy used in modern medicine〔J〕.Fitoterapia, 2002;73(Supp11):1 ? 6.2 孔庆峰,许志文,邓玉文.国内蜂胶黄酮的药理学研究近况〔J〕.实用医药杂志, ):23. 3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,):84. 4 Lewen A,Matz P,Chan PH.Free radical pathways in CNS injury〔J〕.J Neurotrauma,):871. 5 Chan PH.Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,):2 ? 14.6 Kaufmann AM,Firlik AD,Fukui M B,et al.Ischemic core and penumbra in human stroke 〔J〕.Stroke,):93.
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大鼠脑缺血再灌注模型的建立
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医学论文:线栓法致大鼠局灶脑缺血模型的评价及思考[3]
线栓的选择 应选择适合直径之鱼线。对于体重250~300 g之大鼠,鱼线适合直径在0.24~0.26 mm之间,石蜡包裹后在0.26~0.28 mm。鱼线应选择质量较好,表面光滑,柔软而坚韧者,硬度不够不利于在血管中的推进,硬度过高易造成血管壁损伤。为方便再灌注时迅速找到预留的线尾,减轻对动物的扰动,可选择与大鼠毛色对比鲜明的深色鱼线,同时方便观察线栓入颅前在血管中走行路径。  4.1.2 线栓的预处理锐利剪刀迅速垂直线身截取,保证断面平直不尖锐。将线头没入液体石蜡3 cm以上,迅速提出,竖直悬吊晾干,令石蜡自由顺线身滴下,以保证包裹均匀。显微镜下观察,线头呈水滴状,线身均匀平滑即可。从线头端起20 mm处,修正液标记。对于体重250~300 g之大鼠,一般可插入深度约20 mm左右。酒精消毒备用。  4.1.3 实验动物的选择经典的局灶性脑缺血模型选用SD大鼠。体重要求在250~300 g。刘氏[3]在研究中发现,体重大于350 g大鼠颅内血管增粗,难以充分阻断MCA血流,体重小于240 g,手术操作难度较大。辛氏等[4]的研究结果认为大鼠体重250~330 g,线长17 mm或18 mm,线栓直径0.28 mm的配合方案较为稳定优越。笔者曾选用200 g雄性大鼠,直径0.22 mm线栓造模预试,8 h存活率仅10%,可推断个体较小之动物对手术操作耐受较差。实验应选用雄性大鼠,以排除雌激素对脑缺血的保护作用。  4.1.4 麻醉药的选择多采用水合氯醛进行麻醉。水合氯醛具有价廉、配制储存简便易行之特点,动物一般能于术后2 h左右清醒,有利于造模成功与否的判定以及行为学的观察。  4.1.5 术前禁食 术前12 h必须禁食,可自由饮水。实验证明[5]高血糖条件下,脑缺血再灌注后脑组织梗塞面积及神经功能缺损症状会显著加重,死亡率明显增加。  4.2 术中操作要点  4.2.1 常规消毒术区,开颈后用镊子小心分离组织,仔细剥离颈总动脉,应尤其小心分离伴行的迷走神经。在距离ECA和ICA分叉5 mm处用眼科剪45°剪开血管,切口应注意尽量小。用止血钳牵拉备于ICA的手术线可防止切口出血。  4.2.2 线栓插入血管后即放开ICA备线处止血钳。用眼科镊钳住线栓中段往前推进,推进时可适当牵拉颈总动脉的备线,保证推进顺畅。推进过程中,约在线栓进入分叉10mm左右,有时会感觉有阻力,系由线栓穿颅时遇到狭窄所致,此时硬行推入易损伤血管。应将线栓退至切口处,调整方向重新插入。应注意线栓在血管里多次进退可诱发血小板、白细胞黏附,损伤或刺激血管内皮细胞引起某些活性物质释放诱发血栓[6],造成动物存活时间缩短。  4.2.3 当修正液所作20 mm标记通过ICA和ECA分叉处后,有时仍可继续推进,但当感觉推进受阻时,应适当退留一点空间,否则易致蛛网膜下腔出血(SAH)。  4.2.4 整个手术时程不宜超过20 min,否则大鼠容易死亡。  4.3 术后护理工作  4.3.1 术后保温术后动物尚未清醒时,必要的保温措施可减少死亡率。可用60W的白炽灯距离大鼠50 cm高度持续照射,待清醒后再撤除。过夜应将室温稳定在25℃左右为宜。低温低代谢状态对脑缺血有保护作用,而温度过高会加重脑缺血损伤,甚至导致动物死亡。  4.3.2 再灌注拔线速度拔线过快,会导致蛛网膜下腔出血甚至拉断血管,导致动物死亡。   现今有关脑缺血的基础与临床研究均取得了显著成效。作为普及面广,操作相对简便的动物模型,线栓法也在不断的实践中得到验证和改进。但由于影响因素较多,如何规范和优化手术操作,降低死亡率,使模型梗塞体积恒定,更能模拟人类发病机理,仍是亟待解决的问题。【参考文献】   [1] 黄 斌,王兴勇,匡凤梧,等. 线栓法制备Wistar大鼠局灶性脑缺血模型的实验研究[J]. 现代医药卫生,):1935.  [2] 刘 ?矗?赖新生.大脑中动脉闭阻脑缺血模型大鼠的建立与评价[J].中国行为医学科学,):877.  [3] 刘亢丁,苏志强,李逸平,等.实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进与评价[J].中风与神经疾病杂志,):87.  [4] 辛世萌,刘远洪,聂志余.栓线长度、直径、及大鼠体重与栓线法大鼠局灶性脑缺血模型关系的研究[J].大连医科大学学报,):105.  [5] 贾 茜,朱梅佳.胰岛素受体与VEG文档分类:
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页眉... 页脚. 1. 缺血再灌注后, 主要的损伤区在纹状体, 海马的 A1 区也会出现损伤。缺血再灌注损伤不是很严重海马区域就没有明显的缺血现象但是纹状体肯定有明显的缺血现象。缺血 1.5 小时再灌注后我也做过尼氏染色,海马区没有见到缺血改变,但是纹状体很明显。 2. #1 大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得本人现在正在做线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验( MCAO 模型), 这方面的资料我查了一些,这个实验我也作了一段时间,不敢说很专业了, 不过现在基本上我能在 15min 左右完成手术, 而且手术过程中不出一滴血,造模后缺血程度基本一致。虽然前面有很多前辈发了很多 MCAO 的很专业的贴子,不过我觉得比较凌乱, 现在我把我的心得体会和以前的贴子的精华部分奉献给大家,希望这会对将要做这个实验的朋友有一丝的帮助。虽然做实验总会有郁闷的时候,不过风雨之后总会见到彩虹的,这可以也是我的心得体会。衷心祝福大家能把实验做的成功、完美!!!! 实验前准备麻醉剂:水合***醛(应较好的控制大鼠体温) 保温: 60W 白炙灯高度为 37cm 直接照射能使肛温保持在 37 ℃栓线的制备: 1. 取熔点为 56 ℃的固体石蜡一块, 在瓷杯中加热熔页眉... 页脚. 化。直径为 o. 24mm 、长 5cm 的鱼线一端 5mm 长的一段, 垂直在熔化的石蜡中迅速浸入并提起,立即凝固的一薄层石蜡可牢固地粘附在鱼线一端的表面,其直径为 0.26mm 。就这样,普通的鱼线即可变成规相一致头端光滑圆钝的栓线。 2. 在鱼线 18mm 的位置用涂改液标记一个白色点。 TTC 的配制:用 0.2mol/L 磷酸缓冲液( PBS )配成 2%TTC 溶液( pH7.5 ) , 避光保存。体重与栓线直径: 线栓直径 0.24mm 采用的 SD 大鼠,体重 250-300g 。实验方法: 动物用 10 %水合***醛( 35mg/kg )腹腔注射麻醉。仰卧位固定, 颈正中线切口,沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜,分离左侧颈总动脉( CCA )、颈外动脉( ECA ) 和颈内动脉( ICA ),A 远心端和近心端及 ECA 处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭 ICA ,然 A 、 ECA 。A 分叉部 4mm 处剪一小口,将拴线插入到 ICA ,A 远心端的细线轻轻系牢拴线。(不可过紧,否则近线困难,但松了又会出血。)用眼科镊轻推拴线, 从血管分叉处开始算距离, 当插入深度在 18 mm 时(一定要将血管放松至原来状态, 且保证标记点在分叉处, 由于标记的页眉... 页脚. 是白色的所以很容易看的) ,A 远心端的细线,此时的关键是动作轻柔,不要使 ICA 有任何的牵拉,否则栓线会脱出 ACA ,可能会造成缺血失败。血管外的栓线不要留得过长,更不要缝在皮外, 大鼠醒来后会自己拔出。缝合伤口, 单笼饲养观察。如果需要再灌的话,就把拴线抽出即可,因为脑底有个动脉环, 结扎一侧颈总动脉大脑不会缺血的。注意事项: 1. 分离时要层次清楚: 正中剪开 SD 大鼠颈部皮肤, 分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体(很多人误认为那是甲状腺)结合紧密,因此不必分离过于太细,直接在正中两侧鼓泡腺体之间分离,这样能不接触胸锁乳突肌而直接暴露颈前颈群且不会损伤腺体造成过多出血。下一步是分开颈前肌群,这时候要注意用小钳子作撑开分离动作要在左右肌肉块之间而不是一块肌肉的肌纤维之间,虽然它们看起来很模糊,但这样能保证不会出现较多条索状细肌纤维条影响下一步颈内动脉的寻找与分离, 并且能整块地向一侧牵开颈前肌群暴露颈动脉鞘。见到颈动脉鞘了则要注意细致分离迷走神经,若损伤则可能影响其呼吸而死亡的。 2. 分离血管时,要尽量将血管剥离的干净些,这样在用眼科剪剪口时就不会误剪外膜(误剪的话再剪就很容易把口剪大了或者剪页眉... 页脚. 断了, 要注意口子越小越好插线), 且要剪一个斜行的切口( 眼科剪与血管约成 45 度) ,这样在血液刚流出时仍能看上翻的断口管壁, 这样即容易插入栓线且血管受得了插线时一定的牵拉。当然, 切勿牵拉过猛,以免使血管发生痉挛,导致栓线不能顺利进入。 3. 注意尽量不要损伤在颈内颈外分叉下的交感神经节。 4. 如果你用的是中长效麻醉剂, 插线成功后, 固定丝线, 然后让其俯卧位,而且稍稍抬高其颈部,才能确保模型成功。 5. 栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了, 有时候很顺利一插到底,但有时候在中间就怎么也进不去了,这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。因此,碰上这种明显阻力时,一定不能盲目向前使力插,越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。这时候正确的作法是往外抽出较多栓线,也许会有一定的动脉血流出,不必慌,只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲,一般都能进去,反复试几次还不行最好换根栓线,很可能前端也经变形角度变了! 颈内动脉的走向为内上方, 可以用眼科镊夹住鱼线插, 但进去后要注意, 别太用力, 要不血管就要破了 6. 栓线不能在血管里反复进退,否则及容易造成蛛网膜下腔出血,, 而且很容易误解为模型成功, 因为这时的神经功能改变也很页眉... 页脚. 明显,但并不是由于栓塞引起的 7. 进线时, 使栓线有一定程度的弯曲, 且只要保证栓线向屋顶方向弯曲,一般都能将线插如颅内,决不会进入翼腭 A。 8. 术后一定要注意保暖。 9. 插入线拴要轻柔熟练, 速度尽可能快, 以避免时间长了血管内血栓形成。 10 .手术后评分的主观因素很大,有用 4 分制和 11 分制的,我个人认为用 4 分制比较准些。其标准是: 0分, 无神经损伤症状;1分, 手术对侧前指不能完全伸展; 2 分,向手术对侧行走; 3 分,大鼠成追尾状运动。 11. 性激素对脑梗死面积有较大影响,应采用单一性别的动物进行实验。舍去标准: ⑴栓线插入深度不足 18 mm, 且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠⑵蛛网膜下腔出血、 MCA 起始部或其附近的 willis 环动脉有凝血页眉... 页脚. 块的大鼠,因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤,而非 MCAO/Reperfusion 损伤。 3 )手术时出血较多,症状很重的动物。死亡原因分析: 首先要找出死亡原因,解剖死亡大鼠的脑,先看是否有蛛网膜下腔出血,如有出血,表明死因是插线太深,以后注意插线深度; 如无出血,则还要再看是否有严重的半球水肿,如水肿严重,则表明死因是脑缺血时间太重,需要缩短缺血时间;如既无出血, 又无明显的脑水肿,那就要注意动物状态或生活环境是否太差。附带的其他说明: 1.. 线拴法存在一定的死亡率。对于这情况我感觉比较头疼,也希望高手指点。 2. 模型成功率和评价指标是相关联的矛盾, 手术后可根据动物的表现加以评分,确定模型是否成功,模型成功与否会对结果的评价带来影响。有可能你模型没成功,结果判断为是药物的作用效果。所以对手术后模型是否成功应该进行筛选的。另一方面,如果你做了预防给药,药效的作用也容易被认为是模型不成功,这也需要后边进行脑组织染色和1
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