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石河子大学
硕士学位论文
Neuritin诱导后的骨髓源性神经元样细胞的功能检测
姓名：李东正
申请学位级别：硕士
专业：病理学与病理生理学
指导教师：黄瑾
1. 利用已构建的Neuritin酵母表达系统大量诱导表达Neuritin蛋白，并进行纯
化及鉴定；
2. 对Neuritin诱导的骨髓源性神经元样细胞进行功能检测，明确Neuritin对骨
髓基质细胞（MSCs）的定向分化的作用。
1. Neuritin蛋白的诱导表达及纯化鉴定：采用甲醇诱导毕赤酵母表达Neuritin
蛋白，采取硫酸铵饱和沉淀、Ni-NAT亲和层析、透析、浓缩等步骤对表达产
物进行纯化，SDS和Westrern blot鉴定产物；
2. 对Neuritin诱导的骨髓源性神经元样细胞进行功能检测：（1）诱导后的神经
元样细胞的电生理检测：采用膜片钳技术观察分化前后的膜特性变化以及膜
离子通道的情况。 （2）诱导后的神经元样细胞分泌神经递质的检测：用薄
层层析法检测神经递质5-羟色胺。（3）诱导后的神经元样细胞的细胞间突触
联系的检测，利用免疫荧光染色检测突触素。
1. 诱导表达的Neuritin蛋白经纯化鉴定显示：人Neuritin酵母表达产物的分子
量约为11Kda左右；经Western-blot证实为Neuritin，且具有一定的免疫活性。
2. Neuritin诱导的骨髓源性神经元样细胞的功能检测结果显示：（1）电生理检
测分化前后的膜特性有显著差异，并记录到外向延迟整流K+ 电流和内向整流
K+ 电流。（2）诱导后的神经元样细胞有5-羟色胺的分泌。（3）突触素检测结
果为阴性。以上结果显示Neuritin蛋白可定向诱导MSCs的分化为神经元样细
1. 对毕赤酵母分泌表达Neuritin 蛋白进行有效的纯化和浓缩，经Western-blot
证实为Neuritin。
2. Neuritin 蛋白具有定向诱导MSCs 分化为神经元样细胞的生物学功能。
关键词：Neuritin；分化；骨髓基质细胞；神经元样细胞
论文类型：A(基础研究)
Objective:
constructed
and then was purified and identified.
differentiation,
neuron-like
induced by Neuritin was tested,.
expression
purification
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Western Blot免疫印迹技术服务
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5-羟色胺-迷走神经通路在食管酸反流致气道高反应性中的作用和机制
【摘要】：目的胃食管反流性咳嗽(GERC)是指与GER相关的以咳嗽为主要表现的呼吸道症候群,但其发病机制尚未明了。本研究确定5-羟色胺(5-HT)-迷走神经C传入纤维通路在食管酸反流致气道高反应性中的作用及其机制,分析影响5-HT-迷走神经C传入纤维-神经肽分泌途径的药物对食管酸反流致气道高反应性的防治作用,为食管反流所致气道高反应性的治疗提供新的靶点。方法普通级健康雄性白化豚鼠30只(7周龄,体重300g-400g),随机分成:模型组、对照组和空白组。以食管下端缓慢灌注0.1mmol/l的HCL溶液(含0.5%胃蛋白酶),持续20min,每天一次,连续14 d,建立胃食管反流(GER)模型。对照组用蒸馏水代替盐酸灌注;空白组不做任何处理。检测不同浓度乙酰甲胆碱(Mch)对豚鼠肺阻力和肺顺应性的变化,评估气道反应性;采集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行白细胞计数和分类计数,并利用酶联免疫吸附法测其中神经肽A(NKA)、神经肽B(NKB)、P物质(SP)含量;评估食管、气管和肺组织病理变化;采用高效液相色谱-电化学法测食管组织5-HT和其分解产物5-HIAA含量;分别利用RT-PCR和Western Blot测定食管瞬时感受器电位香草酸受体1(TRPV1)、5-羟色胺4受体(5HT4R)、5-HT转运体(SERT)的mRNA和蛋白表达的水平。进一步在每次食管酸灌注之前30min分组(每组10只)采用5HT4R拮抗剂GRμmol/kg)和TRPV1拮抗剂辣椒平(capsazepine,0.5μmol/kg)进行腹腔注射2周,观察其干预效果。结果 1.GER动物模型的建立和气道高反应性。当Mch刺激浓度达到0.25 mMol/L和0.5 mMol/L时,模型组肺阻力增加百分比和肺顺应性减少百分比大于对照组和空白组,气道反应性增高,差异具有统计学意义。模型组远端食管黏膜出现溃疡糜烂,炎症表现明显;气管组织和肺组织炎症明显,主要以嗜酸性粒细胞浸润为主,而对照组和空白组远端食管黏膜结构完好,支气管和肺泡结构正常。模型组BALF中的白细胞总数和嗜酸性粒细胞百分比,及NKA和SP含量均显著高于对照组和空白组。模型组食管组织中5-HT水平显著高于对照组和空白组,而SERTmRNA表达水平明显降低。TRPV1 mRNA,5-HT4R mRNA和蛋白表达水平在三组间的差异没有统计学意义;模型组TRPV1蛋白表达水平高于对照组和空白组,但差异无统计学意义。2.药物干预结果:Mch浓度为0.5 mMol/L时,GR113808组和辣椒平组的肺阻力增加百分比和肺顺应性减少百分比小于模型组,气道高反应性得到一定程度缓解。两药物干预组食管黏膜、气管黏膜和肺组织的炎症程度比模型组有所减轻。而GR113808组的BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数均比模型组有所下降,辣椒平组的白细胞总数低于模型组。两组BALF中SP含量均比模型组有所降低。结论豚鼠食管酸灌注模型可以引起食管黏膜损伤、气道神经源性炎症和气道高反应性;食管酸灌注可引起食管组织5-HT升高和SERT的降低,5-HT-迷走神经通路可能在食管酸反流致气道高反应性中发挥作用;5-HT4R拮抗剂GR113808和TRPV1拮抗剂辣椒平可有效降低食管酸反流引起的气道反应性,并减轻肺部组织炎症,5HT4R和TRPV1有望成为治疗GERC的新靶点。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R725.7【正文快照】：
5-羟色胺-迷走神经通路在食管酸反流致气道高反应性中的作用和机制@杨希$浙江大学医学院附属儿童医院消化科
@杨霞$浙江大学医学院附属儿童医院消化科
@舒小莉$浙江大学医学院附属儿童医院消化科
@顾伟忠$浙江大学医学院附属儿童医院消化科
@江米足$浙江大学医学院附
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