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（论文）人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266对TRAIL耐药的机制探讨
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（论文）人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266对TRAIL耐药
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Notch信号抑制剂抑制骨髓瘤细胞增殖的机理研究
目的：观察PHI对骨髓瘤细胞株增殖、凋亡的作用，研究PHI对骨髓瘤细胞Notch信号通路及PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响，阐述抑制增殖、诱导凋亡的分子机制。　　
方法：含10％胎牛血清的RPMI1640培养基体外培养RPMI8226细胞和U266细胞，用Western blot方法及免疫细胞化学方法检测细胞上Notch信号蛋白的定位及表达情况。给予不同浓度的PHI和GSI分别处理瘤细胞24h、48h和72h，通过台盼兰测定细胞活力，MTT 法检测细胞增殖抑制情况。利用DAPI 染色，荧光显微镜观察细胞形态了解细胞凋亡情况。通过流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响。药物干预后提取细胞总蛋白，通过Western blot方法检测Notch通路蛋白表达变化，以及下游磷酸化Akt及Bcl-2蛋白表达情况。酶联免疫吸附试验（Elisa）检测细胞分泌的VEGF变化情况。　　
结果：与正常人淋巴细胞相比，Western blot和免疫细胞化学染色法检测骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞和U266细胞高表达Notch通路蛋白：在RPMI8226细胞中，Notch1蛋白主要表达于细胞膜和细胞核上，Jagged1蛋白主要定位于细胞膜上；而在U266细胞中，Jagged1表达于细胞膜上；与对照组相比，PHI及GSI分别处理后的RPMI8226细胞经DAPI染色后荧光显微镜可见细胞核固缩、折叠，染色质高度凝聚，细胞核可裂解为碎片，产生凋亡小体；不同浓度的PHI和GSI作用于RPMI8226细胞后,细胞增殖水平明显下降(P<0.05)，且对细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量依赖性。PHI作用于RPMI8226细胞后使细胞周期阻滞在G0/G1期。Western blot结果分析显示PHI和GSI作用于RPMI8226细胞后Notch1、Jagged1/2及下游蛋白p-Akt、Bcl-2表达明显下调（P<0.05）；酶联免疫吸附试验结果分析显示PHI作用于RPMI8226细胞后细胞分泌VEGF水平明显下降（P<0.05）。　　
结论：⑴.人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226和U266高表达Notch信号蛋白。　　
⑵.用PHI和GSI均能体外抑制培养的骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞增殖，诱导细胞凋亡，并使细胞阻滞于G0/G1期，这种增殖抑制作用在一定范围内具有时间-剂量依赖性。　　
⑶．PHI和GSI体外显著抑制RPMI8226细胞中Notch1、Jagged1/2及下游蛋白p-Akt、Bcl-2表达水平，同时可导致细胞分泌VEGF能力下降。　　
⑷.Notch信号可能作为新的治疗骨髓瘤的靶点，PHI作为天然化合物，是一种Notch信号抑制剂，是潜在的治疗骨髓瘤的药物。
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多发性骨髓瘤细胞B7-H3分子的表达与预后和骨质破坏的关系
本研究探讨多发性骨髓瘤细胞株及多发性骨髓瘤患者CD138+骨髓瘤细胞中B7-H3的表达水平及其临床意义.应用流式细胞术及RT-PCR法检测3种骨髓瘤细胞株(RPMI8226、U266和H929)表面B7-H3的表达水平及45例(46例次)多发性骨髓瘤患者CD138+细胞中B7-H3的表达水平,分析其与临床预后及生存时间相关性.结果表明:①B7-H3在骨髓瘤细胞株RPMI8226、U266中高表达,阳性率分别为(92.30&#177;1.1)％和(79.03&#177;1.2)％,在H929细胞中未见明显表达,约占(4.26&#177;0.2)％；RT-PCR检测到RPMI8226及U266细胞株B7-H3 mRNA产物,在H929细胞株未检测到其产物.②外源IL-6刺激细胞株未见B7-H3分子的上调.③在多发性骨髓瘤患者中,初诊者B7-H3阳性率为(48.58&#177;33.593)％,缓解者为(22.16&#177;18.853)％,复发者为(57.65&#177;28.296)％,初诊与缓解、缓解与复发者的B7-H3阳性率差异有显著统计学意义(P =0.023,P=0.004).④B7-H3高表达较低表达的患者具有更多的骨质破坏(P=0.027),血清钙离子水平显著升高(2..44619 vs 2..2504；P=0.046).结论:B7-H3的表达可能与多发性骨髓瘤的预后呈负相关,与骨髓骨质破坏程度呈正相关.
作者单位：
徐州医学院附属医院血液科,江苏徐州,221004
北京大学医学部基础免疫室,北京,100014
北京大学人民医院血液科、血液病研究所,北京,100014
年，卷(期)：
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万方数据电子出版社EGCG与硼替佐米联合用药对多发性骨髓瘤细胞作用的实验研究--《浙江大学》2013年硕士论文
EGCG与硼替佐米联合用药对多发性骨髓瘤细胞作用的实验研究
【摘要】：多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是恶性浆细胞病中最常见的一种类型,其发病率约为2-3/10万,男女比例为1.6：1,大多患者年龄40岁.黑人患者是白人的2倍。随着对多发性骨髓瘤发生的生物学机制的深入阐明,新的药物也不断出现,从上世纪六十年代开始经典的MP方案(马法兰+泼尼松),到八十年代的大剂量化疗+自体干细胞移植,再到现在以硼替佐米(万珂,PS-341)为主的化疗方案和雷那度胺等新型药物的出现,治疗效果也有了很大的提高。但药物的毒副作用及肿瘤细胞耐药导致复发仍然是造成治疗失败的重要原因,探索新药和新的联合方案具有提高疗效的可能。
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体,是茶多酚生物活性的主要成份。近年来EGCG均药理作用已经得到了国内外一些研究人员的认可,可以用作肿瘤多药耐药性的逆转剂,能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性。有研究显示EGCG能有效抑制MM细胞的生长,但对正常细胞的影响非常小
如果EGCG和硼替佐米联用能增加对骨髓瘤细胞的抗肿瘤作用,同时EGCG又保护了正常的细胞,这将是一个非常理想的联合用药。我们选择RPMI8226及U266细胞株作为实验模型进行体外实验,观察EGCG对硼替佐米抗MM细胞作用的影响。
体外研究EGCG联合硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226及U266的作用以及可能的机制。
1)采用MTT比色法观察EGCG在不同药物浓度及不同作用时间时对硼替佐米抑制RPMI8226及U266细胞株的生长作用的影响。
2)采用流式细胞仪分析EGCG作用下细胞周期的变化。
3)采用流式细胞仪分析检测EGCG.硼替佐米及两药联合作用下细胞凋亡情况。
4) Westen-blot方法检测EGCG、硼替佐米及两药联合作用对RPMI8226细胞c-myc基因表达的影响。
5) Westen-blot方法检测EGCG.硼替佐米及两药联合作用对RPMI8226细胞cyclin-D1蛋白表达的影响。
6) Westen-blot方法检测EGCG、硼替佐米及两药联合作用对RPMI8226细胞P-catenin蛋白表达的影响。
1) EGCG单药对RPMI8226田胞及U266细胞有明显抑制作用。
MTT比色法检测结果显示10umoI/L、20umol/L、40umol/LEGCG处理RPMI8226及U266细胞株,作用24、48、72小时能抑制RPMI8226及U266细胞株的生长,其中40umol/L组与其他2组组间差异显著(P0.05)。
2) EGCG可减轻硼替佐米对RPMI8226及U266的生长抑制作用。
MTT比色法检测结果显示10umol/L、20umol/L、40umol/LEGCG联合硼替佐米(10-200nmol/L)处理RPMI8226及U266细胞株,作用24、48、72小时能减轻PS-341对RPMI8226及U266的生长抑制作用,各组间差异显著(P0.05)。在同-EGCG (10umol/L、20umol/L)+硼替佐米(100-200nmoI/L)浓度下,随着作用时间的延长,RPMI8226和U266细胞株的增殖抑制作用增强。在同一EGCG(10umol/L、20umol/L)+硼替佐米(10-50nmol/L)浓度下,随着作用时间的延长,对细胞的增殖抑制作用各组见无显著性差异。同一EGCG (40umol/L)+硼替佐米(10-200nmol/L)浓度下,作用72h与作用24h、48h相比,RPMI8226和U266细胞株的增殖抑制作用逐渐明显,各组间差异性显著(P0.05)。
3)40umol/L EGCG能增强小剂量硼替佐米对RPMI8226及U266的生长抑制作用
MTT比色法检测结果显示40umol/L EGCG联合小剂量(20nmol/L以下)硼替佐米处理RPMI8226及U266细胞株72小时能增强硼替佐米对RPMI8226及U266的生长抑制作用,各组间差异显著(P0.05)。
4) EGCG作用下RPMI8226细胞周期无明显变化。
5) EGCG能降低硼替佐米作用下RPMI8226细胞凋亡率。
EGCG联合PS-341,与单用硼替佐米比较,显示RPMI8226细胞凋亡率明显降低(P0.05)。
6)与单用PS-341相比,EGCG联合硼替佐米作用后,RPMI8226细胞的c-myc基因、cyclin-D1蛋白、β-catenin蛋白表达均上调。
1)在体外,EGCG单药对RPMI8226细胞及U266细胞有明显抑制作用。
2)在体外,EGCG可减轻大剂量硼替佐米(20nmoI/L以上)对骨髓瘤细胞RPMI8226及U266的生长抑制作用。但在40umol/L浓度,作用72h时能增强小剂量硼替佐米(20nmol/L以下)对RPMI8226及U266的生长抑制作用。
3) EGCG作用下RPMI8226细胞周期无明显变化。
4) EGCG能降低PS-341作用下RPMI8226细胞凋亡率。
5) EGCG联合PS-341作用与单用PS-341相比,RPMI8226细胞的c-myc基因、cyclin-D1蛋白、P-catenin蛋白表达上调。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R733.3【目录】：
致谢4-5中文摘要5-9Abstract9-13缩略词表13-14目次14-15前言15-17材料与方法17-24 1 仪器、材料和试剂17-19 2 实验方法19-24结果24-40 1 EGCG单药对RPMI8226细胞及U266细胞的抑制作用24-25 2 EGCG可减轻PS-341对RPMI8226细胞的抑制作用25-30 3 各浓度EGCG均可减轻PS-341对U266细胞的抑制作用30-35 4 EGCG作用下RPMI8226细胞周期发生变化,并呈时间依赖性35 5 EGCG能降低PS-341作用下RPMI8226细胞凋亡率35-38 6 EGCG与PS-341联合用药对RPMI8226细胞c-myc基因、cyclin-D蛋白、β-catenin蛋白表达的影响38-40讨论40-46结论46-47参考文献47-50综述50-59 参考文献56-59作者简历及在学期间主持课题和发表论文59
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