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【原创】激活了信号通路，该检测哪个蛋白才能证明确实激活了？
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这个帖子发布于7年零134天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
常用的几个信号通路，NFKB,TGF-beta,WNT,，假如我用激活剂激活了这些信号通路，那如何证明信号通路确实被激活了？除了报告载体以外，用western检测哪些关键蛋白，才能证明确实激活了？
不知道邀请谁？试试他们
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关于Wnt信号通路我想再补充一下：1、Wnt信号通路有三条：经典的Wnt信号通路、PCP通路和Wnt钙离子通路。PCP通路的下游基因由c-Jun和JNK，可以检测他们的磷酸化水平。而Wnt钙离子通路的研究不是很清楚，主要跟细胞内Ca2+的释放有关。2、经典Wnt信号通路主要是通过beta-catenin与TCF蛋白家族成员（包括TCF1、LEF-1、TCF3和TCF4）形成转录激活复合物，激活包括cyclin D1在内的下游靶基因的转录。要检测该通路的激活可以检测Lef-1或TCF（如Top/Fop系统)荧光素酶报告系统的活性。另外还可检测游离beta-catenin的含量的变化；如果只检测蛋白水平变化的话，建议检测核内beta-catenin的变化，只有核内beta-catenin的水平才表示Wnt信号的激活与否（核内beta-catenin升高表示Wnt信号激活，反之，抑制）。另外也有检测beta-catenin磷酸的，但磷酸化beta-catenin被E3连接酶识别，然后被降解，所以若外界刺激激活了Wnt信号通路则磷酸化的beta-catenin的水平降低，而总的beta-catenin的水平应该是升高的。如果楼主还想了解更详细的信息。推荐一个Wnt的网站http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html，里面有关于Wnt信号通路的各个方面的据介绍。
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pharmaceutic 编辑于
如果你想研究机制，也就是你的外源性刺激是怎么激活某个通路的，我认为是从上到下做，配合好工具药物和各种干扰手段，如果就是想看个结果，也就是看哪个通路被激活了，那就测个下游信号吧。但是，你要知道，因为很下游，所以受到调控的因素会很多，而且信号被放大很多，同一个刺激完全可能会激活很多种下游信号。比如比较下游的ERK，Gi，Gq，Gs，TKR，都可以刺激MAPK，不管是直接的还是间接的。另外检测的时间非常重要，转录调控中有快反应的，有慢反应的。
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（1）western主要检测信号系统中的蛋白磷酸化水平，如果磷酸化水平升高则说明蛋白激活了。（2）另外还有检测NF-kB和DNA的结合水平，主要采用EMSA，和报告基因的方法。（3）检测TNF,IL,iNOS,COX-2的mRNA表达（RT-PCR）（4） 检测IkB的磷酸化，泛素化和降解（IP,Western）。（5）需要检测的蛋白主要包括：IKKa,IKKb,IkB-a,NF-kB,Akt,TAK1,TAB1,TAB2,NF-kB,COX-2,iNOS等。
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对于wnt通路，可检测β-catenin的表达。
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越上游越好
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不是越下游越好么？最好是最后起作用的转录因子？
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如果你想研究机制，也就是你的外源性刺激是怎么激活某个通路的，我认为是从上到下做，配合好工具药物和各种干扰手段，如果就是想看个结果，也就是看哪个通路被激活了，那就测个下游信号吧。但是，你要知道，因为很下游，所以受到调控的因素会很多，而且信号被放大很多，同一个刺激完全可能会激活很多种下游信号。比如比较下游的ERK，Gi，Gq，Gs，TKR，都可以刺激MAPK，不管是直接的还是间接的。另外检测的时间非常重要，转录调控中有快反应的，有慢反应的。
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我发现，敢自称“笨笨”的人往往都不笨，笨笨看来是信号传导的高手，以后还望多来本版指导！！
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（1）western主要检测信号系统中的蛋白磷酸化水平，如果磷酸化水平升高则说明蛋白激活了。（2）另外还有检测NF-kB和DNA的结合水平，主要采用EMSA，和报告基因的方法。（3）检测TNF,IL,iNOS,COX-2的mRNA表达（RT-PCR）（4） 检测IkB的磷酸化，泛素化和降解（IP,Western）。（5）需要检测的蛋白主要包括：IKKa,IKKb,IkB-a,NF-kB,Akt,TAK1,TAB1,TAB2,NF-kB,COX-2,iNOS等。
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magichunter总结的很好，在下有一小小的补充：磷酸化水平升高一般而言说明蛋白激活了，但也有一些例外，比如phospho-Src(Tyr527)升高则反而说明蛋白抑制了，另外PTEN的磷酸化水平升高也不能说明蛋白激活了， ...
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关于Wnt信号通路我想再补充一下：1、Wnt信号通路有三条：经典的Wnt信号通路、PCP通路和Wnt钙离子通路。PCP通路的下游基因由c-Jun和JNK，可以检测他们的磷酸化水平。而Wnt钙离子通路的研究不是很清楚，主要跟细胞内Ca2+的释放有关。2、经典Wnt信号通路主要是通过beta-catenin与TCF蛋白家族成员（包括TCF1、LEF-1、TCF3和TCF4）形成转录激活复合物，激活包括cyclin D1在内的下游靶基因的转录。要检测该通路的激活可以检测Lef-1或TCF（如Top/Fop系统)荧光素酶报告系统的活性。另外还可检测游离beta-catenin的含量的变化；如果只检测蛋白水平变化的话，建议检测核内beta-catenin的变化，只有核内beta-catenin的水平才表示Wnt信号的激活与否（核内beta-catenin升高表示Wnt信号激活，反之，抑制）。另外也有检测beta-catenin磷酸的，但磷酸化beta-catenin被E3连接酶识别，然后被降解，所以若外界刺激激活了Wnt信号通路则磷酸化的beta-catenin的水平降低，而总的beta-catenin的水平应该是升高的。如果楼主还想了解更详细的信息。推荐一个Wnt的网站http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html，里面有关于Wnt信号通路的各个方面的据介绍。
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pharmaceutic 编辑于
谢谢上面的各位发言，收获了
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可以筛选蛋白吧。比如说我做ERS，要确定某一病毒的蛋白是否能够产生内质网应激，就把这个病毒的蛋白质粒构建出来，针对某一通路激活的标志蛋白质粒，用双荧光素酶测定就OK啦！
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如果知道该信号通路激活后的表型，直接通过表型检测更为直接的证据magichunter推荐的方法
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好贴~学习了~~
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如果证明激活了TGF-β/Smad通路，最好检测磷酸化的Smad2、磷酸化的Smad3。
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学习学习学习
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好贴，我最近也想做做这方面的实验，，希望今后和大家多多交流
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向亲们学习
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想做wnt通路，还有很多不会，希望大家多多指教~~~
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最近也打算做wnt/ca2通路的凋亡
想请问下各位前辈
要证明这个通路被激活 做磷酸化wnt5a 和PLC、NFAT可以了么
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这种好贴应该顶起来~希望有更多知识交流哇
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老大，有时间来徐州玩
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感谢楼主，好帖！
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我想问一下 要是想检测MAPK的三条经典通路有没有被激活
我需要检测那些蛋白呢？老师给的意见是ERK/P-ERK 、JNK/p-jnk、P38/P-P38这六个蛋白怎么变化才算是激活了呢？涉及到本科毕业实验问题
请各位前辈指导赐教！！！万分感谢
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关于丁香园蛋白小变化&疾病大影响&RAS&MAPK&MSK1通路可调节ataxin1蛋白水平及其毒性
近日，贝勒医学院等机构的研究人员表示，对于某些神经退行性疾病的治疗方案也许并不一定是极端的“全有或全无”（&all-or-nothing）策略。也许只需要将蛋白减少一点点这样的“中庸之道”就能解决问题。他们将这一发现刊登在了近期出版的《自然》（Nature）杂志上。
研究人员表示，对于某些神经退行性疾病，尤其是脊髓小脑共济失调1型（spinocerebellar&ataxia&1,&SCA1）这一破坏性的遗传疾病。只需将&ataxin-1&蛋白水平降低20%，就可以减轻许多的疾病症状。在这项研究中，科学家们确定了细胞内一条分子信号通路&RAS/MAPK/MSK1，以及轻微调节就可以降低缺陷性&ataxin-1&水平的元件。&ataxin-1&蛋白是导致脊髓小脑共济失调1型患者发病的原因。
当&ataxin-1&基因发生突变时，外显子内一段&CAG&重复序列扩增数倍，突变基因编码的异常蛋白无法正确折叠，在细胞内累积，最终导致细胞死亡，引发了脊髓小脑性共济失调1型。与许多的神经退行性疾病一样，这一过程需要十年的时间。通常个体要到30岁或以上时，才会显现症状。患者表现步态异常，丧失说话能力，以及其他功能障碍，最终死亡。1993年，这组作者合作发现了这一与疾病相关的基因。在过去的20年里他们一直致力于该疾病的研究工作。
完全除去这一蛋白，这一策略行不通。缺失&ataxin-1&基因的小鼠会产生学习和记忆问题，表明&ataxin-1&在这些活动中起作用。降低&ataxin-1&水平并不能治愈这一疾病，但却能够显著延迟发病。于是，研究人员着手筛查能够操控以减少&ataxin-1&水平的基因或基因信号通路。
研究人员分别在动物模型、果蝇模型以及&人类细胞系的细胞内筛查了可以影响&ataxin-1&水平的基因。
研究人员将人类细胞中的筛查焦点放在了激酶上，因为它们容易受到药物的影响。利用一种称作&RNA&沉默的特殊技术，他们靶向了每个已知的人类激酶。同时，另一组科学家在脊髓小脑共济失调1型果蝇中筛查了激酶基因。当将两项结果进行对比之时，他们发现共有&10&个基因在受到抑制时，降低了&ataxin-1&水平以及相关毒性作用。这些基因是细胞内&RAS/MAPK/MSKI&信号级联反应的组成部分。
随后研究人员将侧重点放到了这一信号通路中一个称作为&MSK1&的蛋白质上，他们发现当脊髓小脑共济失调&1&型小鼠中的&MSK1&水平减少时，&ataxin-1&水平下降，动物症状得到改善。这一最后的实验证实了降低这一蛋白的水平可以延缓这一疾病。
研究人员比喻道：“如果你感觉疼痛，就总是服用醋氨酚，你会有中毒的风险。同样的，如果你一直服用一种非甾体抗炎药，在你体内将会产生其他的毒性作用。如果你交替使用两种药物，毒性就会少一些。如果我们只在很大程度上抑制一条信号通路，我们会冒上一些中毒的风险。我们还想寻找更多的信号通路，如果找到更多的信号通路，或许就能够减少毒性。如果我们能找到2或3条信号通路，对每一个都只进行轻微控制，身体的其他部位就不会受到伤害。每个控制一点点，应该可以帮助我们将&ataxin-1&降低相当的量。”
研究人员表示，这项研究的的独特之处在于，结合了细胞筛查和果蝇筛查，使得研究人员提早找到了一无所知的基因的靶标。这些研究发现不仅对于脊髓小脑性共济失调1型具有重要意义，它在其他疾病中的潜在应用更加诱人。
研究人员指出，这是一个初步的研究。现在科学家知道了它能对&ataxin-1&起作用，就可以重访在诸如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、亨廷顿氏病和其他神经系统疾病等散发性和遗传性疾病中，许多因水平异常驱动神经退行性变的蛋白。有一些疾病的形成需要很长的时间。大多数的阿尔茨海默氏症在85岁后发病。如果我们能将它延迟到95岁，那也将是非常有帮助的。
这项研究成果让神经病理学家们异常地接近目标，有助于指引大量其他的神经退行性疾病研究工作。
原文检索：
Jeehye&Park,&Ismael&Al-Ramahi,&Qiumin&Tan,&Nissa&Mollema,&Javier&R.&Diaz-Garcia,&Tatiana&Gallego-Flores,&Hsiang-Chih&Lu,&Sarita&Lagalwar,&Lisa&Duvick,&Hyojin&Kang,&Yoontae&Lee,&Paymaan&Jafar-Nejad,&Layal&S.&Sayegh,&Ronald&Richman,&Xiuyun&Liu,&Yan&Gao,&Chad&A.&Shaw,&J.&Simon&C.&Arthur,&Harry&T.&Orr,&Thomas&F.&Westbrook,&Juan&Botas&&&Huda&Y.&Zoghbi.&RAS&MAPK&MSK1&pathway&modulates&ataxin&1&protein&levels&and&toxicity&in&SCA1.&Nature,&29&May&2013;&doi:10.1038/nature12204
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