Nature重要成果：随机突变是这样来的【进化论吧】_百度贴吧
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&签到排名：今日本吧第个签到，本吧因你更精彩，明天继续来努力！
本吧签到人数：0成为超级会员，使用一键签到本月漏签0次！成为超级会员，赠送8张补签卡连续签到：天&&累计签到：天超级会员单次开通12个月以上，赠送连续签到卡3张
关注：31,292贴子：
Nature重要成果：随机突变是这样来的收藏
最近Nature杂志上发表的研究指出，量子悸动的出现频率与DNA复制错误的频率差不多，它们可能就是随机突变的基础。
　　生物通报道：DNA复制机器能够以极快的速度和惊人的准确性将正确的碱基（G-C 、A-T）配对形成DNA双螺旋。它们能够识别正确的碱基搭配，丢弃错误的组合。不过，这些机器每复制10,000 -100,000 bp就会犯个错误，这个错误如果不校正就会成为基因组突变。 研究者们几十年来一直想知道，这些貌似随机的错误是如何产生的。一些人认为，DNA碱基会在一瞬间改变形态，让复制机器把错误的碱基对掺入DNA。但此前还没人捕捉到这种微小的形态转变。日前，Duke大学的研究人员观察到了这种极微小的碱基改变。在短短一瞬间，发生改变的碱基看起来像是另一个碱基。这种“量子悸动”（quantum jitter）现象极为罕见，存在的时间也极短，但却会产生深远的影响。这项发表在Nature杂志上的研究指出，量子悸动的出现频率与DNA复制错误的频率差不多，它们可能就是随机突变的基础。“DNA结构本身就允许错误发生，”Duke大学的Hashim M. Al-Hashimi教授说。“这些错误非常关键，没有它们生命就无法进化。但如果这样的错误太多，基因突变就会脱离控制，使我们无法生存。量子悸动将自发性突变的频率调节得恰到好处。”沃森和克里克1953年发现DNA双螺旋之后，就曾预测碱基会改变形态并导致错配。近十年来人们获得了DNA中发生错配的图像，但还不清楚错配发生的具体机制以及决定错配出现频率的因素。（延伸阅读：Cell惊人发现：DNA复制方案因人而异）研究人员使用一种NMR技术（NMR relaxation dispersion）来成像这些极为微小而且稍纵即逝的改变。Al-Hashimi实验室的研究生Isaac J. Kimsey设计了含有一个G-T错配的双链DNA，随后通过NMR技术检测G和T上的原子。G和T一般是不能配对的，因为它们表面伸出的氢原子彼此冲突。沃森和克里克之前的理论是，氢原子可能被推开而形成错配。Kimsey通过NMR技术首次在DNA双链中获得了这种原子重排的直接证据。研究显示，RNA中也存在类似的现象。这种微小的运动（量子悸动）耗费大量的能量，碱基要尝试差不多一万次才能成功一次。成功之后的新形态也只能维持很短的时间（50-200微秒），随后氢原子又会回到原来的位置。研究人员发现，这种罕见状态的出现频率与聚合酶的错误频率差不多。随机突变是生命进化的基础也和癌症发展有关，这项研究阐明了随机突变的基础，“我们可以利用这一点设计药物，诱使癌细胞或病毒更快出现复制错误，使其突变脱离控制并最终死亡，”Kimsey说。
江苏贝尔照明专注太阳能路灯22年，注重品质，售后完善
核苷酸碱基的“互变异构”——互变异构过程被认为与量子隧穿效应有关
人类和猩猩的xq21基因是同一个同位置同序列病毒片段，没一个碱基的差异，说明是同一个祖先 只有同个生殖细胞的融源病毒转入才会在后代的同序列出现，内源性逆转录病毒（ERV）构建的进化树，就是证据
随机突变现象，是不能够100%精确复制导致的，运作机理并不明确，相关因素太多，目前实验结果，无机物可以变成有机物，生命的硬件部分是可以形成的，这个基因又是哪里来的呢
没理解错的话基因突变居然是量子效应
量子涨落导致基因复制错误，不是N年前就有了的结论吗？咋又改个名字叫“量子鸡冻”呢？还是说以前只是有理论，现在实际观察到了？
这些机器每复制10,000 -100,000 bp就会犯个错误，这个错误如果不校正就会成为基因组突变。“DNA结构本身就允许错误发生，”Duke大学的Hashim M. Al-Hashimi教授说。“这些错误非常关键，没有它们生命就无法进化。量子悸动
是谁设定复制机器犯错的开关？犯错其实也是一件好事，否则又怎会有我这个混
蛋降生？量子力学真的让人恐惧！！！
薛定谔好像说过，基因突变可能与量子有关
登录百度帐号推荐应用不用「切割」也能精准编辑基因了，华人学者开发全新「碱基编辑器」
&&原标题:不用「切割」也能精准编辑基因了，华人学者开发全新「碱基编辑器」
&&摘要：CRISPR 基因编辑技术之外的新工具。
&&基因编辑技术有了重大进展。Broad 研究所的华人学者 David Liu 教授的团队开发出了一种「碱基编辑器」，可以让细胞内 DNA 的一种碱基通过简单的化学反应，变成另一种碱基，达到精准编辑基因的目的。这给基因编辑技术带来了另一种编辑工具。该研究被发表在了国际顶级学术期刊《Nature》上。
&&说到基因编辑技术，如今最常用的是 CRISPR 基因编辑技术，通过处理后的病毒携带基因片段，进入细胞内 DNA 替换原有基因。这种技术，需要切割 DNA 才能实现基因编辑。而「碱基编辑器」的突破在于，它不需要切割 DNA，直接在 DNA 上进行化学反应，来精准编辑基因。而此前，CRISPR 基因编辑技术可能会引起随机插入和删除等突变，而「碱基编辑器」技术则几乎避免了这种情况。
&&下面，我们来了解一下这项技术的原理。
&&我们在中学课本上就已经知道，DNA 的双螺旋结构由 4 种碱基组成：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）。其中，A 和 T 配对，C 和 G 配对，组成了人类的遗传信息。一个问题是，胞嘧啶（C）容易发生脱氨突变，这样一来，C-G 就变成了 A-T 组合。这种单碱基变异可能会引起病变，高达一半的致病单碱基变异来源于这种突变。而这种突变是可遗传的，也就是我们所说的遗传病。
&&想要根治这种病变，就要从基因层面进行纠正，也就是说要把突变形成的 A-T 组合还原成 C-G 组合。
&&David Liu 教授的团队在实验中观察到：腺嘌呤（A）在出现脱氨反应后，会变成一种叫做肌苷的分子，而它与鸟嘌呤（G）的结构非常接近，也能成功骗过细胞里的 DNA 聚合酶。简单的几轮 DNA 复制后，A-T 组合就能变回 C-G。
合适的脱氨反应能将腺嘌呤转变为结构类似于鸟嘌呤的肌苷 图 |《Nature》
&&然而，科学家们发现，自然界中并没有能够在 DNA 中催化腺嘌呤（A）进行脱氨反应的酶。不过，在人体中存在一种叫做 TadA 的酶，能使 RNA 上的腺嘌呤（A）脱氨。David Liu 教授的团队对 TadA 进行了改造，并将编码 TadA 的基因引入大肠杆菌内，在大肠杆菌的快速繁衍中突变出了可以催化 DNA 腺嘌呤（A）的能力。
&&目前，David Liu 教授的团队已经有了把 C 变成 T，把 A 变成 G，把 T 变成 C，以及把 G 变成 A 的工具。
&&有了能让 DAN 中的腺嘌呤（A）脱氨的酶，下一步就要做到精准控制，特异性催化。换句话说，就是只催化那些突变后的碱基，而不是对所有的腺嘌呤（A）进行催化。怎么做呢？
&&这个时候，David Liu 教授想到了 CRISPR 基因编辑技术，因为 CRISPR-Cas9 系统在基因编辑时可以做到非常精准。不同的是，David Liu 教授的团队引入了一种无法切割 DNA 的特殊的 CRISPR-Cas9 系统，既可以精准定位，又不会切割 DNA。
碱基编辑器的作用机理 图 | 《Nature》
&&经过漫长的 7 代筛选，David Liu 教授的团队终于开发出了「碱基编辑器」，通过可以催化 DNA 碱基的 TadA 酶，精准编辑 DNA 上的碱基。研究显示，该技术在人类细胞中的编辑效率超过了 50%。
&&正如开篇所说，David Liu 教授团队开发出的这种工具，不仅是基因编辑的另一种新工具，同时也降低了基因治疗的风险，在治疗单基因突变上可能更为安全有效。CRISPR 基因编辑技术的出现曾让基因编辑爆发，此次新工具的问世，想必还会引发一系列的连锁反应。可能，基因编辑的时代真的要来了。
&&头图：David Liu 教授
&&责任编辑：早优夫斯基
编辑：新语关注今日：14 | 主题：316447
微信扫一扫
【旧帖整理】关于解决“载体自连”相关的帖子
页码直达：
这个帖子发布于12年零333天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近看到很多站友们问载体自我连接的相关问题，于是在这里把相关的帖子做一个整理。不周之处，请各位高手批评指点，谢谢。绵绵 ：求教：载体自连中遇到的问题zhujlcbs ：关于t载体自连的问题 曹素芳 ：请教主任：去磷酸化问题 effei ：求助！有关PCR产物的末端碱基的问题．
spzr ：蓝白斑筛选的问题 lettuceiyv ：载体上只有一个可用的酶切位点（BamHI/NcoI，两者是部分重叠的）， 有什么办法可以提高克隆效率？比如改造载体， 增加酶切位点。如何做？或者做单位点连接时要注意些什么？怎样才能降低载体自连？CIP好用还是SAP好用？large ：[求助】请教T载体的制作？ mdoctor ：T载体可能自连吗
davidsnow ：我的片段与T载体(promega)做连接后 ,转化做蓝白斑筛选,几次连接转化下来都是蓝斑,全都是自连.T载体本身本没有这么高的自连背景,我的片段是经过胶回收的,而且也在最后多加了一步加A的延长反应.为了能够与T载体自连,可到最后还是无济于事.请高手指教一二.bluesky ：请教关于TOPO的几个问题 死心眼 ：求助：表达载体和目的片断总是连不上！！ zwangw
：潮霉素抗性 （这个帖子没有人回答，我想是不是zwangw 站友自己又有了新的看法，希望zwangw 站友能够给自己一个完满的回复）dongjing ：我的连接产物经PCR鉴定是正确的，但为何酶切却得不到正确条带？（我同时用空载体和连接产物酶切，其中空载体（约5.6kb)上有两个酶切位点得到两个片段（4.6kb和1kb)是正确的，但连接产物(插入的目的片段约150bp）却只有一个片段其大小约大于等于5.6kb，看起来好象没有进行酶切。我尝试过减少DNA用量或增加酶用量，但结果基本相同。 急盼高手指教！又请教：载体自连的几率多大，如何估计？我必须要做脱磷处理吗？ merry1999 ：我把目的基因已经克隆到pGEM-Teasy载体上，AseI和NheI双酶切，与同样双酶切的pGFP-C2载体相连接，酶切体系100ul，电泳凝胶回收，连接比例试过多种(载体和基因：1:1,1:3,1:10,3:1)，感受态经测试是有效的，可是总是无任何菌落形成，有一次长了很多菌落，但挑了上百个也没有目的基因，经酶切鉴定可能是载体自连的，但我的载体肯定是酶切完全的（因为切和没切开的在电泳中能看出来。请问这是什么原因？ Yong ：【鸡毛蒜皮】之5－连接反应中巧用内切酶 sumtic
：平端连接的一个办法，可以试试
1、载体和插入片段DNA的量都要比黏末端连接时的用量多，可以增加到5倍以上。 2、载体务必去磷酸化处理(许多公司都有这类酶，比如NEB的CIP(点击进入产品页面)。 3、如果是PCR生成插入片段，要用产生平端片段的PCR酶(如PFU)，必须磷酸化5'末端，可以磷酸化引物，也可以磷酸化产物，我一般磷酸化产物，这一步最关键也最容易遗漏(请参考T4PNK(点击进入产品介绍)。普通Taq酶PCR以后可以补平再做连接，但是仍然需要磷酸化，当然如果是PCR以后再酶切成平端那和普通酶切片段是一样的。 4、按照分子克隆第三版介绍，如果线性化载体时所用的内切酶在插入片段序列内没有位点，酶切和连接可以在一个反应体系内同时完成(相关内容请查阅分子克隆III)，但是我的实验证明这个方法效率并不高。我建议采用下面方法：酶切载体-&分离片段-&CIP-&插入片段磷酸化-&纯化片段-&按照正常连接反应，体系内加入线性化载体所用内切酶，按照酶切1/10浓度加入。这样基本上可以完全阻断载体自连接(因为凡是载体自连都将被酶切再次线性化，而插入片段形成新质粒则不会被酶切)，提高连接效率。 5、连接酶用量也要适当增加，建议用高浓度连接酶T4 DNA ligase(点击连接产品页面)，不要用快速连接方法。 6、连接体系是否加入PEG，好象没有显著差别，另外PEG分子量也没有特殊要求，PEG4000到PEG8000都曾经出现在公司药合里面。 hyfyliu1979 ：关于Klenow片段，XbaI以及载体去磷酸化 各位大侠：　　大家好！有三个问题向诸位请教。1．
有谁用过DNA聚合酶的大片段Klenow吗？我按照文献上的反应条件进行DNA片段的延伸，37℃，15min,75℃,15min。目的片段的长度为57个碱基。延伸后跑电泳除了目的带，还有延伸不完全的比较弥散的带。不知道是反应条件的问题还是别的什么。2．
以上的延伸片段还需用XbaI酶切。可每次酶切都不完全。不管加多少酶（加过6微升），也不管切多长时间（切过20小时）。是这个酶的效率太低吗？3．
在电转化中，为了防止载体自连，我将其去磷酸化，但总还是有自连的。请问各位有什么高招吗？　　上丁香园的网站已经有一阵了。因为自己是新手，还没遇到过问题，每次只是看一看。这次终于不行了。这几个实验做了好长时间怎么也做不顺。希望能得到大家的帮助！在这里先谢过大家了！ springna ：T4DNA聚合酶使粘性末端平端化后，酶切位点保留吗？
一含有两个不同粘性末端的线性载体，用T4DNA聚合酶进行平端化后，进行载体自连。转化后提质粒鉴定时再用原先产生粘性末端的两个酶分别作单酶切，为什么不能得到正确大小的单酶切产物，是不是用T4DNA聚合酶使粘性末端平端化后，原先酶切位点不能被保留？而且平端化后发现原先载体被切去1kb多，怎么样控制反应条件才能使3‘－5’外切酶活性减弱?我是按照说明书25度反应5min，再70度10min灭活酶。从转化平板挑取了3个菌落，结果鉴定其大小都是不一样的，真是郁闷啊？ joeys008
：紧急求助有关PIRES载体的酶切
想请教各位前辈一些问题----最近我用MBI的Not1和Xba1对PIRES载体进行酶切以便与外源片段连接，做了几次都是载体自连菌落。不知道是不是因为载体酶切不完全。Not1和Xba1没有公用BUFFER，在Not1适用的BUFFER O+里Xba1的效率是20-50%，，请问可以加大酶量做双酶切吗？----如果不用双酶切，而是先切一刀，抽提后再切，中间残留的苯酚会不会影响切第二刀？ 我不知道是哪里出了问题，是载体初始量太大（1ug)酶切不完全,还是苯酚残留影响酶切与连接，还是连接时载体的用量太大（40ng）导致自连率过高，或者是没有注意到Not1和Xba1的一些特性？到底做克隆时需要留意哪些手法和细节？？xiye ：求助！！！外源片段和载体的连接及转化
我将外源片段和载体分别双酶切，电泳后可见质粒载体变为线性，但目前用TAKARA的连接试剂盒连接，连接后转化，菌落总也长不出来，我做了一个质粒载体单酶切后自连及转化的对照，只长出9个菌落。有人说是因为我的连接体系中的各酶切片段都溶在TE中，影响了离子浓度，请问TE对连接反应是否有影响？还有外源片段和载体连接以及载体自连的连接体系中各成分的比例大家有没有经验值？或者高手们看出我以上的过程有什么疏漏victor2002 ：双酶切求教 我用Not I 和 SacII 酶切位点的目的基因片断（已加保护性碱基），进行双酶切, 然后克隆于表达载体。同时对纯化的PCR产物和已连接在T－载体上的目的片断酶切，先用Not I酶切，回收后再用SacII酶切，再回收目的酶切片断，与表达载体16o C连接过夜，转化后得到许多克隆（两个产物都是），挑N个克隆摇菌，无菌液长出（24H），继续从平皿中（4o C过夜）挑克隆摇菌，有菌液长出。PCR鉴定，没有插入目的片断，只是载体自连。酶切连接了几次都不成功，郁闷啊！我也试过先用SacII酶切再用Not I酶切，同样也没成功（用SacII酶切PCR产物时，电泳时条带较宽。 拓荒者 ：平末端连接构建载体的一些个人经验
这是在网上看到的，觉得还行，大家看一下1、载体和插入片段DNA的量都要比黏末端连接时的用量多，可以增加到5倍以上。 2、载体务必去磷酸化处理(许多公司都有这类酶，比如NEB的CIP(点击进入产品页面)。 3、如果是PCR生成插入片段，要用产生平端片段的PCR酶(如PFU)，必须磷酸化5'末端，可以磷酸化引物，也可以磷酸化产物，我一般磷酸化产物，这一步最关键也最容易遗漏(请参考T4PNK(点击进入产品介绍)。普通Taq酶PCR以后可以补平再做连接，但是仍然需要磷酸化，当然如果是PCR以后再酶切成平端那和普通酶切片段是一样的。 4、按照分子克隆第三版介绍，如果线性化载体时所用的内切酶在插入片段序列内没有位点，酶切和连接可以在一个反应体系内同时完成(相关内容请查阅分子克隆III)，但是我的实验证明这个方法效率并不高。我建议采用下面方法：酶切载体-&分离片段-&CIP-&插入片段磷酸化-&纯化片段-&按照正常连接反应，体系内加入线性化载体所用内切酶，按照酶切1/10浓度加入。这样基本上可以完全阻断载体自连接(因为凡是载体自连都将被酶切再次线性化，而插入片段形成新质粒则不会被酶切)，提高连接效率。 5、连接酶用量也要适当增加，建议用高浓度连接酶T4 DNA ligase(点击连接产品页面)，不要用快速连接方法。 6、连接体系是否加入PEG，好象没有显著差别，另外PEG分子量也没有特殊要求，PEG4000到PEG8000都曾经出现在公司药合里面。 -------------------------------------------------------------------------- PCR 引物或者产物的磷酸化反应： Primer (oligo 5-10 pmol/ul, use 2-4 ul in PCR mix) or PCR product--------------------------------------40ul T4 PNK Buffer-----------------------------------------6ul T4 PNK--------------------------------------------------3ul (30U) 0.1M ATP--------------------------------------------0.6ul H2O--------------------------------------------------10.4ul Total Volume 60ul 楚风
：关于重组假阳性
本人有一问题，努力思考了N天也得不到答案，故求救于此。本人有一目的片段C（从国外学者处求得，他给的是一载体，NotI单酶切后装入的），欲将其构建于A、B两个载体上，A上没有目的片段两端的酶切位点，只能目的片段平滑化和去磷酸化后才能将其装入A载体；B载体上有C的酶切位点NotI，但是单酶切易自连，故也需去磷酸化。目前，我做了近十次转化了，挑了七十个克隆，只有两个阳性。我急需的重组体如何也构不成。请帮帮我分析原因。下面是我的主要操作步骤：A-C的过程：A 单酶切，电泳、胶回收， T4 聚合酶平滑化，去磷酸化；C单酶切，电泳，胶回收，平滑化，A-C T4 连接酶16度过夜。转化。B-C的过程：B单酶切，电泳、胶回收， 去磷酸化；C单酶切，电泳，胶回收，B-C T4 连接酶16度过夜。载体和目的片段的比例是1：5-10。转化。平板上的转化子并不少，但是全是假阳性。即大部分为载体自连，也有极少可能是片段自连的。至今我已挑了七十个克隆，只有两个是对的。为什么我的重组效率这么低？主要可能是那个方面的问题？我觉得可能是碱性磷酸酶的问题。注：用的全是TAKARA的产品。 yuanshang ：E.coli genomic library construct 求教 最近我在做一个E.coli genomic library construct，遇到一些问题，向论坛上的大侠请教。请帮忙看看问题出在哪里。万分感谢！我的方法流程如下： 1。用SDS和蛋白酶K提取E.coli genomic DNA (用的是E.coli的一个突变菌株) 2。insert: Sau3AI digest E.coli genomic DNA, partail digestion, to get 2kb-5kb, 这一步我摸过酶切时间梯度，用0.1unit Sau3AI，40ul 反应体系，约3ug genomic DNA， 部分酶切可得到约1ug的smear片断。 3. vector: pBR322 BamHI digestion （注：我的genomic DNA 和 Vector pBR322 都是手提的，没用试剂盒，从酶切效果来看，还可以。） 1％gel切胶回收用的 是鼎国的kit。4. ligation: T4 ligase（Takara company）, insert:vector (mol)=3:1 （总DNA约0.5ug） 5. ethanol 沉淀，electrotransformation, 结果得到的colony比较少，0.5ug 连接产物沉淀后, dissolve in 20ul ddH2O, 2ul + 50ul cell, spread on 8 plates, 总共只得到约1000个colonies（由于vector是单酶切，这里面还有载体自连产物，电转感受态细胞的转化效率很高，10的7次方－10的8次方），我的目的是希望尽可能cover E.coli 2kb-5kb之间的gene，所以希望能够得到5000－1w左右的colony。 但似乎电转达不到这个目的。我的老板给的建议是把insert用BamHI Meghylase甲基化处理，然后在T4连接过程中在连接体系中同时加入0.5unit BamHI, 18度 20min -& 20度 20min， 20 cycles，然后65度 15min酶失活处理，乙醇沉淀，电转。这个方案我正在试，还没 得到结果。还想请问对载体磷酸化是不是很必要？ 我已经反复做了一个多月了，没有突破，很是着急， 从论坛上也看到相关的帖子，如果有什么好的实验方法资料推荐，请一定多多指点guyuebugu ：我收集的几个Northern杂交protocol（同位素，DIG，生物素等），供大家参考！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
freeshipnol 编辑于
关于丁香园