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【公告】 HPLC实践技术SOS专区（HPLC问题请在此跟贴发问！）&[精华]
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【求助】我最近想用HPLC来测定锁链素（desmosine）的含量，锁链素的分子量为625，它有个同分异构体是异锁链素，请问各位专家如何用HPLC使锁链素和异锁链素的峰区分开来，非常感谢！
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大家好！我想用HPLC分析药物的含量，请问各位战友配制 标准溶液时，标准品的一系列的浓度是根据什么来配的？哪位战友指点一下，谢谢！
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各位老师:我现在用的是HPLC2010如何梯度洗脱呢??
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请问，我在做表阿霉素血浆的标准曲线时，为什么峰面积与浓度成反比啊
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关于丁香园& 宁心宝胶囊中5种核苷类成分的RP-HPLC定量分析
宁心宝胶囊中5种核苷类成分的RP-HPLC定量分析
摘 要：目的：测定与分析宁心宝胶囊中5种核苷类成分的含量。方法：采用RP-HPLC法，色谱条件：LichrospherC18（250mm×4．6mm，5μm）色谱柱；流动相为甲醇-0．05mol&#
【题　名】宁心宝胶囊中5种核苷类成分的RP-HPLC定量分析
【作　者】肖新月 李远科 张萍 吴秀清 鲁静
【机　构】[1]中国药品生物制品检定所,北京]四川省资阳市食品药品检验所,资阳641300
【刊　名】《药物分析杂志》 2007年第27卷第10期,页
【关键词】宁心宝胶囊 尿嘧啶 尿苷 腺嘌呤 鸟苷 腺苷 RP-HPLC
【文　摘】目的：测定与分析宁心宝胶囊中5种核苷类成分的含量。方法：采用RP-HPLC法，色谱条件：LichrospherC18（250mm×4．6mm，5μm）色谱柱；流动相为甲醇-0．05mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（8：92），流速为1．0mL·min^-1；检测波长为260nm；柱温：25℃。结果：尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷5个成分进样量分别在0．008-0．128μg，0．126-1．900μg，0．008-0．119μg，0．043-0．649μg，0．080-1．212μg范围内呈良好的线性关系，相关系数为0．0，平均回收率（n=9）为95．0％-103．8％；RSD均小于3．0％。结果：利用建立的RP-HPLC方法，测定26个企业生产的68批宁心宝胶囊中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的含量分别为0．01-0．03，0．95-2．15，0．01-0．05，0．61-1．57，0．63-1．57mg·粒^-1。结论：本法灵敏度高，重复性好，提取方法与色谱条件均较简单，能有效鉴别并测定宁心宝胶囊中5种主要核苷类成分的含量。
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宁心宝胶囊,尿嘧啶,尿苷,腺嘌呤,鸟苷,腺苷,RP-HPLC
上一篇：暂无33 （ 1 ） 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013 ，
RP － HPLC 法同时测定熟地黄中 5 个核苷类成分的含量 *
1 1 2 3 1 ＊ 张文萌 ， 贾玉荣 ， 付锦楠 ， 张刘强 ， 孙立新 ＊
（ 1． 沈阳药科大学， 沈阳 110016 ； 2． 江西省科学院微生物研究所， 南昌 330029 ； 3． 上海中医药大学， 上海 201203 ） 摘要 目的： 建立同时测定熟地黄中次黄嘌呤 、 尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷和腺苷 5 个核苷类成分的 RP － HPLC 法。 方法： 采用 Dia16. 0 μg · mL － 1 （ r =
－1 monsil C18 （ 4. 6 mm ? 250 mm， 5 μm ） 色谱柱， 以乙腈 － 0. 04 mol · L 磷酸二氢钾溶液为流动相梯度洗脱， 流速 1. 0 mL ·
min － 1 ， 检测波长 254 nm； 柱 温 30 ? 。 结 果： 次 黄 嘌 呤、 尿 苷、 腺 嘌 呤、 鸟 苷 和 腺 苷 浓 度 分 别 在 1. 0 5. 0 0. 9999 ） 、 16. 0 μg·mL 80. 0 μg · mL
（ r = 0. 9999 ） 、 1. 0
16. 0 μg · mL
（ r = 0. 9997 ） 、 1. 25
20. 0 μg · mL
（ r = 0. 9999 ） 、 1. 0
（ r = 0. 9999 ） 范围内线性良好。加样回收率为 98. 1%
101. 0% 。 结论： 该方法可以用于熟地黄中次黄嘌呤 、
尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷和腺苷的含量测定 。 关键词： 熟地黄； 炮制品； 核苷含量测定； 次黄嘌呤； 尿苷； 腺嘌呤； 鸟苷； 腺苷； 高效液相色谱法 中图分类号： R917 文献标识码： A 文章编号： 0254 － 1793 （ 2013 ） 01 － 0094 － 04
RP － HPLC simultaneous determination of five nucleosides in Radix Rehmanniae Preparata*
＊ ZHANG Wen － meng1 ， JIA Yu － rong1 ， FU Jin － nan2 ， ZHANG Liu － qiang3 ， SUN Li － xin1＊
（ 1． Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016 ， China； 2． Institute of Microbiology， Jiangxi Academy of Sciences， Nanchang 330029 ， China； 3． Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203 ， China）
Objective： To establish a RP － HPLC method for simultaneously determining five nucleosides（ hypoxan-
thine， uridine， adenine， guanosine and adenosine ） in Radix Rehmanniae Preparata． Methods： The Diamonsil C18 （ 4. 6 mm ? 250 mm， 5 μm） column was adopted and diluted with acetonitrile － 0. 04 mol· L － 1 potassium dihydrogen phosphate gradiently at the wavelength of 254 nm． The flow rate was 1. 0 mL·min － 1 and the column temperature was 30 ? ． Results： The method was developed with a good linearity within the range of 1. 0 － 16. 0 μg·mL － 1 （ r = 0. 9999 ） ， 5. 0 － 80. 0 μg·mL － 1 （ r = 0. 9999 ） ， 1. 0 － 16. 0 μg · mL － 1 （ r = 0. 9997 ） ， 1. 25 － 20. 0 μg · mL － 1 （ r = 0. 9999 ） and 1. 0 － 16. 0 μg·mL － 1 （ r = 0. 9999 ） for hypoxanthine， uridine， adenine， guanosine and adenosine， respectively． And the average recoveries of the five nucleosides were 98. 1% － 101. 0% ． Conclusion： The established method can be used for the quantification of five nucleosides （ hypoxanthine， uridine， adenine， guanosine and adenosine） in Radix Rehmanniae Preparata． Key words： Radix Rehmanniae Preparata； processed product； nucleoside content determination； hypoxanthine； uridine； adenine； guanosine； adenosine； RP － HPLC 中国药典 2010 年版收载的地黄， 为玄参科植物 地黄 （ Rehmannia glutinosa Libosch． ） 的块根。 熟地 黄为地黄的块茎经加工炮制而成， 且清蒸和加黄酒 ［1 ］ 炖是常用的炮制方法 。 地黄的主要成分有环烯醚萜、 苷类及糖类， 还含 ［2 ］ 有多种氨基酸、 有机酸及无机元素等 。 根据文献 报道， 鲜地黄在炮制成生地黄和熟地黄过程中 ， 所含 成分发生了改变， 其药理活性和临床作用也有很大 。生地黄清热凉血、 养阴生津； 熟地黄具有 滋阴补血、 益精填髓的功能， 主治肝肾阴虚、 腰膝酸 差异 软、 骨蒸潮热、 盗汗遗精 研究主要集中在地黄苷
［3 ］ ［2 ］
。 目前地黄的质量控制
［6 － 7 ］ 、 ， 梓醇 熟地黄中主
［4 － 5 ］
辽宁省高校创新团队支持计划（ LT2012018 ） Tel： （ 024 ）
； E － mail： slx04@ 163． com
＊ ＊ 通讯作者
33 （ 1 ） 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013 ，
［8 ］ 5 － 羟甲基糠醛［9 － 10］ 等。 近期研究 要有还原糖 、 鸟苷、 腺苷等核苷类成分能够干扰病毒核 发现尿苷、 ［11 ］ ， 酸的合成 通常为中成药抗病毒的活性成分 ； 腺
苷、 腺嘌呤、 鸟苷、 腺苷的对照品适量， 精密称定， 分 50% 1 mL 1 mg 甲醇制成每 约含 的单一对 别加入 照品储备液； 分别精密吸取次黄嘌呤对照品储备液 2. 0 mL、 尿苷对照品储备液 10. 0 mL、 腺嘌呤对照品 鸟苷对照品储备液 2. 5 mL、 腺苷对 储备液 2. 0 mL、 照品储备液 2. 0 mL， 置于同一 100 mL 量瓶中， 用水 稀释至刻度， 摇匀， 配成每 1 mL 约含次黄嘌呤 0. 02 mg、 尿苷 0. 1 mg、 腺嘌呤 0. 02 mg、 鸟苷 0. 025 mg 和 腺苷 0. 02 mg 的混合溶液， 即得。 2. 2 供试品溶液的制备 将熟地黄粉碎成粗粉， 取 1. 0 g， 精密称定， 置 50 mL 平底烧瓶中， 加入 10% 甲 醇 10 mL， 称 定 重 量， 超 声 （ 功 率 250 W， 频 率 40 kHz） 处理 1 h， 再称定重量， 用 10% 的甲醇补足缺失 的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 以 0. 45 μm 滤膜过 即得。 滤， 2. 3 色谱条 件 及 系 统 适 用 性 试 验 色 谱 柱： Diamonsil C18 （ 4. 6 mm ? 250 mm， 5 μm ） ； 流动相： 乙腈 （ A） － 0. 04 mol · L － 1 磷酸二氢钾溶液 （ B ） ， 梯度洗 0% A； 25 40min， 0% A →1% A； 40 脱（ 0 25 min， 60 min， 5% A ） ； 流 速： 1 mL·min ； 检测波长： 254 nm； 柱温： 30 ? ； 进样量： 20 μL。 在上述色谱条件下， 次黄嘌呤、 尿苷、 腺嘌
减慢心律等作用 。 目前熟地 苷还具有降低血压、 黄中 5 个核苷的同时含量测定未见报道 。本文研究 建立了应用 RP － HPLC 测定不同产地熟地黄中次 黄嘌呤、 尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷及腺苷含量的方法。 仪器与试药 1. 1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪： 四元泵， Waters 2487 UV 检 在线脱气， 柱温箱， 自动进样器， 1 Empower 色谱工作站； Sartorius BT 25S 型十万 测器， 分之一分析天平 （ 北 京 赛 多 利 斯 科 学 仪 器 有 限 公 司） ； SB 52000 型超声波清洗器 （ 宁波新芝生物科技 有限公司） 。 试 药 对 照 品 次 黄 嘌 呤 （ 批 号 140661 － 200903 ） 、 尿苷 （ 批号 887 － 200202 ） 、 腺嘌呤 （ 批号 110886 － 200001 ） 、 （ 110879 － 200202 ） 均 腺苷 批号 1. 2 购于中国食品药品检定研究院， 鸟苷购于上海同田 生物技术有限公司； 所有对照品均经 HPLC 检测为 单一成分， 纯度达到 99. 5% 以上。乙腈 （ 默克公司 ） 为色谱纯， 其他为分析纯， 水为娃哈哈纯净水。所用 熟地黄样品购于北京、 上海、 沈阳、 河南、 济南、 南京、 西安、 吉林、 太原、 内蒙古等地， 均经上海中医药大学 崔亚军副教授鉴定。 2 方法与结果 2. 1 混合对照品储备液的制备 取次黄嘌呤、 尿
50 min， 1% A → 5% A； 50
17. 3 、 24. 3 、 呤、 鸟苷、 腺苷的保留时间分别为 12. 5 、 44. 4 、 56. 8 min， 且 各 色 谱 峰 分 离 度 良 好， 均大于 1. 5 ； 理论塔板数按尿苷峰计算不低于 8000 。 色谱 图见图 1 。
混合对照品（ A） 及上海熟地黄样品（ B） 色谱图 Chromatograms of mixed standard references（ A） and Radix Rehmanniae Preparata from Shanghai（ B） 2． 尿苷（ uridine） 3． 腺嘌呤（ adenine） 4． 鸟苷（ guanosine） 5． 腺苷（ adenosine）
1． 次黄嘌呤（ hypoxanthine）
33 （ 1 ） 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013 ，
线性关系考察 精密吸取混合对照品储备液 0. 5 、 1. 0 、 2. 0 、 4. 0 、 8. 0 mL， 分别置于 10 mL 量瓶中， 2. 4 加入 50% 甲醇溶解并稀释至刻度， 摇匀， 即得一系 按上述色谱条件进 列不同浓度的混合对照品溶液， 以 样测定。以对照品浓度 X （ μg·mL ） 为横坐标， 峰面积 Y 为纵坐标， 绘 制 标 准 曲 线， 次 黄 嘌 呤、 尿 苷、 腺嘌呤、 鸟苷和腺苷的回归方程分别为： Y = 7. 150 ? 10 4 X + 1. 048 ? 10 3 r = 0. 9999 Y = 4. 026 ? 10 4 X + 4. 552 ? 10 3 Y = 9. 909 ? 10 X － 3. 248 ? 10 Y = 4. 869 ? 10 X － 1. 836 ? 10
4 4 4 4 4 3 －1
稳定性试验 取 1 号熟地黄样品的供试品溶 ， 1、 2、 4、 6、 8、 12 h 进样， 测定次黄嘌呤、 液 分别在 0 、 尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷、 腺苷的峰面积， 计算 RSD 分别 4. 3% 、 2. 8% 、 1. 2% 、 4. 2% ， 表明供试品 为 3. 1% 、 溶液在 12 h 内稳定。
加样回收试验 取已测知含量 （ 次黄嘌呤、 尿 198. 3 、 苷、 腺嘌呤、 鸟苷、 腺苷的含量分别为 22. 24 、
r = 0. 9999 r = 0. 9997 r = 0. 9999 r = 0. 9999
39. 60 、 25. 96 、 77. 12 μg·g － 1 ） 的 1 号熟地黄样品约 0. 5 g 共 9 份， 精密称定， 分别加入相当于样品含有 100% 、 150% 的对照品溶液， 量 50% 、 每个浓度各 3 “ 2. 2 ” 份。按 项下方法制备供试溶液， 在上述色谱 条件下进样测定， 计算加样回收率。 次黄嘌呤高、 中、 低 3 个 浓 度 的 平 均 回 收 率 分 别 为 97. 6% 、 100. 7% 、98. 4% ，RSD 分 别 为 0. 82% 、1. 6% 、 0. 97% ； 尿苷高、 中、 低 3 个浓度的平均回收率分别 100. 9% 、 101. 3% ， RSD 分别为 1. 6% 、 为 100. 7% 、 0. 70% 、 0. 15% ； 腺嘌呤高、 、 中 低 3 个浓度的平均回 98. 0% 、 99. 0% ， RSD 分 别 为 收率 分 别 为 97. 9% 、 2. 4% 、 2. 0% 、 1. 9% ； 鸟 苷 高 、 中、 低 3 个浓度的平 98. 7% 、 99. 5% ， RSD 分 均回收 率 分 别 为 97. 7% 、 1. 0% 、 0. 62% ； 腺 苷 高 、 别为 1. 8% 、 中、 低 3 个浓 度 的 平 均 回 收 率 分 别 为 99. 5% 、100. 6% 、 100. 5% ， RSD 分别为 1. 6% 、 0. 80% 、 1. 2% 。 结果 表明该方法准确度良好 。 2. 9 样品的含量测定 取 10 批市售熟地黄样品， “ 2. 2 ” 按 项下方法各制备 3 份供试品溶液， 按上述 色谱条件进样测定峰面积， 标准曲线法计算含量， 结 果见表 1 。
Y = 6. 794 ? 10 X + 3. 404 ? 10
结果表明次黄嘌呤、 尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷和腺苷进样 5. 0 80. 0 、 1. 0 16. 0 、 浓度 分 别 在 1. 0 16. 0 、 1. 25 20. 0 、 1. 0 16. 0 μg · mL
范围内线性关系
良好。 2. 5 精密度试验
取同一混合对照品溶液 （ 次黄 20 、 嘌呤、 尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷、 腺苷的浓度分别为 4 、
4、 5、 4 μg·mL ） ， “ 2. 3 ” 按 项下色谱条件连续进样 6 次， 测定次黄嘌呤、 尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷、 腺苷的峰 1. 3% 、 0. 50% 、 面 积， 计 算 RSD 分 别 为 0. 59% 、 2. 5% 、 0. 49% ， 表明仪器精密度良好。 2. 6 取 1 号熟地黄样品， 按“2. 2 ” 项 下方法平行制备供试品溶液 6 份， 按上述色谱条件 重复性试验 测定峰面积， 计算次黄嘌呤、 尿苷、 腺嘌呤、 鸟苷、 腺 198. 3 、 39. 60 、 苷 含 量 的 平 均 值 分 别 为 22. 24 、 25. 96 、 77. 12 μg · g － 1 ， RSD 分别为 0. 36% 、 2. 6% 、 3. 7% 、 2. 2% 、 1. 5% ， 表明该方法重复性良好。
序号（ No． ） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
熟地黄中 5 个核苷类成分的含量测定结果（ μg·g
， n = 3）
Results of the quantification of five components in Radix Rehmanniae Preparata
次黄嘌呤（ hypoxanthine） 22. 24 58. 81 47. 70 127. 3 126. 1 27. 92 61. 87 120. 5 117. 3 97. 35 尿苷（ uridine） 198. 3 274. 5 158. 4 292. 3 313. 6 242. 7 251. 0 274. 5 282. 4 308. 1 腺嘌呤（ adenine） 39. 60 18. 58 11. 16 24. 46 45. 79 12. 87 37. 34 18. 58 30. 40 22. 74 鸟苷（ guanosine） 25. 96 22. 21 17. 73 15. 32 30. 95 22. 21 29. 80 16. 46 18. 87 13. 13 腺苷（ adenosine） 77. 12 95. 58 84. 70 66. 08 120. 8 96. 58 85. 66 108. 4 84. 23 66. 79
来源（ source） 上海（ Shanghai） 北京（ Beijing） 南京（ Nanjing） 河南（ Henan） 太原（ Taiyuan） 沈阳（ Shenyang） 吉林（ Jilin） 内蒙古（ Inner Mongolia） an） 西安（ Xi’ 济南（ Jinan）
讨论 有文献报道通过水提醇沉工艺来考察药材中
［13 ］ 核苷类成分的含量 ， 此方法操作烦琐， 步骤多， 容 易产生误差。目前文献中多采用超声提取法及回流
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提取法， 本文考察了这 2 种方法， 二者无明显差异， ， 因超声提取法处理简单 重复性好， 故采取超声提取 法。通过考察， 用 10% 甲醇溶液超声处理 1 h， 提取 容易操作， 误差小， 更 效果为最佳。 此法步骤简单， 能真实地反映出熟地黄药材中核苷类成分的含量 。 3. 2 本试验考察了乙腈 － 水、 甲醇 － 水、 乙腈 － 0. 1% 甲酸水溶液、 乙腈 － 醋酸铵水溶液和乙腈 － 磷 酸二氢钾水溶液等流动相系统， 结果显示以乙腈和 磷酸二氢钾水溶液为流动相时分离度及峰形能够达 －1 到较好效果， 因此采用乙腈 － 0. 04 mol · L 磷酸二 氢钾水溶液为流动相梯度洗脱。 3. 3 本文中理论上应采用二极管阵列检测器对对 照品的峰纯度做进一步的验证， 但由于对照品主峰 的柱效、 理论塔板数等均符合纯度要求， 便认为其符 合对照品纯度要求。 3. 4 本文中 10 批样品测定结果显示， 市售熟地黄 中核苷类成分含量差异较大， 可能与其炮制加工方 法有关。张丽萍考察到不同的炮制方法对地黄中还 原糖的含量有一定的影响
ZHANG Liu － ji （ 张留记） ， TU Wan － qian （ 屠万倩） ， YANG Ran （ 杨冉） ， et al． Determination of rehmannioside D in Radix Rehmanniae from various habitats （ 不 同 产 地 地 黄 中 地 黄 苷 D 的 测 2008 ， 27 （ 3 ） ： 56 定） ． Chin J Anal Lab（ 分析实验室） ，
LU Lin（ 卢林） ， WU Jun － jin （ 吴君金） ， MA Qiang （ 马强） ， et al． Determination of catalpol in Radix Rehmanniae and by UPLC（ UPLC 法测定地黄中梓醇的含量） ． Chin Arch Tradit Chin Med （ 中华中 2010 ， 28 （ 6 ） ： 1309 医药学刊） ，
YANG Pei － min （ 杨培民） ， CAO Guang － shang （ 曹广尚） ． Determination of catalpol in different processsed products of Radix Rehmanniae by HPLC （ HPLC 法 测 定 地 黄 不 同 炮 制 品 中 梓 醇 的 含 2009 ， 28 （ 10 ） ： 598 量） ． Qilu Pharm Aff（ 齐鲁药事） ，
ZHANG Li － ping （ 张丽萍） ， LI Jun （ 李军） ， ZHANG Zhen － ling （ 张振凌） ， et al． Determination of the reducing sugar content in Radix Rehmanniae steamed and steamed for nine times and shined for nine times（ 熟地黄清蒸和九蒸九晒炮制品中还原糖含量测定） ． J Henan Univ Chin Med（ 河南中医学院学报） ， 2005 ， 119 （ 20 ） ： 22
ZHANG Qing － bo（ 张清波） ， QIAO Fei （ 乔菲） ， CHEN Xiao － xue （ 陈晓雪） ， et al． Determination of 5 － HMF in Radix Rehmanniae Preparata by HPLC（ HPLC 测 定 熟 地 黄 中 5 － 羟 甲 基 糠 醛 的 含 2001 ， 4 （ 2 ） ： 33 量） ． Drug Stand China（ 中国药品标准） ，
。 刘明考察了地黄在
ZHOU Jun（ 周军） ， LI Xiao － ye（ 李晓 QIN Xiang － yang（ 秦向阳） ， et al． RP － HPLC determination of 5 － hydroxy － methylfurfural 晔） ， in prepared Rehmannia root（ RP － HPLC 法测定熟地黄中 5 － 羟甲 基糠醛的含量） ． J Fourth Mil Med Univ （ 第四军医 大 学学报） ， 2006 ， 27 （ 6 ） ： 510
［14 ］ 九蒸九晒炮制过程中益母草苷的含量动态变化 。 综合文献结论及实验结果得出， 加强药材炮制加工
管理对药材质量控制至关重要。 3. 5 本文建立了测定熟地黄中次黄嘌呤、 尿苷、 腺 嘌呤、 鸟苷及腺苷 5 个核苷类成分含量的高效液相 色谱法。方法操作简便、 准确， 灵敏度高， 重复性好， 可用于同时测定熟地黄中的多个核苷类成分 。
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RP-HPLC测定天然虫草与人工虫草中核苷类成分的含量...
RP-HPLC法测定熟地黄中5-羟甲基糠醛的含量...
反相高效液相色谱法测定薄芝菌丝体中3种核苷类成分的含量...
RP-HPLC法同时测定雪莲注射液中3种成分的含量...
RP-HPLC法测定鬼箭羽中3种活性成分的含量...
RP-HPLC法测定不同品种和产地红景天中指标成分的含量...
HPLC测定熟地黄中5_羟甲基糠醛的含量...
RP—HPLC法同时测定久芝清心胶囊中5种蒽醌类成分的含量...
高效液相色谱法同时测定中药材虎掌南星的核苷类成分...
RP—HPLC法测定小儿退热片中三种有效成分...
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