稳定转移稳定细胞株建立怎么筛选 luci

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-08-11 06:33 标签： 细胞株筛选
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Luciferase稳定表达T24细胞株
货号：CL003
Luciferase T24细胞稳定表达萤火虫荧光素酶。该细胞株性状稳定，培养时不需要添加抗生素维持。可用作萤火虫荧光素酶活性检测中的阳性对照，也可用于活体动物成像实验。
细胞特性：
细胞名称：T24-Luci
细胞来源：T24细胞(人膀胱癌细胞）
表达蛋白：Luciferase
构建载体：
筛选抗生素：嘌呤霉素
培养基：1640培养基+10%FBS
细胞培养方法：
以25cm培养瓶传代为例。
1、传代前将细胞培养液、PBS和胰蛋白酶温浴到37℃。
2、吸去细胞培养液。
3、用PBS漂洗1到2次。
4、加入3ml胰蛋白酶，轻轻晃动细胞瓶，使胰蛋白酶均匀覆盖细胞。吸去胰蛋白酶，将培养瓶放置在细胞培养箱中，37摄氏度消化。由于配制的胰蛋白酶活力有差别，消化时间可用30秒到1分钟。
5、加入5ml 细胞培养基，用吸管轻柔吹打分散细胞。
6、按1:3到1:5接种细胞。
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BHK-21-EGFP细胞株是用表达EGFP的慢病毒感染BHK-21细胞，经嘌呤霉素筛选得到的多克隆细胞株。细胞稳定表达EGFP荧光蛋白，培养时无需抗生素维持。可作为慢病毒感染实验中的对照细胞株使用。
细胞特性：细胞来源：BHK-21(乳仓鼠肾细胞）细胞类型：EGFP稳定过表达多克隆细胞株表达蛋白：EGFP构建载体：筛选抗生素：培养基：DMEM培养基+10%FBS
构建方法：包装为慢病毒，转染BHK-21细胞，经嘌呤霉素筛选得到稳定表达EGFP荧光蛋白的多克隆细胞株。
细胞培养方法：以25cm培养瓶传代为例。1、传代前将细胞培养液、PBS和胰蛋白酶温浴到37℃。2、吸去细胞培养液。3、用PBS漂洗1到2次。4、加入3ml胰蛋白酶，轻轻晃动细胞瓶，使胰蛋白酶均匀覆盖细胞。吸去胰蛋白酶，将培养瓶放置在细胞培养箱中，37摄氏度消化。由于配制的胰蛋白酶活力有差别，消化时间可用30秒到1分钟。应在倒置显微镜下观察，看到细胞分开及稍微变圆即可。5、加入5ml 细胞培养基，用吸管轻柔吹打分散细胞。6、按1:5接种细胞。7、一般2-3天传代一次。
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Luciferase HepG2细胞是慢病毒系统构建的，稳定表达萤火虫荧光素酶的。该性状稳定，培养时不需要添加抗生素维持。可用作萤火虫荧光素酶活性检测中的阳性对照，也可用于活体动物成像实验。
细胞特性：细胞名称：HepG2-Luci细胞来源：HepG2细胞(人肝癌细胞）表达蛋白：Luciferase构建载体：筛选抗生素：嘌呤霉素培养基：DMEM高糖培养基+10%FBS 细胞培养方法：以25cm培养瓶传代为例。1、传代前将细胞培养液、PBS和胰蛋白酶温浴到37℃。2、吸去细胞培养液。3、用PBS漂洗1到2次。4、加入3ml胰蛋白酶，轻轻晃动细胞瓶，使胰蛋白酶均匀覆盖细胞。吸去胰蛋白酶，将培养瓶放置在细胞培养箱中，37摄氏度消化。由于配制的胰蛋白酶活力有差别，消化时间可用30秒到1分钟。5、加入5ml 细胞培养基，用吸管轻柔吹打分散细胞。6、按1:3到1:5接种细胞。
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产品说明：
pLV-CRE-Luci载体采用报告基因luciferase检测cAMP信号通路活性。该载体的CRE启动子由多个CRE原件（cAMP Response Element）和Minimal启动子组成。CRE是转录因子CREB（CRE binding protein）的DNA结合序列。CREB磷酸化后结合到CRE，从而启动下游基因转录，产生cAMP信号通路激活的多种反应。cAMP信号通路参与多种生物功能调控，如细胞增殖、心率及记忆等。
在pLV-CRE-Luci载体，CREB激活后结合到载体的CRE，启动luciferase报告基因的表达。
pLV-CRE-Luci载体生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件。在包装载体pH1和pH2（货号KLV3500）的配合下可以产生慢病毒。该载体主要用于CRE-Luciferase报告基因。
产品资料：
品名：pLV-CRE-Luci载体
货号：VL4102
类型：细胞信号通路研究慢病毒载体
基因启动子：cAMP Response Elements promoter
报告基因：Luciferase
真核细胞筛选抗性：Puromycin
原核抗性：Ampicillin
载体图谱：
使用步骤简介：
包装慢病毒→慢病毒感染目的细胞株→筛选出CRE-Luciferase报告基因稳转细胞株→通过稳转细胞株研究cAMP信号通路。
使用说明：
1、 本产品提供质粒小提产物，约3-5ug质粒。不能直接用于转染实验。收到产品后请转化大肠杆菌感受态，制备转染级质粒。并及时冻存质粒和菌种。
2、 转化时采用含Ampicillin 50-60ug/ml的LB平板及培养基。
3、 真核筛选抗性为puromycin，使用浓度一般为0.5-10ug/ml。不同细胞株的最佳筛选浓度差别很大，需要在实验前通过预实验确定。实验方法请见：。
构建方法：
将慢病毒载体包装为慢病毒，转染293V细胞，用嘌呤霉素进行初步筛选。将筛选后的细胞进行单克隆细胞培养，检测克隆株的EGFP本底表达及对CRE信号通路激活的反应性。最后得到能灵敏反应NFAT激活的克隆株。
注意事项：
1、 该载体不适用于瞬时转染的方法研究信号通路活性。
2、 由于慢病毒载体本身特点，不能在CRE promoter添加polyA终止信号，所以如果病毒转染时恰好整合到细胞内高表达基因启动子的下游，就会出现本底表达比较高的情况。我们推荐转染后挑选单克隆细胞株，从中选出Luciferase本底活性低，对刺激反应灵敏的细胞。
实验举例：
CRE-RE-Luci细胞株功能检测实验结果。采用用forskolin 5uM刺激6小时，收集细胞裂解后加入萤火虫荧光素酶反应底物，化学发光成像仪成像。
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