食品卫生检验_甜梦文库
食品卫生检验
食品微生物检验刘 斌
引言? ? ? ? ?国内外食品安全形势严峻，恶性事件不断发生。 欧洲“二f英”、“疯牛病”（20世纪90年代） 日本大肠杆菌O157:H7中毒（1996） 中国SARS（2003） 、东南亚国家禽流感（2004） 美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件（2006）第一章食品中的微生物及其检测?了解食品中的微生物主要来源于土壤、空气和水，因此应 注意食品从原料到加工、贮运、销售等各个环节的卫生。 了解不同微生物对营养的要求有不同，因此，不同食品的 变质，引起其变质的微生物类群有不同。 了解评价食品质量的主要标准。 了解食品检验中细菌总数、大肠菌群数的定义及其检验意 义。?? ?第一节食品中的微生物－－来自土壤?自然界中微生物的分布极为广泛，水中、高山、海底、荒漠、极地、 空气等到处都生存着各种各样、形形色色的微生物。 土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育所必须的一切 条件：土壤中含有一定的无机物和有机物；土壤中含有适当的水分； 大多数中性偏碱,适合大多数微生物生长；土壤中还含有气体，主要 是CO2、O2和N2；温度变化不大（10-25℃）。 土壤中含有大量的微生物，土壤中的细菌来自天然生活在土壤中的 自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体进入土壤的细菌。 土壤中微生物的分布：表层受日光照射和干燥的影响，不利于其生 存，所以细菌数量少，离地面10-20厘米土层微生物最多.土层越深， 菌数越少。???食品中的微生物－－来自水源?水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、 人畜排泄物及垃圾等。水中微生物种类及数量因水源不同而异。 受到污染的水中含有大量的有机物，适合微生物的生存。静水中的微 生物多，流水中的少；离岸近处微生物多，离岸远处少；经过大城市 的河流，水受到污染，含有大量的粪便.并含有大量的致病菌。 井水和泉水中细菌少，雨水、雪水中也少，城市上空的雨水细菌多， 乡村上空雨水细菌少。 国家规定，自来水中，细菌总数每毫升不得超过100个，大肠菌群不 得超过3个/升.???食品中的微生物－－来自空气?在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空气的传播，特别是在公共场所，人多，空气流通差，细菌多； 大城市上空微生物数量最多，乡村少；森林、草地和田野上空空气清 洁，海洋、高山、冰雪覆盖的地面上空，微生物更为稀少。雨后空气 特别新鲜。?食品中的微生物－－来自人体?人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界 相通的各种控道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体 无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等。 皮肤：表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、耻垢杆菌等 口腔： 球菌（甲型或乙型）、乳酸杆菌、螺旋体、梭形杆菌、白色念球菌、 （真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、类白喉杆菌等? ???胃：正常一般无菌肠道：类杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、厌氧性链球菌、粪链球菌、葡萄球菌、 白色念球菌、乳酸杆菌、变形杆菌、破伤风杆菌、气荚膜杆菌等 鼻咽腔：甲型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、乙型链球菌、葡萄 球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等 眼结膜 ： 皮表葡萄球菌、结膜干燥杆菌、类白喉杆菌等??第二节微生物引起食品腐败变质?食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生长基 质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。食品腐败变质的原因有物理 学、化学、生物化学和微生物学方面的原因，但最普遍、最主要的因 素是微生物。 环境中无处不存在微生物，食物在生产、加工、运输、储存、销售过 程中，很容易被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖， 分解食物中的营养素，以满足自身需要。这时食物中的蛋白质就被破 坏了，食物会发出臭味和酸味，失去了原有的坚韧性和弹性，颜色也 会发生变化从而造成食品变质。?新鲜果蔬和果汁的腐败变质?开始引起新鲜水果变质的微生物是酵母菌和霉菌。引起蔬菜变质的主 要是酵母菌、霉菌和少数细菌。起初霉菌在果蔬表皮，或其污染物上 生长，然后霉菌侵入果蔬组织，首先分解细胞壁中的纤维素，进一步 分解其中的果胶、蛋白质、有机酸、淀粉、糖类等，使其变成简单物 质。在外观上出现深色斑点，组织变松、变软、凹陷，渐成液浆状，并出现酸味、芳香味或酒味等。?果汁中主要发生乳酸菌以果汁中糖分、柠檬酸、苹果酸等有机酸为发 酵基质的乳酸发酵和最常见的酵母菌引起的酒精发酵。在浓缩果汁中， 一般性细菌难以忍受高浓度的糖分。果汁常见的霉菌是青霉，其次是曲霉。果汁变质后会呈现浑浊、产生酒精和有机酸变化，结果原有风味被破坏或产生一些不愉快的异味。乳及乳制品的腐败变质?乳及乳制品的营养成分比较完全，都含有丰富的蛋白质、极易吸收的钙和完全的维 生素等。因此极易为微生物所腐败变质。 鲜乳中污染微生物主要来源于乳房内的污染微生物和环境中的微生物。主要有乳酸 细菌、胨化细菌、脂肪分解细菌、酪酸细菌、产气细菌、产碱细菌、以及酵母和霉 菌。它们在鲜乳中的生长有一定的顺序性，可以分为抑制期、乳酸链球菌期、乳酸 杆菌期、真菌期和胨化细菌期， pH 值也是先下降再逐步回升。 含水量合格的奶粉不适宜微生物生长。但原料奶污染严重，加工又不当的奶粉中可 能污染有沙门氏菌（ Salmonella ）和金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ） 等病原菌。这些病原菌可能产生毒素而易引起中毒。微生物引起淡炼乳变质，一是 产生凝乳，即使炼乳凝固成块。由于作用的微生物不同，凝乳又可为甜性凝乳和酸 凝乳；二是产气乳，即使炼乳产气，使罐膨胀爆裂；三是由一些分解酪蛋白的芽孢 杆菌作用，使炼乳产生苦味。???微生物引起甜炼乳变质也有三种结果：一是由于微生物分解甜炼乳中蔗糖产生大量 气体而发生胀罐；二是许多微生物产生的凝乳酶使炼乳变稠；三是霉菌污染时会形 成各种颜色的钮扣状干酪样凝块，使甜炼乳呈现金属味和干酪味等。肉、鱼、蛋类的腐败变质?禽畜肉类的微生物污染，一是在宰杀过程中各个环节上的污染，二是病畜、病禽肉类 所带有的各种病原菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、布鲁氏菌 （ Brucella ）等。腐生性微生物污染肉类后，在高温高湿条件下很快使肉类腐败变 质。肉类腐败变质，先是由于乳酸菌、酵母菌和其他一些革兰氏阴性细菌在肉类表面 上的生长，形成菌苔而发粘。然后分解蛋白质产生的 H 2 S 与血红蛋白形成硫化氢血 红蛋白而变成暗绿色，也由于各种微生物生长而产生不同色素，霉菌生长形成各种霉 斑。同时可产生各种异味，如哈喇味、酸味、泥土味和恶臭味等。?鱼类极易为水生微生物所引起腐败变质。假单胞菌、无色杆菌（ Achromobacter ）、 黄杆菌（ Flavobacterium ）、产碱杆菌（ Alcaligenes ）、气单胞菌 （ Aeromonas ）等，是新鲜鱼类的主要腐败菌。新鲜鱼类变质后组织疏松，无光泽， 由于组织分解产生的吲哚、硫醇、氨、硫化氢、粪臭素等，而常有难闻恶臭。腌鱼由 于嗜盐细菌的生长而有橙色出现。鲜蛋也由于卵巢内污染、产蛋时污染和蛋壳污染而发生微生物性腐败变质。污染鲜蛋 的微生物有禽病病原菌、其他腐生性细菌和霉菌等。它们使鲜蛋成为散黄蛋，并进一 步分解产生硫化氢、氨、粪臭素等，蛋液成灰绿色，恶臭或粘附于蛋壳、蛋膜上。?罐藏食品的腐败变质?罐藏食品也会发生腐败变质，其原因在于杀菌不彻底，罐内仍残留有一定 量的微生物，或者罐头密封不良而漏罐，外界进入微生物。?由于灭菌不彻底而残留的微生物，一般以嗜热性芽孢杆菌为主。它们所引 起的罐头腐败变质有三种：一是罐头外观正常，但内部 pH 值可下降 0.1~0.3 ，称为平酸变质；二是 TA （ thermo-anaerobes ）嗜热性厌氧 菌腐败，产气、产酸并可使罐头胀裂；三是产生硫化物腐败食品。如罐头 中未杀灭的是厌氧性梭状芽孢杆菌，则可能会进行丁酸发酵，并产生氢气 和 CO 2 ，不产芽孢细菌的污染主要是由于罐头漏罐所引的，它们使罐头 内食品发生浑浊、沉淀风味改变和产气胀罐。对于发生腐败变质的罐头食品，必须根据腐败变质的现象作微生物学分析， 如是否产气胀罐，是否浑浊沉淀，是否变酸或 pH 上升等等，以便作出正 确判断，避免腐败变质的进一步发生。?第三节食品微生物检验的任务和内容?任务通过测定微生物指标，判断食品在加工环境和食品原料 及其在加工过程中被微生物污染及生长的情况，为食品 环境卫生管理和食品生产管理及某些传染病的防疫措施 提供科学依据。食品微生物检验的任务和内容? ?检验的范围 生产环境的检验?? ?原辅料的检验食品加工、储藏、销售环节的检验 食品检验（重点）食品微生物检验的任务和内容??食品微生物检验的指标食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所 提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、 大肠菌群和致病菌三项。??菌落总数（个/1g、1cm、1cm2 )：清洁状态的标志；预测食品可能存放的期限.大肠菌群(MPN/100ml):较为理想的粪便污染的指标菌群；作为肠道致病菌污染食品的 指示菌. 致病菌(不得检出）：沙门氏菌、肉毒梭菌、志贺氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、葡 萄球菌、霉菌 霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素， 引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶 属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。???其它指标：微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克 氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑， 寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫， 肺吸虫，弓形体，螨，姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等等。
食品微生物检验技术的发展现状及趋势? ?我国食品卫生微生物检验质量控制工作现状分析； 食品微生物诊断新技术：免疫学检测技术；核酸探针技术； PCR技术；生物芯片技术等。我国食品卫生微生物检验质量控制工作现状分析?建国来我国食品卫生微生物检验方法的发展经历了3 个阶 段, 方法逐步建立、统一阶段( 1949 ～1976年) 、方法标 准化形成阶段(年) 、不断修订和完善阶段 (1985年至今).目前我国食品卫生微生物检验方法既有国家标准检验方法 ,又有大量行业方法和企业方法。随着食品卫生微生物检 验方法的逐步形成和完善,为保证我国食品卫生微生物检 验的质量,广大的微生物检验工作者进行了不断探索,积累 了不少宝贵经验,逐步形成了一些行之有效的方法。?食品卫生微生物检验室内质量控制工作现状我国检验工作者对影响食品卫生微生物检验质量的因素进 行了深入探讨,涉及到人员、仪器设备、培养基和试剂、 标准菌株、检验环境条件、采样、样品的接收和预处理、 检验结果质量控制等。 对于微生物限量指标检验的质量控制也进行了一定探索, 特别是对于菌落总数测定的质量控制研究比较多,如：影 响定量指标检验结果因素和环节的研究；应用统计学的方 法对检验结果进行质量控制；定量指标检验结果不确定度 的评定,如菌落总数检验结果不确定度的评定。??食品卫生微生物检验室间质量控制工作现状???在我国颁布《食品卫生检验方法微生物学部分GB4789 - 84》后我国 的食品卫生微生物检验逐步走上了标准化的发展轨道。 实验室认可工作在我国逐渐推行,能力验证作为检验实验室技术能力的 有效方法得到广泛开展。中国实验室国家认可委员会(CNAL)近几年 组织了3次食品微生物能力验证活动。1） CCIBLAC T004 - 00 食品 微生物水平测试：出血性大肠埃希菌O157: H7 (定性测试) 、乳清粉 的菌落总数(定量测试)；2） CCIBLAC T014 - 01(APLAC T030):食品 微生物沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、菌落总数、大肠菌群、粪大 肠菌群; 3) CNAL T0159 致病菌检测副溶血性弧菌、菌落总数(注:“ 霍乱弧菌”测试项目因样品运输受限取消)。CCIBLAC为原中国国家 出入境检疫检疫认可委员会, CNAL是由原中国实验室国家认可委员会 (CNACL)和原中国国家出入境检疫检疫认可委员会(CCIBLAC)合并重 新组建的。APLAC为亚太实验室认可合作组织。 有关实验室间质量控制工作的研究情况：各实验室在食品卫生微生物 室间质量控制活动中进行了程序和方法的探索；微生物能力验证样品 均匀性试验的研究； 对于测试项目结果的分析及评价的研究； 对于 参加质控活动的实验室的综合评价的研究。我国食品卫生微生物检验质量控制工作存在的问题???室内质量控制：我国食品卫生微生物检验对一些微生物限量指标的质 量控制有一定研究,但主要局限于菌落总数测定的平板倾注法。在我国 的食品卫生微生物检验定量指标中还有霉菌及酵母计数、大肠菌群检 验、病原菌的平板涂布计数法等,对这些项目质量控制研究很少。 室间质量控制：我国食品卫生微生物检验室间质量控制工作缺乏一个 全国性的机构来实施有效的组织和管理。中国实验室国家认可委员会 虽然也组织了几次食品微生物能力验证活动,但认可委对已获得认可的 实验室是要求其参加验证活动,对未获得认可的实验室是自愿参加,目 前我国尚有许多基层实验室未通过实验室国家认可,认可委组织的能力 验证的覆盖面有限。我国的食品卫生微生物检验需要一个类似卫生部 全国临床检验中心的机构来进行实验室间的质量控制的组织和管理,建 立从中央到地方的实验室质量控制网络。 我国的实验室认可起步较晚,能力验证活动也是近几年的事情, 对于食 品卫生微生物能力验证或质量控制考核有待规范,对于食品微生物检验 领域有高可信度、有规模的微生物能力验证样品,在定量检测项目上的 标准物质还需要进一步研究。验证结果的分析和评价、实验室综合能 力的评价方法有待进一步探讨。展望?“十五”国家重大科技项目“食品安全关键技术”课题《 食品安全检测实验室质量控制规范研究》2005年12月底 通过了课题鉴定,该课题完成了6个食品安全检测实验室质 量控制规范及其实施指南,填补了该领域的国内外空白并 已经列入国家标准制定计划。该研究成果为我国食品安全 检测实验室提供了系统质量控制标准,建立了食品安全检 测实验室能力验证提供者评价体系,完成了有关领域能力 验证关键技术研究,为规范能力验证活动提供了技术保障 。《食品安全检测实验室质量控制规范》其中一个即是《 食品安全微生物学检测实验室质量控制规范》,该规范对 实验室管理要求、技术要求、过程控制要求、质量保证/ 控制、报告检验结果都提出了具体要求,我国的食品卫生 微生物检验质量控制工作必将走上一个快速的规范发展道 路。第二章食品微生物检验条件学习目标：?了解微生物检验室的基本要求，通过学习，能独立建设一般的食品微 生物检验室。 认识和熟悉微生物检验中常用仪器设备（尤其是普通光学显微镜）及 其结构与性能，能正确使用和进行一般的维护。 认识和熟悉微生物检验中常用玻璃器皿，掌握灭菌消毒的技术要求。??第一节微生物检验室微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达 此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。实验室管理制度1．实验室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻璃器皿管理 使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真 执行。 2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非 实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保 养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。 4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报 告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格 执行《菌种保管制度》。 5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品， 离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐 蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。 6．科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报 告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。实验注意事项?每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验目的、原理和方法。初步 熟悉实验操作的主要步骤和环节，对整个实验的安排做到先后有序、有条不 紊和避免差错。 ?非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应 放在不影响实验操作的地方 ?每次实验前须用湿布擦净台面，必要时可用0.1％“新洁尔灭”溶液擦。实 验前要洗手，以减少染菌的概率。 ?微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌污染。 为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点： ?操作时要预防空气对流：在进行微生物实验操作时，要关闭门窗，以 防空气对流。 ?接种时不要走动和讲话：接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞 扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。 ?含菌器具要消毒后清洗：凡用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在 实验后应立即投入5%石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗， 以免污染环境。 ?含培养物的器皿要杀菌后清洗：在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管 等之前，应先煮沸10min或进行加压蒸汽灭菌。 ?要穿干净的白色工作服：微生物学工作者在进行实验操作时应穿上白 色工作服，离开时脱去，并经常洗涤以保持清洁。实验注意事项?凡须进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者 姓名（或组别），放在指定的温箱中进行培养，按时观察 并如实地记录实验结果，按时交实验报告。 实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舔标签、笔尖 或手指等物，以免感染。??? ?节约药品、器材和水、电、煤气。各种仪器应按要求操作，用毕按原样放Z妥当。 实验完毕，立即关闭煤气，整理和擦净台面，离开实验室 之前要用肥皂洗手。值日生负责打扫实验室及进行安全检 查(门窗、水、电及煤气等)实验注意事项????冷静处理意外事故： 打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液洒到桌面或地 上时，应立即以5%石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液覆盖，30min 后擦净。若遇皮肤破伤，可先去除玻璃碎片，再用蒸馏水洗 净后，涂上碘酒或红贡。 菌液污染手部皮肤：先用70%乙醇棉花拭净，再用肥皂水洗净。 如污染了致病菌，应将手浸于2％～3％来苏尔或0.1%新洁尔 灭溶液中，经10～20min后洗净。 菌液吸入口中：应立即吐出，并用大量自来水漱口多次，再 根据该菌的致病程度作进一步处理： ? 非致病菌：用0.1％高锰酸钾溶液漱口。 ? 一般致病菌（葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌等）： 用3％H2O2、0.1％高锰酸钾溶液或0.02％米他芬液漱口。 ? 致病菌：如吸入白喉棒杆菌，在用②法处理后，在注射 1000U白喉抗毒素作紧急预防；若吸入伤寒沙门氏菌、痢疾 志贺氏菌或霍乱弧菌等肠道致病菌，在经②法处理后，可 注射抗生素预防发病。实验注意事项?? ?衣服或易燃品着火：应先断绝火源或电源，搬走易燃 物品(乙醚、汽油等)，再用湿布掩盖灭火，或将身体 靠墙或着地滚动灭火，必要时可用灭火器。 皮肤烫伤：可用5％鞣酸、2％苦味酸（苦味酸氨苯甲 酸丁酯油膏）或2％龙胆紫液涂抹伤口。 化学药品灼伤 ? 强酸、溴、氯、磷等酸性药剂：先用大量清水洗涤， 再用5％NaHCO3或5%NaOH中和。 ? NaOH、金属钠（钾）、强碱性药剂：先用大量清水 洗涤，再用5％硼酸或5％乙酸中和 ? 石炭酸：用95％乙醇洗涤 ? 如遇眼睛灼伤：则应先用大量清水冲洗，再根据化 学品的性质作分别处理，例如，遇碱灼烧可用5％硼 酸洗涤，遇酸灼烧可用5％NaHCO3洗涤，在此基础上 再滴入1～2滴橄榄油或液体石蜡加以润湿即可。检验室建设要求选址与规模 （1）化验室应建设在远离粉尘、噪声、散发异味气体等地 点，电源电压应当相对稳定的地点。根据企业规模和产品 种类，应建设不同要求的化验室。但是，最小建筑面积： 理化检验室不能小于30平方米；微生物检验室（无菌室） 不能小于8平方米。这样有助于仪器设备的合理摆放，便 于操作，便于样品流通和空气流通。 （2）室内应有足够的照明条件。 （3）室内必须配Z干粉或二氧化碳灭火器，以备电器或化 学品燃烧灭火使用。 （4）所有电器插坐均应有牢固的地线装Z，以防止设备带 电，造成操作人员触电事故。有条件的还应在地面铺设绝 缘胶板。其次还应必须有上下水设施、通风橱（在通风橱 内进行对发生出有害气体的分析操作）。?检验室建设要求室内的布局 (1)动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、 色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器 等）。 (2)常温与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高 温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其它一切设备分开， 不然会影响其它设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其它设备， 影响其使用寿命。 (3)化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀 性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析 台的摆放应远离热源设备。 ? 化验室应建立可行的规章制度：化验室人员工作管理制度、标准管理 制度、危险化学试剂的管理制度 、检验过程的管理制度 检测设备检 定管理制度?检验室建设布局图61.办公台 2.文件柜 3.样品柜 4.通风橱 5.实验边台 6，7.无菌台 8.天平台 9.在落地仪器区再加个高温仪器台，放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等第二节微生物实验室主要设备和器具? ? ? ??? ? ??? ? ?无菌室（接种室）或接种箱 恒温箱 电烘箱（干燥箱） 冰箱 高压蒸汽灭菌锅 离心机 接种针 天平 酒精灯 显微镜 常用玻璃器皿 均质器、试管夹，吸管，移液枪，脱脂棉，牛皮纸，棉绳，纱布，剪刀第三节无菌室建设新建无菌室的处理程序?先用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面，再用甲醛加高锰酸钾熏蒸空气。日后要定期熏蒸；? ? ?每两星期用酒精棉球擦拭紫外线灯管；每次使用无菌室前用紫外灯照射30～60分钟；每次使用完无菌室后，要及时用3%的煤酚皂擦洗工作台面 及地面。超净工作台的使用?使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用 消毒剂擦拭消毒。 接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作 区内工作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开 启送风机 工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁 净气流不受干扰 操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照 明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。 最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯， 切断电源。?????超净工作台的使用?每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合 技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工 作台处于最佳状况。 每月进行一次维护检查，并填写维护记录 。 每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使 用记录。 取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘‘、 用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留， 用清洁布擦干；要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表 面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力；设备内外 表面应该光亮整洁，没有污迹。? ??微生物检测作业规范?各培养液配制完成后，杀菌前放入冰箱冷藏保存，但 必须在48小时内对其进行分装杀菌使用。 ?已杀菌未开封的培养液在24小时内可直接使用；已杀 菌未开封超过24小时或者已杀菌但开封而未用完的培养 液都必须重新杀菌后使用。同一培养液反复杀菌不超过 2次。杀菌时间由当班微检员用油笔直接写在瓶体。 ?杀菌锅密闭前，内桶顶部覆盖一层报纸。 ?进入无菌间作业时必须做到： ?缓冲间、无菌间的紫外灯开启时间超过半小时； ?关闭紫外灯后，微检员把作业过程中将用到的所 有物品放在缓冲间，同时在缓冲间更换专用的工作 衣，同时佩戴口罩和卫生帽，然后再将物品转移到 无菌间；微生物检测作业规范?作业时关闭紫外灯、空调、和无菌操作台风机；每次最多做4个样品。 每次均做空白对比（除非有特殊说明）。 ?完成作业后，立即做好相关标识、填写《微生物检验培养登记表》， 然后清理无菌间。清理结束后，开启紫外灯杀菌30分钟。 ?无菌间只允许放Z无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上最多只 允许摆放以下物品：物品 酒精灯 打火机 接种针 消毒面团 洗耳球 数量 1个 1个 1个 1瓶 1个 物品 灭菌营养琼脂 灭菌双料发酵管 灭菌单料发酵管 灭菌平皿 试管架 数量 200ml 6根 12根 10块 2副镊子油笔 试管篓1个1支 2个2ml灭菌吸管10ml灭菌吸管 125ml灭菌烧杯5根3根 2个微生物检测作业规范?微生物培养24小时后，当班微检员仔细观察、如实填 写培养的现象，任何异常情况都必须及时报告；晚班 的微检员可将有异常情况的培养液交接给白班，并保 证其免受污染。 ?口罩、卫生帽每人次使用两天，无菌间缝单日定期拖地、专用的工作衣每周定期清洗，具体人员由班长另行安排。第三章微生物检测基本技术 第一节细菌形态学检验技术? ?细菌形态学检验内容：菌体形态、大小、排列、特殊结构 细菌形态学检查方法：不染色细菌标本检查法和染色细菌标本检 查法不染色细菌标本检查法?不染色的细菌标本的镜检可直接观察到细菌活体的形 态、大小、运动（了解菌是否有鞭毛）?悬滴法和压滴法不染色细菌标本检查法－－悬滴法?? ???制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌于盛有1－2ml无菌水的试管中，制成轻度浑浊的菌悬 液。 涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。 滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用削尖的记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显 微镜观察时，易于寻找菌液的位Z。 盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘合在 一起，然后翻转凹玻片，菌液正好悬在凹槽的中央，再用火柴棒轻压盖玻片使四周边缘闭合， 以防菌液干燥。 镜检：先用低倍镜找到标记，再稍移凹玻片即可找到菌悬滴的边缘，然后将菌液移到视野中 央。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察。镜 检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）不染色细菌标本检查法－－压滴法（水封片法）?制水封片：加1滴菌液于洁净无油的载玻片中央，然后取1滴洁净的盖 玻片，先使其一边接触菌液，再慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生 气泡。若镜检好氧菌时，应在水封片中留1～2个小气泡，然后再观察 气泡四周细菌的运动能力，否则因盖玻片内供氧不足而抑制了细菌的 运动。镜检：先用低倍镜观察，然后再转至高倍镜或油镜下观察，观察的要 求同悬滴法。?不染色细菌标本检查法－－注意事项?结果记录菌名 普通变形杆菌 铜绿假单胞菌 悬滴法或水封片法 细菌的运动方式 判断有、无鞭毛黄色金葡萄球菌? ??注意事项 检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运 动 制水封片时，菌液不可加得太多，因过多的菌液会盖玻片下流动，从 而影响了对细菌正常运动的观察。染色细菌标本检查法－－染料细菌染色用的染料 ? 酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结 合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染 色。（伊红、刚果红） ? 碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细菌一般带负电， 所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。 ? 复合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。 ? 单纯染料：不能与被染物生成盐类 影响染色的因素 ? 细菌的结构：细胞壁的结构、细胞膜的通透性、膜孔的大小 ? 培养基：组成、菌龄、pH等染色细菌标本检查法－－制片方法制片：（制片是染色的关键，如不注意菌体涂布的均匀度，会造成染料的大面积堆 积，而使观察结果不理想） ? 制片：在干净的载波片（平时放在95%酒精中)上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接 种工具进行无菌操作，挑取培养物少许，Z载玻片的水滴中与水混合做成悬液， 并涂成直径约1cm的薄层。若材料为液体培养物或自固体培养物中洗下制备的菌 液，则可直接涂布于载玻片上。涂布要均匀，菌体间少重叠。 ? 干燥：涂布最好在室温下使其干燥，有时为之使之干燥得快些，小心地在酒精 灯火焰高处微微加热。 ? 固定：标本干燥后即进行固定，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快地来回通过 3～4次，共2～3s，并不时以载玻片的加热面触及皮肤，其目的：杀死微生物， 固定细胞结构；保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，防止标本被水洗掉；改变 染料对细胞的通透性，因为死细胞的原生质比活细胞的原生质易于染色。 注意事项： ? 载玻片要洁净无油，否则菌液涂不开，且固定效果不好，水洗时易被水冲掉。 ? 为避免因菌数过多聚成团而不利于观察个体形态，可在载玻片一端加一滴水， 从已涂布的菌液中再取一环于水滴中进行稀释，涂布成薄层。 ? 干燥时，切勿靠火焰太近或加热时间过长，以防标本烤枯而使菌体变形。染色细菌标本检查法－－染色分类??单染色法：用一种染色剂对涂片进行染色。该法简便易行，但仅能显 示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构，适用于微生物的形态观 察。 复染色法：主要的复杂染色法有革兰氏法和抗酸性及特殊染色法。因 为细菌除了具有细胞壁、细胞膜、原生质和核等基本构造外,某些细菌 还具有荚膜、芽孢、鞭毛和异染颗粒等特殊结构，这些结构不能被一 般染色方法着色，必须用特殊的方法才能着色。 负染色法：负染色法是一种特殊的染色方法，是指背景着色而细菌本 身不着色。一般使用酸性染料，如刚果红或水溶性苯胺黑。固定染色 涂片可浸于酸性酒精中，因刚果红经酸性酒精处理后，涂片的背景便 从红色（盐类的颜色）转变为蓝色（即刚果红游离的颜色），这样可 使对比性更为鲜明。 负染色法除用于观察细胞形态外，还可区别死菌与活菌，因死菌可 被酸性染料着色，部分自溶的细菌也能轻度染上酸性染料，而活菌却 不着色。?染色细菌标本检查法－－简单染色方法菌名 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌染色液名称菌体颜色菌体形态（图示）染色细菌标本检查法－－革兰氏染色法阳性菌阴性菌染色细菌标本检查法－－革兰氏染色法注意事项： ? 单一菌落染色后看到红色杆菌和紫色杆菌共存的情况，特别明显既有红色的， 也有紫色的？（脱色时间：受涂片之厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量 多少等因素的影响，难以严格规定。菌龄：选用培养18～24h菌龄的细菌为宜。 若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应） ? 显微镜观察：紫和红好象都是，焦距调的稍近时紫色，调的稍远时红色，两种 情况下形状都看的挺清楚，杆状。关于颜色你们怎么确定的？ （对照：当确证 一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合 图片） ? 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液 被稀释而影响染色效果。 ? 用洗衣粉水煮沸、清洗、沥干备用。 结果记录：菌种 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 细菌未知种 菌体颜色 菌体形态 G+ 或 G-染色细菌标本检查法－－芽孢染色法原理： 细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但是一旦着色又难以脱色。芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下进行。染色完毕，用自来水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水洗 掉，而进入芽孢中的孔雀绿却难以溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染 使菌体和芽孢呈现不同的颜色。方法与步骤? ?制片：将培养24小时的细菌涂片、干燥、固定 染色：将孔雀绿染色液滴加3～5滴于标本上。用试管夹夹住载玻片在火焰上加 热约5min（当染料冒蒸汽时开始计时）。在加热过程中要随时加染色液，切勿 煮沸或使样本干涸。 水洗：待载玻片冷却后，用自来水冲洗 复染：用番茄红染色液染色1min。 水洗、干燥，Z于油镜下观察并绘图说明。? ? ? ?结果染色细菌标本检查法－－芽孢染色法改良方法： ? 制备菌液：加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环的菌苔于试 管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。 ? 加染色液：加5％孔雀绿染色液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染色液与菌液 充分混合。 ? 加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15～20min。 ? 涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，并涂成薄膜。 ? 固定：将玻片通过微火3次。 ? 脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 ? 复染：加沙黄染色液，染2～3min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水吸干。 ? 镜检：用油镜观察 结果纪录菌名 染色法 芽孢和菌体的颜色 图示芽孢的形态、大小和着生位置染色细菌标本检查法－－芽孢染色法注意事项：?供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体内。 巨大芽孢杆菌在37℃条件下培养12～14h效果最佳。 改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规法优越，可 优先使用。 用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次从小试管中 挑取被染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌 体沉于管底，涂片时菌体太少。??染色细菌标本检查法－－鞭毛染色法鞭毛染色方法基本原理雷同，即在染料前先经媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使 鞭毛直径加粗，然后再进行染色。 银染色法： ? 清洗玻片：将玻片插在专用金属架上，再放入洗衣粉过滤液（洗衣粉煮沸后用滤纸过 滤，以除去粗颗粒）中，煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗，晾干。再放浓洗液中 浸泡5～6d。使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入 95％乙醇中脱水。过火去乙醇，立即使用。 ? 配制染色液：A液：鞣酸（丹宁酸）5g，FeCl3 1.5g，蒸馏水100ml。待溶解后，加1％ NaOH溶液1ml和15％甲醛溶液2ml；B液：硝酸银2g溶于蒸馏水100ml中。 在90mlB液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用 其余10mlB液小心滴加至澄清液中，至出现轻雾状为止（此操作非常关键，应格外小 心）。在整个滴加过程中要边滴边加充分摇荡。配好的染色液当日有效，4h内效果最 好。 ? 涂片：用接种环挑取数环菌液于玻片的一端，立即将玻片倾斜，让菌液缓慢地流向另 一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片在空气中自然干燥。 ? 染色：滴加A液（4～6min) →用蒸馏水充分洗净A液 →用B液冲去残水，在用B液于涂 片上，用微火加热至冒烟，维持0.5～1min（加热时应随时补充蒸发掉的染色，不可使 玻片出现干涸区 →用蒸馏水洗，自然干燥。 ? 镜检：用油镜观察，并记录结果。染色细菌标本检查法－－鞭毛染色法Leifson氏染色法： ? 清洗玻片：同银染法 ? 配制染色液：A液：碱性复红1.2g，95％乙醇100ml；B液：鞣酸3g，蒸馏水100ml （如加0.2％苯酚，可长期保存）；c液：NaCl 1.5g，蒸馏水100ml。 染色液分别贮 藏于磨口玻璃瓶中，在室温下较稳定。使用前将上述溶液等体积混合，将混合液贮 藏于封密性良好的瓶中，Z冰箱中可保存数星期。在较高温度下因混合液发生化学 变化而使着色力日益减弱。 ? 菌液的制备及涂片：菌液的制备同银染法→用记号笔在玻片的反面划分3～4个相等 的区域→放1环菌液于每个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一边，并用滤纸 吸去多余的菌液→在空气中自然干燥。 ? 染色：加染色液于第一区，使染料覆盖涂片区。数隔分钟后染料加入第二区，以后 以此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，且节约材料。 在染色过程中要仔细观察，当整个玻片出现铁锈色沉淀和染料表面出现金色膜时， 即用水轻轻地冲洗，一般约染10min。 →在没有倾去染料的情况下，就用自来水轻 轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀→自然干燥。 ? 镜检染色细菌标本检查法－－鞭毛染色法注意事项：? ?银染色法比较容易掌握，但染色液必须每次配制，比较麻烦。 Leifson氏染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，要掌握好染色条件 必须经过一些摸索。其优点是染色液可保存较长时间。 细菌鞭毛极细，很容易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心。菌龄较 老的细菌鞭毛易脱落，所以在染色前应将变形杆菌在新配制的牛肉膏蛋白 胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接几代， 以增强细菌的活动力。最后一代菌种放37℃恒温箱中培养15~18h。然后用 接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1~2ml无菌水的试 管中，使菌液呈轻度浑浊。将该试管放37℃恒温中静Z10min（放Z时间 不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。?染色细菌标本检查法－－荚膜染色法荚膜是细菌在新陈代谢过程中形成的分泌于细胞壁外的黏液状物质。其主要化学成分是多糖、多糖类物质。荚膜的折光率低，与染料的亲和力差， 不易着色。通常采用负染色方法：使菌体和背景着色而荚膜在菌体周围呈 一透明圈。由于荚膜的含水量在90％以上，故染色时一般不用热固定或微 热固定，以免荚膜皱缩变形。染色细菌标本检查法－－荚膜染色法?制片：在载玻片一端加一滴6％葡萄糖液，取少许培养72h的被检样菌与其充分 混合，再滴一滴新配制的黑色素溶液（或墨汁），混匀。左手持载玻片，右手 拿另一光滑的载玻片（推片），将推片一端边缘Z于菌液前方，然后稍后后拉， 当接触菌液后，轻轻地左右移动，使菌液沿推片接触后缘散开，以30。 角迅 速而均匀地将菌液推向玻片另一端，将菌液涂成一薄膜，风干。染色：加番茄红染色液于标本上，30s后，用细水流适当冲洗。 干燥、镜检：背景成黑色，菌体呈红色，荚膜无色 按上述方法，在番茄红之前，用甲醇固定1min亦可； 按上述方法，用石炭酸复红液代替蕃红液，染色2min，结果同上。 Tyler法：主要采用结晶紫冰醋酸染色液染色5~7min。然后用20％CuSO4 水溶液 洗涤，干燥后镜检。结果荚膜呈蓝紫色，细胞暗蓝色。? ?结果与讨论? ? ?第二节培养基制备技术----玻璃器皿的清洗在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、 烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷 干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。 1、新购的玻璃器皿 除去包装沾染的污垢后，先用热肥皂水刷洗，流水冲净，再浸泡于１～２％ 的工业盐酸中数小时，使游离的碱性物质除去，再以流水冲净。对容量较大的器 皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有 盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒Z于洗涤架上将水空干，即可使用。 2、用过的玻璃器皿 凡确无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用后可随时冲洗，吸取过化学试 剂的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。有可能被病原 菌污染的器皿，必须经过适当消毒后，将污垢除去，用皂液洗刷，再用流水冲洗 干净。若用皂液未能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。洗液 的主要成份是重铬酸钾和浓流酸，其作用是将有机物氧化成可溶性物质，以便冲 洗。洗液有很强的腐蚀作用，使用时应特别小心，避免溅到衣服、身体和其他物 品上。培养基制备技术----培养基分类??根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分： １）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知 道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各 种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分， 但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常 用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的 影响。 ２）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学 成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又 生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 ３）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中， 加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培 养基在生产实践和实验室中使用最多。 根据培养基的物理状态来区分： １）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形 物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。 ２）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物 质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 ３）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以 琼脂为例，它的用量在0.2~1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保 藏菌种。培养基制备技术－－培养基的分类?根据培养基的用途来区分：(1)通用培养基：培养异氧细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基；配制适合于厌氧菌 生长的培养基时，通常须在培养基中加入适量的还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨 酸来降低培养基的氧化还原电位，以利于厌氧菌的生长。(2)鉴别培养基：是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂， 从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌落的培养基。(伊红－ 美蓝琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基）(3)选择性培养基：根据某微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培 养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌。（马丁氏培养基、Ashby无氮培养基）?有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。 它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖 和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道 致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。培养基制备技术－－培养基制备的基本方法和注意事项?培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以 防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长; 因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应 进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著 的升高。 培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内:液 体分装至试管1/4左右 为宜；如固体则分装量为管高的1/5；半固体培养基， 则分装至试管的1/2~1/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应不超过容积的一 半为宜；Φ＝9cm的培养皿可倒入15ml培养基。 一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方 法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配 成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定 量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则 应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。???灭菌和消毒??消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体 的方法， 灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物， 使之呈无菌状态。灭菌和消毒－－物理方法?温度 ：利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生 物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所 以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体 等的灭菌。b.干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中， 升温至160°C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。 附：电热恒温干燥箱（俗称“烤箱”）的使用 把待灭菌的物品均匀地放入烤箱中，关上箱门，调节温度至160°C，打开电源，待温度 上升至160°C时计时，维持该温度0.5-1小时。注意：多观察几次温度，防止温度失控。 用量较少的实验室可以做几个铁皮筒，盖子侧面带孔，灭菌时将孔打开，灭菌冷却过后 将孔关闭。可以将吸管每支单独用白纸包裹用脱水粘上（防止纸散开来），装入铁皮筒 灭菌，使用时可以单独拿，避免污染其它吸管。玻璃皿也可以单独用白纸包裹用脱水粘 上，装入铁皮筒灭菌。无菌瓶可以盖上盖子，用用白纸包起盖子，用棉线扎起来，不可 以用尼龙线，因为尼龙线不耐高温，易断。灭菌和消毒－－物理方法湿热灭菌法:在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面 细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿 透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。 a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒 等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养 和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62°C，30分钟既可达到 消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。 b.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全 部营养和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此 法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。 c.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。 若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭 菌的物品加热至100°C，15~30分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入 37°C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三 次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦， 所需时间长。?灭菌和消毒－－物理方法d. 加压蒸汽灭菌法：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量 蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055 公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121°C。在这种情况下，微生物（包 括芽孢）在15~20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等 面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。 在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷 空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。附：高压锅的使用 打开锅盖，取出内锅，观察水量，补充水量至比墩子略高，将需灭菌的物品放入内锅，盖 上盖子，对称旋紧螺栓，关闭放气阀，打开电源，待压力表上指针指向0.05时打开放气阀 放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，待压力表上指针指向0.05时再次打开 放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀；冷气放完后，待压力表上指针指向 0.10时打开放气阀，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，反复放气2-3次，最后拨下电 源，不打开放气阀，让其自然冷却。取物品时一定要将放气阀打开，等到压力表上指针指 向0时方可对称旋松螺栓，打开盖子取出物品。灭菌和消毒－－物理方法?影响灭菌的因素 a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和 病毒在50~65°C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热 性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121°C，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲， 幼龄菌比老龄菌对热更敏感; b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长; c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高 抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对 灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。?灭菌对培养基成分的影响 a.pH值普遍下降;b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2 与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀;c.不少培养基颜色加深; d.体积和浓度有所变化;e.营养成分有时受到破坏。灭菌和消毒－－物理方法?辐射：利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点， 所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：１）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。 ２）应用β射线作食品表面杀菌，γ射线用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因 大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。?过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。 通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上 面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的 液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物 质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给 实验带来一定的麻烦。灭菌和消毒－－化学方法?一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。 能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生长繁 殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格 区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐 剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生 物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄 物和周围环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶 液）、氯化汞、碘酒、酒精等。?第三节微生物的分离、纯化与接种技术?接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种 要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之 分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要 将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀微生物的分离、纯化与接种技术?划线接种： 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动， 就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划 线中就常用此法。Inoculating an agar plate to obtain single colonies划线接种，分离纯化
微生物的分离、纯化与接种技术?斜面接种技术微生物的分离、纯化与接种技术－－细菌的涂布分离技术细菌的涂布分离技术细菌的涂布分离技术稀释倾注平板法微生物的分离、纯化与接种技术－－斜面接种、液体接种法、穿刺接种液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液， 两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采 用移液管接种，同时要求无菌操作。第四节微生物的培养－－微生物培养中的氧气条件?培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵――摇 床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养 或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或 生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条 件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌 氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用 的如葡萄糖――美兰指示剂。??微生物的培养－－微生物培养中的厌氧条件?生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的 干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧 条件。此法简易，但厌氧程度低。 化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用 吸水包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流 向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。??物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体， 以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格 厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。微生物的培养－－微生物培养中的厌氧培养?美兰氧化还原指示剂：0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6％ 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅 速放入厌氧罐中。微生物的培养－－微生物培养中的厌氧培养第五节微生物细胞大小和数量的测定?目的要求：学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下 测定微生物大小的方法；学习使用血球记数板测定微生物 数量的方法。?实验材料：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、细菌染色 片、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、西水 纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯测定微生物的大小?测定的工具：目镜测微尺镜台测微尺测定微生物的大小?目镜测微尺的校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜， 使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺的0点与 镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。 计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻 度每格长10?m，所以可得： 目镜测微尺每格长度（?m）=（镜台测微尺格数×10）/目镜测微尺格数注意：校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒 长度等）进行，而且只能在这特定的情况下才可重复使用。?菌体大小的测定：取下镜台测微尺，将细菌染色标本Z于载物台上，然后在 油镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。测定微生物数量?方法：活菌计数法――平板菌落计数法；总菌计数法――血球计数板或霍瑟 （Peroff Hausser）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。测定微生物数量?? ?本实验用血球计数板计数酵母菌的数量取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室 内不得有气泡。? ?静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘 上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。 计算方法：?酵母菌细胞数/mL=（X1+X2+X3+X4+X5） 5× 25（或16）×10 000× 稀释倍数?注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和右侧线上的菌体计入本格内； 遇到有芽体的酵母时，若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。?计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦 干净，并放回盒内。第六节微生物保藏方法??斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养 长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢 子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞 部位用尼龙或防水包好，放入40C冰箱中保藏。一般每 隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均 采用。 缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。 石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油， 高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线 菌。 石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高 压灭菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸发 掉。微生物保藏方法?砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细 菌）。 1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10％ HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10％HCl浸泡2―4h)。最后倒 去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层的 瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。 2.按 土：砂＝1：4 的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜， 塞上棉塞，160～1700C干热灭菌2h。 3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制成菌悬 液，用无菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌悬液放入每个砂土管中，用接种 环拌匀，并贴上标签，注明菌名。 4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在12h内抽干，尤其是夏 天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。 冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病毒一类的菌种保 藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。第七节细菌生理学检查法－－微生物生化反应生化反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态 和其它方面不易区别的微生物。糖酵解试验 淀粉水解试验 V-P试验 甲基红（Methyl Red）试验 靛基质（Imdole）试验 枸椽酸盐试验： 尿素酶（Urease）试验 三糖铁（TSI）琼脂试验细菌生理学检查法－－糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用 者，或产气或不产气。可用指示剂(溴甲酚紫，pH 5.2以下呈黄色， pH 6.8 以上呈紫色）及发酵管检验。细菌生理学检查法－－淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉 水解后，遇碘不再变蓝色。细菌生理学检查法－－ 乙酰甲基甲醇（V-P）试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合， 脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与 蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。3ml菌液+10-20滴40%NaOH+0.5-1mg肌酸，振荡试管使氧气溶入，37°C保温15分钟细菌生理学检查法－－甲基红（MR）试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中， 由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培 养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。V-P留下的培养液中沿试管壁加入2-3滴甲基红指示剂，培养液上层变成红色为+，黄色-细菌生理学检查法－－靛基质（吲哚）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色 反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红 色化合物。培养液中加入乙醚1-2ml,充分振荡萃取吲哚，静止1-2min,沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂， 显玫瑰红色为+，反之为-。细菌生理学检查法－－柠檬酸盐试验某些细菌能利用柠檬酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为 二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。细菌生理学检查法－－尿素酶（Urease）试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性， 酚红呈粉红色。1、未接种2、尿素酶阳性 3、尿素酶阴性细菌生理学检查法－－三糖铁（TSI）琼脂试验本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑） 。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧 化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部 由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。a. uninoculated b. little change/alkaline/-/c. alkaline/acid/-/+ d. acid/acid/+/+ e. acid/acid/+/-细菌生理学检查法－－沙门氏菌的TSI试验第四章食品卫生细菌学一般检验技术学习目标：? ? ? ?熟悉微生物检验的基本程序和要求； 掌握食品微生物检验中常见检样的制备技术； 熟悉食品微生物检验中细菌总数、大肠菌群数的检验程序；熟悉掌握食品微生物检验中细菌总数、大肠菌群数检测的操作技术，并能获得正确的检验结果，写出规范的检验报告。食品卫生细菌学一般检验技术食品卫生细菌学检验的目的，是要对食品进行细菌卫生评价。这就要求检验人员在求实的精神下，科学地进行被检对象的采样、样 品送检、检样处理、检验以及报告。在整个过程中，不得掺杂检验人员的丝毫主观臆想和工作上的马虎，要有章可依地进行检验和报告。样品的采样→送检→样品的处理→检验与报告第一节食品卫生细菌学检验总则 ----食品微生物检样的采集样品种类 样品可分大样、中样、小样三种。大样是指一整批样品；中样是指从样品各部分 取得的混合样品，定型包装及散装食品均采样及散装食品均采样250g；小样系 指分析用的样品，又称为检样，检样一般为25g。 ? 采样的方法 根据样品，如袋装、瓶装或罐装食品，应采用完整的未开封的样品；检样是冷冻 食品，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱保存），非冷冻 食品需在0～5℃中保存。 （1）液体样品的采样：将样品充分混匀，无菌操作开启包装，用100ml无菌注射 器抽取，放入无菌容器。 （2）半固体样品的采样：无菌操作开启包装，用灭菌勺子从几个部位挖取样品， 放入无菌容器。 （3）固体样品的采样：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位取样，应 兼顾表面和深度，注意样品代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上 切取样品，放入无菌容器。样品是固体粉末，应边取样边混合。?食品微生物检样的采集（4）冷冻食品的采样：大包装小块冷冻食品的采样按小块个体采取；大块冷冻 食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冷冻上锯取样品， 也可以用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。注：固体样品或冷冻食品取样还应注意检样目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品； 若需检验其品质情况，应再取深部样品。（5）生产工序监测采样?车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部 位用100ml无菌注射器抽取。车间台面、用具及加工人员手的卫生监测：用板孔5cm2无菌采样板及5支无菌 擦拭25cm2面积。??车间空气采样：将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别Z于车间的四角和中 部，打开平皿盖5min，然后盖上平板送检。食品微生物检样的采集? ?采样的数量 采样的标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚，如品名、 来源、数量、采样地点、采样人及采样时间（年、月、日） 取样注意事项：??防止交叉污染或二次污染：取样人员的个人卫生控制 ；取样地点的环境控制， 空气净化要达到要求；取样的器皿要求彻底消毒，避免直接与空气接触 ；取 样的操作要规范、迅速（无菌操作） ；减少样品存放的时间（保持样本原有 的状态、易变质的样本要冷藏） 取样要有代表性：取样的数量标准；取样的方法?采样所出的问题食品微生物检验的样品送检采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要 因送检过程而引起微生物的减少或增多。?无菌方法采样后，所装样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境 中的微生物进一步污染； 进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。若路途 遥远，可将不需冷冻的样品，保持在1～5 ℃环境中送检，可采用冰桶等装Z； 若需保持在冷冻状态（如已冰冻的样品），则需将样品保存在泡沫塑料隔热 箱内，箱内可Z干冰，使温度维持在0℃以下，或采用其他冷藏设备； 送检样品不得加入任何防腐剂； 水产品因含水分较多，体内酶的活力较旺盛，易于变质。因此，采样后应在 3h内送检，在送检途中一般都应加冰保存； 对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。 检样标注适当的标记并填写微生物学检验特殊要求的送检申请单。其内容包 括：样品的描述，采样者的姓名，采样的日期、时间、地点，采样时的温度 和湿度等?? ?? ?食品微生物检验的样品处理不同食品的处理方法: 1.液体样品 2.固体或黏性样品 1）一般固体食品 2）冷冻食品 3）粉状或颗粒状样品食品微生物检验的检验与报告?检验：检验样品送到实验室后，立即将样品Z于普通冰箱或低温冰箱中，并进行登记、填写实验序号，按检样检样 要求，积极准备条件进行检验。样品收集后应于36h内检 验； 报告：按样品项目完成各类检验后，检验人员应及时填写 检验报告单，签名后送主管人员签字，加盖单位印章，以 示生效，立即交食品卫生监督人员处理； 实验室必须具有专用冰箱存放样品，对于一般阳性样品，?在发出报告3天（特殊情况可适当延长）方可处理样品；进口食品的阳性样品，需保存6个月，才可处理；而对于 阴性样品可及时处理。第二节食品卫生微生物检验中常见检样的制备? ? ? ? ? ? ? ?肉与肉制品检样的制备 乳与乳制品检样的制备 蛋与蛋制品检样的制备 水产品检样的制备 饮料、冷冻饮品检样的制备调味料检样的制备糖果、糕点和蜜饯检样的制备 酒类检样的制备??方便面（速食米粉）检样的制备罐藏食品检样的制备第三节菌落总数的测定－－测定方法?标准平板培养计数法（活菌计数法）?? ?显微镜直接计数法菌落总数快速检测纸片电阻抗法测定食品中细菌总数菌落总数的测定－－平板菌落计数法 程序被检样品用生理盐水进行无菌稀释，做成 几个适当稀释倍数的悬液 选择2～3个适当稀释度悬液各1ml，加入无菌空培 养皿内，每个稀释度做2～3个培养皿↓每个培养皿中倾注约15ml熔化并冷却到45℃ 左右的营养琼脂 或肉汤琼脂培养基，冷却后，于37℃培养24h菌落计数 报告结果菌落总数的测定－－平板菌落计数法 操作要点? ??将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基Z于45 ℃恒温水浴锅中保温备用。 编号:无菌试管（10-1 、10-2 、10-3 、10-4。。。。。）、无菌培 养皿、空白对照平板 稀释菌液：? ?摇匀平板：平板前后、左右或者以顺时针、逆时针。 倒Z培养菌落总数的测定－－平板菌落计数法 菌落计数报告例 次 1 2 3 4 5 6 7不同稀释度的平均菌落数10-11468 多不可计 多不可计 多不可计 28 0 多不可计10-2174 295 271
30310-320 46 60 511 7 0 18两个稀释度菌落数之比 － 460/295＝1.6 600/271＝2.2 － － － －菌落总平均数及报告方 式（个/ml，或个/g） 1× 104 3 × 104 2 × 104 .1 × 105 280或2.8 × 102 & 1 × 10或& 10 30300或或3.0 × 104菌落总数的测定－－平板菌落计数法 菌落总数记录报告产品名称 生产日期 生产车间 抽样日期 细菌总数 检验依据 培养基 接种 1 营养琼脂培养基 A B 平均数 结果报告数（个/g或ml） 班次 检验日期10-110-2 10-3 10-4 10-5 空白 备注 检验员： 日期： 复核： 日期：菌落总数的测定－－平板菌落计数法 注意事项?检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的， 并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质 。 充气饮料应在无菌条件下进行排气；酸性样品用经过灭菌的20～30％ 碳酸钠溶液调整pH值至中性；高盐样品应用灭菌蒸馏水进行稀释。 在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm； 吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖 端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装 有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀 释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。 为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟 内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。 计数表示方法：CFU /ml或个（国际标准）????菌落总数的测定－－其他菌落总数的测定?平板菌落计数法测定的是在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧或 兼性厌氧的菌落总数。厌氧菌、嗜冷菌、嗜热菌在此条件下不生长， 有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制。 嗜冷菌计数（新鲜鱼贝）操作要点：采样后尽快冷藏检验；稀释液 涂布于TS或CVT琼脂平板上，平板倒Z于冰箱中冷藏培养。 嗜热菌操作要点：采样煮沸5min（杀死细菌繁殖体）； 厌氧菌操作要点：稀释液与45℃硫乙醇酸钠琼脂混合摇匀，倒平板， 在其上封一层3％无菌琼脂。?? ?菌落总数的测定－－菌落总数快速检测纸片菌落总数快速检验纸片可用于各类食品及饮用水中菌落总数的测定，由细菌营养培养基 和酶显色剂等组成。与传统方法相比，省去了配制培养基、消毒和培养器皿的清洗处理 等大量辅助性工作，随时可以开始进行抽样检测，而且操作简便，通过酶显色剂的放大 作用，使菌落提前清晰地显现出来，培养十几小时就开始出现红色菌斑，非常适合于食 品卫生检验部门和食品生产企业使用。 使用方法： 1．取样品25g（或mL）放入含有225mL无菌水的玻璃瓶内，经充分振摇做成1:10的稀 释液，用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌水的试管内，用1mL灭 菌吸管反复吸吹做成1:100的稀释液，以此类推，每次换一支吸管。 2．一般食品选3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如食用纯水和矿泉水等）可 直接用原液检测。将检验纸片水平放台面上，揭开上面的透明薄膜，用灭菌吸管吸取样 品原液或稀释液1mL，均匀加到中央的滤纸片上，然后轻轻将上盖膜放下，静置5分钟。 3．用手指先沿方格区边缘刮一下，防止水外流，然后再在中间轻轻推刮，使水分在纸 片方格区内均匀分布，并将气泡赶走。 4．将加了样的检验纸片每6片叠放在一起，放入自封袋中，平放在37℃培养箱内培养 24-48小时。 5．细菌在纸片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（10-100个）的纸片进行计 数，乘以稀释倍数后即为每克（或毫升）样品中所含的细菌菌落总数。菌落数在100以 内时，按其实有数报告，大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字， 以四舍五入方法计算，后面的0用10的指数来表示。菌落总数的测定－－电阻抗法测定细菌总数原理：供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量管底部装入 电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变化进行检测。阻抗变化的产 生是由于微生物生长过程中的新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、 脂类、蛋白质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸盐、 醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集，增强了培养基的导电性能，从而降低了其阻抗值:M=(R0-RT)/R0×100% ，其中R0表示开始时培养基的阻抗值， RT表示任意时 刻培养基的阻抗值，M表示培养基电阻减少的百分数。 电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位（CFU）的对数 Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。菌落总数的测定－－电阻抗法测定细菌总数优缺点：?常规经典检测方法结果准确可靠，，但却存在繁琐、工作量大，好时过长；电阻抗法叫省力，样品细菌数在4～18小时内出结果。?电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测简便 的多，不需要一系列稀释，只需样品1ml，培养基9ml，测量管 一只。第四节大肠菌群的测定－－基本概念?大肠菌群指一群37℃、24h能发酵乳糖，产酸，产气，需氧和兼性厌氧的革兰 氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评 价食品的卫生质量。 大肠菌群包括大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和 阴沟肠杆菌等。大肠菌群的来源分粪便来源和非粪便来源，在44.5℃仍能生 长的大肠菌群，称为粪大肠菌群，粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，在人和动 物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群对粪 便污染的指示作用更为直接和贴切，主要就是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏 菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使其与粪便污染的相关性受到了影响。 大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但用 途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通 用指标，粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠杆菌用 于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。 大肠菌群表示方法：MPN（ most probable number） /100mL 。???大肠菌群的测定－－乳糖发酵法（国标）??????检验稀释 取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同。 乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释 度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵 管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。置36±1℃温箱内,培养 24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者, 则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。 分离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分 离。然后置36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出, 观察菌落形态,并作 革兰氏染色和证实试验。 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发 酵管,置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰 氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性. 报告 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群 的MPN值。 结果
大肠菌群的测定－－出口食品行业标准?检测方法:推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个??稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是 否产气。 证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB） 肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以 BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌 群的MPN值。 具体操作参见 SN0169-92 《中华人民共和国进出口商品 检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠 杆菌检验方法》粪大肠菌群的测定??检验稀释 44 ℃乳糖发酵试验将接稀释液的乳糖胆盐发酵管，置于（44±0.5）℃水浴中，经 （24 ±2）h培养。 证实试验：将所有产气发酵管，分别转种在伊红美蓝琼脂平板 上，置（36±1）℃培养18～24h，并同时接种蛋白胨水，置 （44±0.5）℃培养24h。在平板上观察典型菌落，并做镜检。 在蛋白胨水内加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。 结果靛基质阳性，平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群 阳性。??大肠菌群的测定－－注意事项? ??1．MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number) 的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀 释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性 管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近 似的数值。 MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同 的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释 度是不同的，而且结果报告单位也不相同。? ??2．初发酵和证实试验： 无论是国家标准的三步法还是行业标准的 两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵 试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证 实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在 37℃分解乳糖产酸产气”。 初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细 菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有 数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率 ，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际 检测工作中，证实试验是必需的。? ?3．产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在 发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小 ），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有 缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产 气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少 者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸 但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻 轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑 可能有气体产生，而应作进一步试验。???4．挑选菌落： 国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝 平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于 大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽 、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群 的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分 离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或 无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。 另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系， 只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时， 很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落 ，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。?????5．抑菌剂： 大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸 钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作 用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。 国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行 业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂， BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌 群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也 产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误 差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格 按照标准方法进行。 6. MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的毫升（克）系 指原样品的毫升（克）数，并非样品稀释后的毫升（克） 数。第五章食品中常见病原微生物检测技术第一节金黄色葡萄球菌的检测－－概 述???葡萄球菌（Staphylococcus)是微球菌科的一个属，在自然界分布极广， 空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和 动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病的腐物寄生菌，也有 一些致病的球菌。 葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。其中 金黄色葡萄球菌(staphy aureus)为致病菌、表皮葡萄球菌偶尔致病 （staphy epidermidis)、腐生葡萄球菌（staphy saprophyticus)一 般为非致病菌。 金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状 排列，直径为0.5~1μ m，无芽孢、无鞭毛、无荚膜。在普通肉汤培养 基上，形成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑的菌落，菌落色素不稳 定，但多数为金黄色。需氧或兼性厌氧；最适生长温度为30～37℃； 最适生长pH为6~7。耐盐性强，能在含7％～15％氯化钠的培养基中生 长。对氯化汞、新霉素、多粘菌素具有很强的抗性，多数产肠毒素的 菌株在血琼脂平板上能形成溶血圈，并能产生血浆凝固酶，这些是鉴 定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。金黄色葡萄球菌流行病学??? ? ? ?金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中 都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告 ，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌 肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒 占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类 中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点： 季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此 外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染 患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说，金黄 色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌 ，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生 了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化 脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。 肠毒素形成条件： 存放温度，在37°C内，温度越高，产毒时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易 生成。金黄色葡萄球菌致病性?金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓 感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症 等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素 和侵袭性酶：a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血 小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破 坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人 体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍 吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d. 脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温 ，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素：金黄色葡萄球菌 能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、 E及F五种血清型。肠毒素可耐受100°C煮沸30分钟而不被破坏。它 引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶 表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。金黄色葡萄球菌的检测?????样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中 均质，制成10-1稀释液。 增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中， 37°C培养24小时。 分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平 板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白 色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板 上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。 染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球 菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.51μm。 血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液 肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次 ，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不 流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。
金黄色葡萄球菌肠毒素的检测?金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有动物试验、 血清学试验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方 法，在此就不一一赘述。第二节沙门氏菌检测－－概述?原理：沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，一 般无荚膜，周生鞭毛（鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌除 外）。兼性厌氧，最适生长温度37℃。在普通显微 镜下和在普通培养基中不能与大肠杆菌进行区分。 但沙门氏菌不发酵乳糖，在肠道菌鉴别培养基上形 成无色透明菌落，而易与大肠杆菌区别。沙门氏菌 有着复杂的抗原构造，一般分为菌体（O）抗原、鞭 毛（H）抗原和毒力（Vi）抗原三种。沙门氏菌属包 括2000个以上血清型，但多数国家从人体、动物和 食品中经常分离到有40～50种血清型。??人沙门氏菌病有四类综合症：沙门氏菌病；伤寒；非伤寒 型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由 除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，通常表现为 轻度，持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。 未接受过治疗的病人致死率可超过10%，而对经过适当医 疗的病人其致死率低于1%，幸存者可变成慢性无症状沙 门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将 微生物传染给其他人。 非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致，能 影响所有器官，有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症 状沙门氏菌携带者。致病性??沙门氏菌胃肠炎，潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹 绞痛、腹