【图文】Western blot 的由来,原理,步骤,帮你理解_百度文库
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Western blot 的由来,原理,步骤,帮你理解
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标题: WesternBlot中的三大问题
摘要: [WesternBlot中的三大问题]
想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。常遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，请看本文的问题解答。
Question:我的结果是膜上一片空白，为什么呢?
A:导致这种结果的因素很多。胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小…… [本文关键词:内参 抗体 缓冲液 转膜 ]……
想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。常遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，请看本文的问题解答。
Question:我的结果是膜上一片空白，为什么呢?
A:导致这种结果的因素很多。
胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。
转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说，蛋白越大，转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。
在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。
试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20℃。
抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及，太多的抗体页会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。
酶失活了：叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要再HRP显色的western
blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。另外，只能使用蒸馏的去离子水。
使用Tween-20洗涤：Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤，其他洗涤过程中都不使用Tween-20，不过，这可能会使背景升高。
检测系统缺乏足够的灵敏度：确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内：
辣根过氧化物酶 500pg/band
碱性磷酸酶 100pg/band
增强的碱性磷酸酶 5pg/band
胶体金 100pg/band
增强的胶体金 10pg/band
Immun-Star化学发光 10pg/band
Q：我的Western blot总是背景过高，如何解决?
应该是多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。
封闭不完全：一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能再4℃孵育，因为会凝结。如果想在低温封闭的话，可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景!
显色过度：显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久，背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰课件，而背景几乎没有货很少时，将膜及时取出。
转移缓冲液或设备污染：使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外，每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。
抗体稀释度不正确：一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说，以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。抗体稀释度不够，会产生非特异性的结合，带来高背景。
二抗不纯：没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用，产生杂带。
Q：在转膜的过程中，缓冲液总是很热，我该怎么办?
如果缓冲液过热，它就会分解，产生更多的热量。这可是一个大问题。为了避免分解，一定要确保你的冷却设备没问题，使用的是推荐的缓冲液，而且不在过高的功率下转印。
足够的冷却的条件：在大部分情况下，都应当使用循环冷却水来进行冷却。在冷库中转印，或将转印槽放置在冰浴中都是不行的。因为大部分转印槽都是塑料做的，不能有效地散热。另外，由于胶附近的缓冲液通常是静止的，在转印过程中应搅动来维持循环。
缓冲液：转印缓冲液的离子浓度必须是已知的，来防止过热。如果离子浓度过高，电压就应该降低(恒流转印)，如果是恒压转印的话，就会过热。
功率条件：转印过程中产生的热是与功率成正比的。功率是电压与电流的乘积。当缓冲液分解时，电阻下降。如果电压是恒定的，则电流上升。因此，功率上升，产生更多的热量。如果电流是恒定的，则电压和功率下降，使蛋白转移得更慢。下表就列出了推荐的缓冲液及转膜条件。
缓冲液配方
高密度电压
冷却至0-4℃
转膜30min-1h
192mM甘氨酸
60V，0.21A
100V，0.36A
39mM 甘氨酸
60V，0.21A
100V，0.43A
10mM NaHCO3
碱性蛋白（SDS-PAGE）
20V，0.25A
30V，0.44A
Western Blot为什么必须要用内参?
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western
Blot。因为Western
Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western
Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western
Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)，空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)，已知量标准产物的正对照;另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western
Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western
Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。
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内参即是内部参照(Internal
Control)，对于哺乳动物(mammalian)细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping
Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting
实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting
实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western
Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰;且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry
等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford
法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA
反应的还原剂(如DTT，巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western
blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western
Blot显色或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western
Blotting实验，至内参量一致为止;若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。上海康成生物工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western
mini-blots，价格仅为988元人民币，并且只需4℃保存运输，有效期长达两年。这一产品大大降低了内参的费用，性能稳定、质量可靠、易于保存。
Blotting实验过程中，由于使用的二级抗体往往会与总蛋白中本身含有的某些免疫球蛋白产生反应产生较强信号的杂带。因此，上海康成生物工程有限公司推出了HRP标记的GAPDH，在任何情况下使用它都能够得到单一的条带结果，使得内参的使用方法更为简便准确。这种操作省时，无需二级抗体反应的HRP标记的GAPDH内参不仅具备康成生物普通GAPDH的所有优点而且结果条带单一，可避免二级抗体的非特异性反应。售价为1498元人民币100μl，稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western
mini-blots。(Tips：现在读者在康成生物购买前面那个便宜的内参时提及网络就可以额外获赠这个标记内参的10次使用装)
A-G分别表示不同实验小鼠心脏蛋白(上样量50ug)，兔抗小鼠Akt抗体(康成生物Cat#KC-5A01)检测心脏组织匀浆中Akt水平。加入兔二抗(康成生物Cat#KC-RB-035，稀释比例为1：5，000)时同时加入HRP标记的抗GAPDH单抗(稀释比例为1：10，000，康成生物Cat#KC-5G5)。采用化学发光试剂盒(康成生物Cat#KC-420)及X胶片曝光显影。一次反应即可同时检测目的蛋白(Akt)与内参GAPDH的含量。
目前，市场上供应的其他内参则均需要-20℃保存，干冰运输：Sigma公司的Anti-β-Actin，价格为241美元200μl，可做100次左右的Western
mini-blots。Labvision的β-Actin 399美元1ml，可做50到100次Western mini-
209美元0.5ml，可做25到50次Western mini-blots。Cell Signaling
Technology的BETA-ACTIN ANTIBODY 只可做10次 Western
mini-blots，美金价为150美元，人民币售价为1875元。
附：在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
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............................................................................................ 1 二、主题相关科研产出总体分析........................................................................ 1 2.1 文献总体产出统计 ................................................................................ 1 2.2 学术关注趋势分析 ................................................................................ 2 三、主题相关科技论文产出分析........................................................................ 2 3.1 中文期刊论文 ........................................................................................ 2 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 ................................................. 2 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 ............................................................. 3 3.1.3 发文较多期刊 ............................................................................. 4 3.1.4 发文较多的机构 ......................................................................... 4 3.1.5 发文较多的人物 ......................................................................... 4 3.1.6 核心期刊分布数量对比 ............................................................. 4 3.1.7 最近相关中文期刊论文 .............................................................. 5 3.1.8 被引较多的相关期刊论文 .......................................................... 5 3.2 学位论文 .................................................................
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copyright &copyright 。文档资料库内容来自网络，如有侵犯请联系客服。　　Westernblot法是检测蛋白样品中特异性抗原的一种分析方法。　　本期伯乐生命()专家详细介绍Westernblot法实验原理及方法。　　Westernblot法操作步骤是：　　伯乐生命专家强调第一步将被分析的蛋白样品做SDS—PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。　　Westernblot法第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上(所谓印迹)，其中用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的(原理与Southern blotting类似)电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。　　bio-rad专家还提到Westernblot法最后一步是用特异性的抗体检测，看印迹膜上是否存在相应抗原。免疫检测的方法可以是直接或间接的，现在一般都是采用间接免疫配标的方法。在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的抗第一抗体的抗体)染色，再加酶的底物显色，通过膜上显现出的颜色或经化学发光在x光底片上出现的曙光条带来显示抗原的存在。　　【Westernblot法实验材料】　　1、IgG标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的免疫球蛋白IgG抗体：　　2、转移缓冲液、TBS、漂洗液(TTBS)、封闭液、DAB显色液、脱色　　液、氨基黑染色液；　　3、转移电泳仪、硝酸纤维素膜NC、滤纸、剪刀、手套、小尺、培养　　皿等。　　【Westernblot法实验方法】　　样品的SDS—PAGE检测　　按SDS—PAGF实验的操作步骤进行，采取对称加样，电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利于相互对比，分析Westernblot法实验结果。　　2、Westernblot法转移印迹　　(1)转移前准备：将滤纸、NC膜剪成与胶同样大小，NC膜先浸入蒸馏水中10一20min，.再浸入转移缓冲液中平衡30min 。　　(2)凝胶平衡：将电泳后的SDS—PAGE胶板置于转移缓冲液中平衡30一60min，按“凝胶三明治”结构(海绵垫—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—海绵垫)逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。　　(3)装入转印夹中，、Westernblot法转印时凝胶侧接负极，NC膜侧接正极，可将转印电泳槽置于冰浴中，200ma恒流转印lho　　(4)转印结束后，按加样7L的位置.剪下蛋白分子量标准的膜条用氨基黑染色，观察转印效果，其余NC膜浸入封闭液中，4℃过夜。　　(5)TBS洗膜l一2次，每次10min。　　(6)加入HRP标记的抗体，室温振摇lh。　　(7)TBS洗3次，每次10min。　　(8)将NC膜浸入DAB底物显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水或双蒸水洗涤终止反应。　　【Westernblot法注意事项】　　1、Trik—甘氨酸转移缓冲液pH为8.3，比大多数蛋白质的等电点(P1)要高，蛋白质带净电荷并向阳极迁移，常用于湿转。　　2、影响Westernblot法成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合，多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种抗体，所以在、Westernblot法实验中常选用多克隆抗体。而多数单克隆抗体不能与变性抗原反应，其识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维结构构象。　　3、常用提高Westernblot法灵敏度的方法：在电泳前应用免疫沉淀法将极低浓度抗原进行纯化和浓缩，可使用三重检测系统增强信号的强度，例如：使一抗，二抗和三抗相继与抗原结合形成复合物，使得结合物中标记抗体分子的数量增多。　　【Westernblot法研发品】　　　　预染 SDS-PAGE 标准品应用于 SDS-PAGE 和 Western 印迹，方便快速地监测蛋白电泳分离进程和估算印迹膜转移效率。每批 Kaleidoscope 和预染 SDS-PAGE 标准品都经过单独校准，以便对样品分子量进行估算。　　伯乐生命Kaleidoscope 标准品　　Kaleidoscope 标准品是由多种颜色的预染蛋白组成，可在 SDS-PAGE 和 Western 杂交膜上即时定位。当在 Tricine 凝胶上分离多肽和小蛋白时，可使用 Kaleidoscope 多肽标准品。Kaleidoscope 预染标准品为宽分子量范围的蛋白标准品。　　下期，伯乐生命专家将介绍Westernblot法百科(三)：你不知道Westernblot法故事，敬请关注Western blot实验方法、步骤、介绍/Western blot protocol/免疫印迹方法
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&Western实验步骤
&&&&Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。
收集蛋白样品(Protein sample preparation) &&&&可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的。
&&&&收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(/////)。
2. 电泳(Electrophoresis)
SDS-PAGE凝胶配制
&&&&SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
&&&&在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的。
&&&&100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
上样与电泳
&&&&冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
&&&&为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用。
&&&&电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(/)。
&&&&电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
&&&&通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
&&&&我们推荐在Western实验中选用。也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
&&&&通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
&&&&在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
&&&&转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
&&&&转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
&&&&用或滴管等吸尽洗涤液，加入，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
&&&&参考一抗的说明书，按照适当比例用稀释一抗。
&&&&用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
&&&&回收一抗。加入，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
&&&&注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用或，进行内参检测。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
&&&&参考二抗的说明书，按照适当比例用稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如。碧云天有提供。
&&&&用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
&&&&回收二抗。加入，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
&&&&参考相关说明书，使用等ECL类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的进行。
&&&&洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(/)自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
&&&&如果蛋白样品非常宝贵，可以使用处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。