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&&细胞冻存有遇到过这些问题吗？
细胞冻存有遇到过这些问题吗？
很多珍贵的细胞株，冻存后很难复苏，或者复苏后出现大量死亡，不知大家都是怎么处理的，是否解决了这些问题？
我先说说我最近遇到的问题吧。
培养物：杂交瘤细胞
冻存液：90%FBS+10%DMSO
冻存过程：(泡沫盒) -70℃过夜→转液氮保存
复苏过程：40℃水浴→90s内，溶解→1500 rpm，3 min→弃上清，培养基重悬→T75培养瓶培养，5% CO2,37℃，DMEM+20%FBS+双抗
问题：部分细胞复苏之后，大量死亡，有的甚至全部死亡；此类细胞中，部分细胞复苏起来后死的就很多，部分细胞过几个小时后死亡
作出的努力：1、在添加饲养细胞的24孔板内复苏，能抢救一部分，但耗时
& && && && && && &&&2、冻存数目增加，占的位置太多，且仍然不能解决
& && && && &3、试过不同的冻存液配方，FBS20%、50%、90%都没有明显的改善
最近一次发现，-70保存后复苏比液氮保存后复苏的效果要好很多，这说明我在转液氮的时候出问题了么？可是不是很明白会出啥问题呢~~
请大家都来说一说哈！
可是38度，要完全溶解的话需要的时间早就超过1分钟了，DMSO在这个温度对细胞的伤害还是很大的啊。
另外，还有黄豆大小的冰块就不溶解直接去离心了吗，这样对细胞没有伤害吗？话说我都是完全溶解了才去离心的哦。
我比较过几种杂交瘤细胞的离心转速，15000,3min，还好，问题不大，至少我的实验结果显示差不多的。
我做过2种杂交瘤细胞和一种骨髓瘤细胞，-70直接复苏的效果都还不错，只是，在-70里面放置的时间再一周以内，长时间的我没有试过。其实我做这个，就是为了找冻存细胞出问题的原因，长期保存，在液氮是最好的，-70只是短时间比较好，
你冻存管中细胞体积很多么，一般是0.8至1.0ml，1分钟内是没问题的。融到黄豆粒大小后再移管到超净台，这期间拿手握管，手有温度的，期间一直晃管。过火前就可以融掉。我说的黄豆粒是比绿豆大一点的大小啊，不是泡发那么大的啦。可以预先在离心管中加2ml培养基，细胞加进去后，再沿壁逐渐加到6/7m，这样可以让细胞逐渐适应更换的环境。你可以试一下。
至于是不是冻存的因素，若细胞富裕，可以做个对照试一下啊，直接-70冻存，短时间估计影响不大，放久一点就看出来了，我以前干过这事哈，短时间再复苏，看形貌看不出来，但对细胞的伤害肯定有的。
体积不多呢，也就是0.8-1.2之间吧，我调到40℃，1分钟哈还是不能完全溶解，计时看过，但是达到你说的那个水准是可以的。你的意思就是复融之后加到培养基里面，再离心哈？我也做过，也参考过冷泉港的复苏步骤，但是做出来没多少区别呢。
我现在正在做，准备放个五六天转液氮，然后留些在-70，回头再一起复苏一次看看
额，我用泡沫盒放的啊，而且-70℃之后复苏状态很好啊，这个可以排除-70冻死的可能不？
一般最大血清浓度是多少？我复苏比平时高5%，20%的，而且隔天就换新鲜培养基
一般多加10%的血清就可以了，复苏的时候不是按原来培养基的配方的吗，不用多加的，在第二天换液时再慢慢添加牛血清救活大概也需要1周以上的时间。
哦，我一般就是在复苏的时候多加5%的血清，第二天换液，细胞好点的，过三天就可以扩培了，差的需要一个月，再差的基本就挂了
哦，我一般在复苏后的培养过程中也会添加牛血清，这样有些难以存活的细胞也可以救活
用骨髓瘤细胞又做了一次实验，在-70℃放了10天，复苏后的状态比8天前入液氮的要好一点，但也不是特别好，长时间在-70℃保存不是长久之计；只在-70℃过夜的(9天前)转移到液氮后，复苏的状态又比-70℃放了10天的强。
貌似有点乱，似乎说明，-70℃过夜后转液氮最好，-70短时间较好，不易长期存放。
对了，液氮容易进入冻存管，这个貌似也有影响啊
不是直接放进去的，是在充满泡沫的泡沫盒里面。棉花包着，多厚呢，这个和放到泡沫盒的比，区别大不？
我之前试过4℃→-20℃→-70℃→液氮，和我这现在泡沫盒直接-70℃过夜再转液氮的效果差不多呢
冻存细胞要缓慢降温，不要太快也不要太慢，如果太快那么细胞没会产生冰晶把细胞扎破，太慢的话细胞就会冻死了，我冻存Hela细胞包棉花，再复苏的时候基本没有死的，而且状态非常好。像你这种比较娇气的细胞我也没养过，我主要养基质细胞，没冻存过。我也不知道这种方法适不适合你，我觉得你那方法降温过程有点慢，你可以试一下包棉花。。
包棉花也不用太厚，我用的脱脂棉包完相当于两个冻存管的厚度或者再厚一点。等它完全冻了就把棉花接下来就可以了
哦，那还是挺厚的。我冻存细胞的数目还是挺多的，感觉棉花麻烦了点，回头我试试，比较一下。
对了，你用的DMSO是什么牌子的，保质期是多久，有没有研究过它对细胞冻存的影响？
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扫描下载送金币谈谈细胞污染那些事
细胞污染概述
凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。
物理性污染
通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温 度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。
化学性污染
指培养环境中许多化学物质（血清、培养基、试剂、培养器皿、水、培养箱等）都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。
细胞生物性污染
是由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。其中包括细菌污染、真菌污染、支原体污染以及细胞系交叉污染等。不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别，微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的，缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速，能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。
细胞污染的解决方法
物理性污染
对于细胞物理性污染可通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。
化学性污染
对于细胞化学性污染，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤等措施来预防细胞化学性污染。
生物性污染
细胞生物性污染中，细菌污染、霉菌污染、酵母污染容易发现，而病毒污染、支原体污染及其他部分污染不容易被发现。在发现有细胞污染时，应首先要进行登记（细胞名称、报告课题负责人、污染数量、污染原因、培养基标记、操作人员），如果发生情况要及时上报。
其次，把受污染的细胞与其他细胞隔离开，观察细胞污染的种类，判断污染的原因。如果该细胞容易获得或冻存库有存货则把污染细胞弃之。之后对试剂进行杂检，若发现是试剂污染导致的则把污染试剂全部丢弃。最后若污染细胞价值较大则可尝试用抗生素清除污染。细菌污染用可庆大霉素，真菌污染可用两性霉素。
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今日搜狐热点基本资料：/细胞冻存
　　2毫升细胞细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％．15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用&慢冻快融&的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
背景知识 ：/细胞冻存
　　细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
　　原理 ：
　　细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：/细胞冻存
一、材料　　（一）仪器
　　1. 净化工作台
　　2. 离心机
　　4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
　　6. 培养箱
　　7. 液氮冰箱
　　（二）玻璃器皿
　　1. 吸管（弯头、直头）
　　2. 培养瓶
　　3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
　　4. 废液缸
　　（三）塑料器皿
　　1. 吸头
　　2. 枪头
　　3. 胶塞
　　4. 移液管（10ml）
　　5. 15ml离心管
　　6. 冻存管（1～2ml）
　　（四）其他物品
　　1. 微量加样枪
　　2. 红血球计数板
　　3. 记号笔
　　4. 医用橡皮膏
　　（五）试剂
　　1. D-Hanks液
　　2. 小牛血清
　　3. 培养液
　　4. 双抗（青霉素、链霉素）
　　5. 胰蛋白酶（0.08%）
　　6. 1NHCl
　　7. 7.4%NaHCO3
　　8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油二、操作步骤　　（一）细胞冻存
　　1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
　　2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
　　3. 离心1000rpm，5min；
　　4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
　　5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
　　6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
　　7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
　　min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入内。
　　（二）
　　1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
　　2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
　　3. 离心， 1000rpm，5min；
　　4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
　　5. 次日更换一次培养液，继续培养。三、注意事项　　1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
　　2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
　　3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
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死后“复生”还有哪些可能路径？
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近日，重庆女作家杜虹选择死后将自己冷冻，并期待50年后“复生”的新闻“爆红”网络，杜虹也被媒体称为中国首例冰冻自己等待“复生”的逝者。选择在死后冰冻自己以求“复生”，是纯粹的天方夜谭还是科幻照进现实？记者就目前已有的医学认知多方请教医学专家，就冷冻大脑等可能的“复生”手段，为大家答疑解惑。Q：头颅可以被冻存50年依然保有活性？从目前的临床医学看很难想象国内一家三甲医院的器官移植专家：目前，美国、西班牙的研究机构，已研发出可以循环灌注，争取更长时间保存器官活性的保存液，但并未在临床大规模应用。要在深低温状态下，保存器官，而且是人脑细胞的活性50年，这在目前的临床医学应用看，很难想象。Q：深低温冷冻对脑细胞会不会有损害？可能会对某些组织造成损伤宣武医院神经外科主任医师陈赞：头部在冷冻的过程中，除了细胞外的水分，比如血液形成冰晶会刺破细胞膜。但如果降温的过程比较慢，细胞内的细胞浆也会形成冰晶，把原有的体积膨胀10%左右，撑破细胞。解冻时，细胞就会碎裂，这个组织就会坏死。这样看来，人体冷冻技术需要液氮，做一个急速降温的过程，组织细胞内外的水分形成冰晶。但同时，头颅内的组织和区域非常复杂，他们的代谢率不同，因此，同一降温过程还是可能会对某些组织造成损伤。Q：唤醒术可操作吗？头部唤醒后能嫁接在另一身体上吗？实施唤醒术需匹配的冷冻技术陈赞：唤醒术，还在基础研究过程，据我所知，我们这一代人应该是看不到。未来，即使唤醒术真的成熟，现在的冷冻技术，也未必适应未来的唤醒条件。第四军医大学唐都医院神经外科副主任医师李维新：在换头手术中，肌肉、骨骼、血管、食管等结构的链接已经不成问题，惟一难以突破的，就是脊髓和脑部神经中枢的连接。也就是延颈（交界）处的脊髓功能重建问题。实际上，我们每个人，大脑和脊髓的连接是无缝的。脊髓中，还有神经元，还有类似于脑细胞的细胞。这段脊髓，是一个上行激活系统，有独立发出指令的功能，管着呼吸和心跳。这就是为什么，脑干挫伤，很多病人就没有治疗机会，呼吸心跳立即停止。从我们的角度，换头手术，在替代性的产品（比如神经元的替代，干细胞的移植）没有出来前，就是天方夜谭。必须有很多体外的技术支持，先把上行激活系统包括脑干转移出来。■&延伸阅读转移记忆的“复生”可能无独有偶，由意大利神经外科专家赛吉尔·卡纳维罗发起的人类第一例“换头”手术计划于2017年在中国进行。但到目前为止，在动物身上的“换头”术，还没有取得实际意义上的成功。事实上，器官移植、换头手术甚至转移记忆等在某种程度上都可以看做是死后“复生”的一种途径。李维新告诉记者，神经外科工作者将来一个很重要的研究方向，是脑细胞的替代移植。一个人的脑部存储信息，可以被读取；一个人想要借助医学科技延续自己的生命，从他（她）身体中转移走的，不是头颅或其他器官，而是一个有感觉，有意识、有思维的软件包。
(编辑：internal)
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标题: 细胞冻存问题(细胞冻存,传代)
摘要: [细胞冻存问题(细胞冻存,传代)] 大家好，我在做细胞，想把细胞冻存，但有人说细胞冻存复苏后需要再传1-2代才能恢复良好的活力，复苏后细胞不传代只让它长满就用细胞活力不行，是这样吗？想听听大家的高见和经验，谢谢。 关键词:[细胞冻存 传代]……
大家好，我在做细胞，想把细胞冻存，但有人说细胞冻存复苏后需要再传1-2代才能恢复良好的活力，复苏后细胞不传代只让它长满就用细胞活力不行，是这样吗？想听听大家的高见和经验，谢谢。
回复是的,一般要传几代再冻存,我也是新手,今天刚复苏了细胞.老师说养到五六瓶再冻存.回复不管是第几代，只要细胞活性和状态好就可以冻存。回复谢谢各位，我还有问题是：细胞复苏之后是不是还需传几代才能恢复以前的活性呢？回复一般换了一次液后就会恢复以前的活性，当然还要看实验过程，如果细胞上海大的就要三四天才能恢复，回复如果冻存的质量比较好复苏的过程也没问题的话，刚复苏的细胞活性也可以很好的。不过要做实验用的话最好还是传两代以后再用。毕竟人家刚从沉睡中醒过来，还是需要适应一下环境的不是吗？
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