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微生物技术部分幻灯片.ppt 41页
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二、基本操作程序（以大肠杆菌的纯化为例） 配制培养基 包装器材 灭菌 菌种扩增 倒平板 接种 倒置培养 观察、记录、分析 保存菌种 高压蒸汽 平板划线法 稀释涂布平板法 恒温培养箱 平板和一个未接种的平板，恒温37℃倒置培养
恒温箱中培养 原液 稀释101倍 稀释103倍 稀释102倍 菌种的保存 （1）临时保藏 固体斜面培养基：4℃，3~6月转接新培养基 （2）长期保藏 甘油管藏： 菌液：灭菌甘油=1：1混合，-20℃ 芽孢
A、某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢
被埋在琥珀中达2500万年的芽孢，当放到营养培养基上时仍可萌发生长。 ?  * 微量移液器的使用 第一档 第二档 严禁超越两端极限量程 使用结束后，将刻度调回最大量程 一档吸
二档排 * 微量移液器的使用 * 普通培养基在空气中放置10min，培养后出现菌落 哪些方面需要注意呢？培养微生物用什么？实验室提供给微生物的食物是什么？（培养基）住房呢？（培养瓶，培养皿）把微生物放进去的时候会接触到空气，空气中也是有杂菌的，我们是操作者，手，衣服都有微生物。所以方方面面都要注意到。 有什么方法可以去除微生物呢？（分类成消毒和灭菌） 酒精灯在超净台以外（无风）操作的时候，利用火焰气流上升， 在其附近区域可以保证没有空气中的尘埃落下污染培养基等， 5cm左右 * 拿热水烫一下。SARS的时候，我们都带口罩，有些不是一次性的口罩就每天拿热水煮或烫一下。 巴氏消毒法：牛奶（不耐高温的液体） 化学药剂消毒：医院注射之前酒精擦拭 芽孢：细菌的休眠体
孢子：微生物的繁殖体 种方法。本办法，主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等，用于设施、设备或粉末状的医药品等，使用气体灭菌时，其被灭菌的物品以未变质为前提条件。
　　2、药液灭菌法，是用药液杀灭微生物的方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等物品的灭菌，还可用于手指、无菌箱或无菌设备等的消毒，药液灭菌用于未变质的物品。通常使用的有乙醇（洒精）0.1—1w/v%盐化苯类溶液、甲酚、苯酚水或福尔马林水等。 * * 在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。大概外焰400℃、中焰500℃、内焰300℃，；
* 干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化）
3. 恒温箱中培养 4. 菌种的保存 培养基（微生物所需的营养物质，加入琼脂——固体培养基，不加琼脂，液体培养基） 100ml培养基 * 固体培养基——用培养皿，液体培养基——三角瓶，敞着口？棉塞 * 1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化）
3. 恒温箱中培养 4. 菌种的保存 * 待三角瓶中的LB固体培养基冷到60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子从广口瓶中夹出酒精棉球擦试桌面和手。 注意：一定要在擦试手之前点燃酒精灯，以免发生危险。
在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里。注意一定不要把培养基沾在培养皿壁上，以免污染。 1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化）
3. 恒温箱中培养 4. 菌种的保存 * 1. 培养基的制备 2. 微生物接种（纯化）
3. 恒温箱中培养
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改 分子生物学验-实验操作1.ppt31页
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重组人白介素-18 rhIL-18 基因工程菌的构建 分子生物学实验-实验操作 基因、载体、受体菌株 实验技术要求 应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳 考察指标 电泳、蓝白斑数量 电泳 感受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳
实验流程: 第一天 8AM-5PM 实验流程: 第二天 8AM-5PM 实验流程: 第三天 1PM-5PM 实验流程: 第四天 8AM-5PM 双酶切反应（20μL体系） rhIL-18的PCR产物
目的基因 6.8μL
无菌水 9μL BSA 0.2μL BglⅡ 2μL PstⅠ 2μL
质粒 10μL
无菌水 6μL BamHⅠ 2μL PstⅠ 2μL Hybrid site 培养基配制 LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 滴加0.2mL 5mol/L NaOH ，调节pH值至7.0
LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂
每组准备： 3个30ml 液体培养基 120ml 固体培养基 灭菌 5个培养皿
3个30ml LB 液体培养基
1个120ml LB 固体培养基
一个50ml 离心筒
微量移液器枪头 琼脂糖电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。
DNA 的分子大小 琼脂糖浓度
DNA 分子的构象 电源电压
嵌入染料的存在
离子强度影响
琼脂糖凝胶制作图示 琼脂糖凝胶的配制 称取0.3g琼脂糖，加入30ml 1×TAE缓冲液，于微波炉中加热沸腾3次。 取出稍冷后加入3μL基因染料，混匀。 将凝胶倒入调平的凝胶板上，插入梳子。 冷却。
琼脂糖凝胶回收 琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒 分别对：
目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收
载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收
琼脂糖凝胶回收 1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2.将单一的质粒条带从琼脂糖
正在加载中，请稍后...平板划线分离法(培养皿,培养基,接种针,菌落) - 微生物 - 生物秀
标题: 平板划线分离法(培养皿,培养基,接种针,菌落)
摘要: [平板划线分离法(培养皿,培养基,接种针,菌落)] ①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。
②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、 [关键词:培养皿 培养基 接种针 菌落 菌种 营养 固体培养基 锥形]……
①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。
②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。
③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。
④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯。如果很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。
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微生物培养及利用.ppt 57页
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四、菌种的保藏 1.斜面保藏 临时保存 2.甘油保藏 长期保存
3、某种微生物数量的测定 生长：个体体积的增加 繁殖：个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新
个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与 研究大生物时有所不同。 细菌太小，往往讨论其群体生长。 （一）微生物生长概述
1、稀释平板计数法
对样品进行适当稀释
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖 →
肉眼可见的菌落 →
对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数
（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定 同一稀释度三个以上重复,取平均值； 每支移液管及涂布器只能接触一个 稀释度的菌液； 样品充分混匀； 每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数； 要求： 每克样品中的菌株数=（C/V）* M 2.显微镜直接计数法
采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下直接计数 （计算一定容积里样品中微生物的数量）。
取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。
取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 用10×镜观察并将计数室移至视野中央。
在10×镜下计数：计数4个（或5个）中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出计数区总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。 注意事项：计上不计下，计左不计右。出芽计一半 必修3P68 显微镜直接计数法缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； ?? 课题名称 实验仪器和设备 ?? 实验试剂或药品 说明 微生物的实验室培养 培养皿、试管、锥形瓶、量筒、酒精灯、电子天秤、高压蒸汽灭菌锅、移液管、接种环、涂布器、恒温箱、干热灭菌箱、小铁铲等 ? ? 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、琼脂等 干热灭菌箱能够迅速地将洗干净的培养皿和试管烘干，小铁铲用于铲土 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外，增加KH2PO4 、NaHPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、酚红等 分解纤维素的微生物的分离 除配制牛肉膏蛋白胨培养基所需物质外，增加纤维素、NaNO3、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、KCl、酵母膏、水解酪素、CMC-Na(羧甲基纤维素钠)、土豆汁、刚果红等
选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）
将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上
挑选单菌落
土壤中某样品细菌的分离与计数流程图表示如下：
（09宁夏理综）32．生物选考题 A．[生物———选修I生物技术实践] 某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。 （1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了___
。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是____
和 ____。 （2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是____ __
_。 碳源 氮源 无机盐 高压蒸汽灭菌 水 （09宁夏理综）32．生物选考题 （3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于______
中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种______
作为对照进行实验。 （4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有_____种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_______。 （5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐_______细菌，这种培养基被称为____。 恒温培养箱 无菌水 多 高 盐（或NaCl） 选择性培养基 4、利用微生物进行发酵来生产特定的产物 （1）果酒和果醋的制作 （2）腐乳的制作 （1）果酒和果醋的制作 果酒制作的原理： 酵 母 菌 有氧呼吸 无氧呼吸 酶 C6H12O6
6CO2 + 12H2O+能量 C6H12O6
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