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生态环境学报-7):EcologyandEnvironmentalSciencesE-mail:editor@土壤微生物生物量及多样性测定方法评述11*1，2胡婵娟，刘国华，吴雅琼1.中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室，北京.北京市科学技术情报研究所，北京100120摘要：土壤微生物作为土壤中重要的分解者，在养分的循环与转化中起着重要的作用。另外，由于其与土壤理化性质相比，对外界环境的变化更为敏感，因此，土壤微生物性质常被用作表征土壤质量的灵敏性指标，而土壤微生物生物量与微生物多样性是土壤微生物学研究中应用最广泛的指标。土壤环境复杂，微生物种类丰富多样，需要合适的研究方法才能真正打开土壤系统这个黑箱，自19世纪60年代以后，土壤微生物学在研究方法上取得了重要的进展，本文综述了微生物生物量及多样性的概念及微生物生物量和多样性研究方法的发展状况，重点就已有应用比较多的研究方法如测定微生物生物量的熏蒸法，测定微生物多样性的平板计数法、Biolog微平板计数法、磷脂脂肪酸法及分子生物学等研究方法进行了详细介绍及优缺点分析。结合现有微生物生物量及多样性的测定方法，在未来的研究中，一方面应该引入更多的新技术，发展新方法，以期探索更多的未知微生物种群；其次应该根据实验要求，完善和改进现有研究方法，使其更为统一和准确；再者，在微生物数据的分析上应该探索和借鉴更多的分析方法和手段，从而更深入更全面的解读实验当中所得到的微生物的信息。关键词：微生物生物量；微生物多样性；PLFA；Biolog中图分类号：S154.3文献标志码：A文章编号：（-1161-07土壤是微生物栖息的最重要的生活环境之一，的土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土为微生物的生长提供了大量的营养元素和良好的壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微碳源、氮源和能源。土壤微生物的数量和种类都十生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的分丰富，主要种类有细菌、放线菌、真菌和藻类等。大小以土壤微生物生物量碳来表示。土壤微生物作为地下食物网最初的分解者，是土壤1.2土壤微生物多样性的概念有机质和土壤养分C、N、P、S等转化和循环的动土壤微生物多样性又叫土壤微生物群落结构，力，并参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、是指土壤微生物群落的种类和种间差异，包括生理土壤养分的转化循环等。土壤微生物多样性与土壤功能多样性、细胞组成多样性及遗传多样性等。它和植被质量及生态系统可持续性之间存在紧密的代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制联系，微生物多样性和土壤功能之间的关系是如今和土壤胁迫对微生物群落的影响。由于它能较早地土壤学研究的重点，研究者认为80%~90%土壤过预测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最程的发生都有微生物参与[1]，尤其细菌和真菌的影有潜力的敏感性生物指标之一[5]。生物多样性指标响是多方面的，二者可以参与多种生物反应过程。在监测土壤变化和对胁迫的反应，了解土壤微生物另外，与土壤其他理化性质相比，土壤微生物对外群落状态十分重要。随着人们对环境资源保护意识界环境的变化反应更为敏感，土壤微生物性质常常的逐步加强和因人类活动造成的生物多样性丧失被用作指示土壤健康的灵敏性指标[2-4]。因此，了解日益严重，目前学术界对生物多样性问题产生了极土壤微生物生物量、活性及多样性等性质对于更好强的关注。在微生物群落研究中，微生物的均衡性、[6]的理解影响土壤健康的主要因素起着重要的作用，丰富性和多样性是常用的指标。同时对于制定良好的措施从而提高土壤质量也很2土壤微生物生物量及多样性的测定方法有意义。土壤是一个复杂的系统，为土壤微生物提供了1土壤微生物生物量及多样性的定义复杂多样的微生境，针对土壤固相、液相和气相等1.1土壤微生物生物量的概念不同的部分，人们需要合适的方法对土壤微生物进土壤微生物生物量（MB）是指土壤中体积小行研究，Pakinson[7]1971年编写的《土壤微生物生于5×103μm3的生物总量，它是活的土壤有机质部态学》是40年前较为标准的方法手册，如今随着分，但活的植物体如植物根系等不包括在内。广义微生物学研究的深入，关于土壤微生物学研究方法基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（-5）；国家“十一五”科技支撑计划资助项目（2006BAC01A01）作者简介：胡婵娟（1981年生），女，博士，主要进行景观生态学和土壤生态学的研究。E-mail:*通讯作者，E-mail:ghliu@收稿日期：162生态环境学报第20卷第6-7期（2011年7月）的著作越来越多[8-
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污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法
%&’%(&)*)+,&%-,.,&%&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&第!&卷第#$期!$$&年#$月生态学报/012!&，.02#$)342，!$$&
污染土壤微生物群落结构多样性及
功能多样性测定方法
陈承利，廖敏!，曾路生
5#$$!6）（污染环境修复与生态健康教育部重点实验室，浙江大学环境与资源学院，杭州摘要：土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用，土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况，非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法，包括生物化学技术和分子生物学技术，现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述，同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。
关键词：污染土壤；微生物多样性；分子生物学；8,)*)+；Y*S%；Y&R；Z.%
文章编号：（!$$&）#$$$&$655#$&59$9&$6中图分类号：[#95，[65:，-#;9文献标识码：%
5)’3&%6’&*)&6#2)’3)*(,2&7(&8,&**#$(’46’2#,’#2)&$%9#$,’(&$&8%(-)26(’4($/&88#’)%6&(86
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收稿日期：修订日期：!$$;&$&&!7；!$$&&$;&!$
作者简介：陈承利（#6:!=），男，浙江平阳，硕士，主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究2(&&?@1：313ABC#6:!D#&5E30&
1@?0&@CDLMK2BIK23C0F1@?0&@CLMK#D#&5E30&!通讯作者&0FFBGH0CI@CJ?K4A0F2(&&?@1：
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, 2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法陈承利, 廖敏 , 曾路生 * ( 污染环境修复与生态健康教育部重点实验室, 浙江大学环境与资源学院, ...农药污染对 土壤微生物 群落功 能多样性的影响 姚市上 学啦 物科学 与挂 ...现锌污 染会 影响 壤微 生物 研发 群落 结构平 功能 多样性 u3。实验对 ...土壤微生物多样性包括微生物群落功能多样性 、 结构多样性及分子遗传多样性 ,是指示土壤 生态系统稳定性及其功能的重要传感器 。本文基于分离培养以及生物标志分子...1.2 土壤微生物多样性的概念 土壤微生物多样性又叫土壤微生物群落结构, 是指土壤微生物群落的种类和种间差异,包括生理 功能多样性、细胞组成多样性及遗传多样性...维普资讯
污染土壤微生物群落结构 多样 性及功能 多样 性测定方法 陈承利 廖敏 曾路生 污染环境修 与生念 健康 教 育部 重点实验 , ...[ 结论 ] 土壤微生物群落结构多样性特征的变化在一定程度上揭示了外源污染物胁迫下环境微生物种群作用机理。 关键词 污泥 ; 微生物结构多样性 ; 磷脂脂肪酸 ; ...维普资讯
污染土壤微生物群落结构 多样 性及功能 多样 性测定方法 陈承利 廖敏 曾路生 污染环境修 与生念 健康 教 育部 重点实验 , ...cn 4 期 刘开朗 : 环境微生物群落结构与功能多样性研究方法 等 1075 分离培养方法对环境微生物群落结构及多样性的认识是不全面和有选择性的 。近年来 ,随着...治理各类环境污染、 维持生态服务功能以及促 进土壤持续利用等方面具有重要意义[...土壤样品采用不 同的提取方法和条件, 也可能会偏差估计微生物群落 结构多样性。...污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法_图文_百度文库
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土壤微生物多样性的研究方法
安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００７，３５（３２）：１０３７３－１０３７４，１０３８７责任编辑姜丽责任校对王淼
土壤微生物多样性的研究方法
张旭霞，刘左军，陈正宏
（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州７３００５０）
摘要回顾了土壤微生物物种多样性的研究方法，并对不同的方法的优劣进行了说明，以便在研究中选择适宜的研究方法。关键词土壤微生物；多样性；方法
文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１中图分类号Ｓ１５４．３（２００７）３２－１０３７３－０２
ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｏｎＳｏｉｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＤｉｖｅｒｓｉｔｙ
ＺＨＡＮＧＸｕ!ｘｉａｅｔａｌ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ７３００５０）
ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｎｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗｅｒｅｅｌａｂｏｒａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｓｔｒｏｎｇｐｏｉｎｔｓａｎｄｆｌａｗｓｗｅｒｅｅｘｐｌａｉｎｅｄ，ｆｏｒｃｈｏｏｓｉｎｇｆｅａｓｉｂｌｅｍｅｔｈｏｄｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＳｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓ；Ｓｐｅｃｉｅｓｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｍｅｔｈｏｄ
与植物存在形态和分化的多样性不同，微生物的多样性在形态和分化方面表现并不突出，而主要表现在物种、生理生化和基因水平上。目前，人们已经知道的微生物，仅细菌包括放线菌，就近５０００种［１］，然而这仅占所有细菌的０．１％
物研究并不很适合。如在自然土壤生态环境下，许多土壤微生物处于贫营养状态，而在实验室用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定土壤活细菌的总数时，因大量的贫营养微生物不适宜生长，其测定结果误差大；一般实验室在分离培养土壤细菌时，通常只是在２８℃下培养，尽管土壤中存在高温由于传统的平型细菌，但土壤中的低温型细菌却被忽视了。
板培养方法只能反应极少数微生物的信息，通过这些结果不能充分反映土壤微生物生态功能，也埋没了大量有很大应用价值的微生物资源。用传统的方法得到的多样性结果代表自然环境中的微生物多样性是非常片面的。
～１．０％，还有绝大多数迄今为止还无法进行分离培养，土壤
微生物多样性已引起国内外学者的极大重视。为此，笔者就目前土壤微生物多样性研究方法进行了评述，以便在今后研究中选择适宜的研究方法。
经典研究方法介绍原理
利用一定的培养基和方法（表１）选择所需要的
生物，富集培养的策略是复制与小生境尽可能一样的资源和条件，然后探测这个小生境里可能栖居的微生物类群，因而具备进一步作微生物组成分析的优越性。
表１分离对象放线菌真菌
土壤微生物三大类菌的分离培养方法培养基名称高氏合成１号马丁氏
培养温度∥℃
培养时间∥ｄ
分子生物学方法介绍类型及原理
一种通过分析原核或真核细胞２．１．１ｒＲＮＡ寡核苷酸分析。
中最稳定的ｒＲＮＡ寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。在漫长的生物进化历史中，由于ｒＲＮＡ始终执行着相同的生理功能，因此其核苷酸序列的变化要比ＤＮＡ中的相应变化慢得多和保守得多。由此，ｒＲＮＡ被人称作细胞中的，也可看作为生“活化石”物演变的时间钟。原核生物ｒＲＮＡ分为３种，即２３Ｓ、１６Ｓ、和５ＳｒＲＮＡ，而真核生物ｒＲＮＡ也分为３种，即２３Ｓ、１８Ｓ、和５．８ＳｒＲＮＡ［４］。
普遍存在于原核生物中的１６ＳｒＲＮＡ（约１５４０个核苷酸）和真核生物中其同源分子的１８ＳｒＲＮＡ（约２３００个核苷酸），不但核苷酸数适中，而且信息量大，易于分析，故成了理想的研究材料，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。ｒＲＮＡ具有的优点：①参与蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的；②在细胞中含量高，易提取；③编码ｒＲＮＡ的基因十分稳定；④在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域。因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
５～７５～７
２８～３０２８～３０
在试验过注：样品为土样；分离方法为稀释分离；稀释度为１０－５～１０－７。
程中应根据土壤本身的情况选择适宜的稀释度。
１．２优势与存在的问题经典的方法不仅简单易于掌握，
而且在测定数量的同时可以分离出纯培养菌，并可进一步做微生物组分分析。不论目前使用的是哪一种方法，所得到的结果都只能给人们一个相对的概念。但是相对的概念也是有意义的，毕竟反映了土壤微生物生命活动的一定规律［２］。因此，目前国内依然比较普遍地使用这些方法。
传统的土壤生态系统中，微生物群落多样性及结构的分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状或者特定的表现型来分析，因而其结果仅局限于从固体培养基上分离微生物。随着人们对土壤中微生物原位生存状态的研究，越来越发现常规的分离培养方法很难全面地估价微生物群落多样性。从土壤中简单提取和平板培养计数不能得到土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息［３］。纯培养方法和原理大多是从研究有关医用微生物的方法中引用过来的，有些方法对土壤微生
科技部国际科技合作计划项目资助（编号：２００４ＤＦＢ００２０）；
兰州理工大学学生科技创新基金资助。
作者简介张旭霞（１９８１－），女，陕西乾县人，硕士研究生，研究方向：
恢复生态学。
收稿日期２００７!０６!１３基金项目
１６Ｓ或１８ＳｒＲＮＡ寡核苷酸编目分析所依据的基本原
理：用一种ＲＮＡ酶水解ｒＲＮＡ后可产生一系列的寡核苷酸片断，两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其所产生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然［４］。
１６Ｓ～２３ＳｒＲＮＡ间区（ＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃＳｐａｃｅｒＲｅｇｉｏｎ，ＩＳＲ）由
于没有特定功能和进化速率，比１６ＳｒＲＮＡ大１０倍，近年来在细菌鉴定和分类方面倍受关注。ＰＣＲ所利用的引物往
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