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第1篇第02章 激素测定技术
第二章& 激素测定技术
体内的激素水平是反映内分泌代谢功能状态的直接指标,也是诊断内分泌代谢疾病的重要依据之一。但体液中绝大多数激素的含量很低，用一般化学方法很难检测到。1959年，Yalow等首次用建立的放射免疫分析法（radioimmunoassay,
RIA）测定血浆胰岛素，从此开创了激素测定技术的新纪元。RIA在临床内分泌代谢疾病的诊断中得到了迅速推广和应用，极大地推动了内分泌学等生命科学的发展。
随着RIA的应用，50年代及前期开展的缺乏敏感性和特异性的化学比色法和生物法相继被取代，特别是随着材料科学技术、蛋白质制备技术和单克隆抗体杂交瘤技术的应用和进步，又极大地推动了激素测定技术的迅速发展和更新换代。继RIA后，Males等又于1968年建立了用放射性核素标记抗体的免疫放射分析法（immunoradiometric
assay, IRMA），该法的检测灵敏度比RIA高10~100倍，特异性更强，且方法更简便易行；1970年，Lefkowite等首先报道了ACTH的放射受体分析法（radioreceptor assay,
RRA），进一步拓宽了放射性核素标记技术测定激素的应用范围。但在RIA的发展过程中也暴露了放射性核素对人体有害和污染环境、标记物容易衰变和测量仪器昂贵等缺点。1966年，Nakane等首次建立了用酶取代放射性核素标记抗体与底物显色的方法，标志着酶免疫分析法（enzyme immunoassay, EIA）的诞生；1971年，荷兰学者van Weeman和瑞典学者Engvall等建立了酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），在建立EIA和ELISA的早期，由于受多种因素的影响，其检测灵敏度和准确性不够理想，仅限于对物质的定性和半定量分析，在含量甚微的激素定量测定中不能与RIA或IRMA相媲美。但到80年代后期，酶免疫分析技术取得了突破性进展，相继建立了酶联免疫反应与 “杂交”的酶联免疫荧光分析法（enzyme-linked
immunofluorometric assay, ELIFA）、生物素-亲合素系统（biotin-avidin
system, BAS），与传统的ELISA相结合的BAS-ELISA、酶免疫反应与化学发光检测系统相结合的增强发光酶免疫分析法（enhanced
luminescence enzyme immunoassay, ELEIA）和克隆的酶供体免疫分析法（cloned enzyme donor immunoassay, CEDIA）等多种新型的酶免疫分析技术不断出现。现在酶免疫分析技术已发展为形式各异，各具优点和用途的定位、半定量和超微定量分析技术，与放射性核素标记免疫分析技术（RIA、IRMA和RRA）相比，其最大优点是酶标记物的有效期长（可超过一年）和稳定性好，不同批次试剂盒之间变异小；与放大系统联用时，检测灵敏度明显高于放射性核素标记技术，可达10―19mol/L水平，且无放射性。据估计，原有的绝大部分（80%以上）放射性核素标记免疫分析法的测定项目已被酶免疫分析法等非核素标记免疫分析技术所取代。
随着科学技术的进步，又进一步发展建立了许多新的免疫分析技术，如荧光免疫分析法（fluorescence immunoassay, FIA）、时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA）、化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)、电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence
immunoassay, ECLIA）和免疫多聚酶链反应（immuno-polymerase chain reaction, IPCR）技术等。1983年，Pettersson等首次报告用TRFIA测定HCG，该法解决了FIA存在的自然本底荧光干扰问题，其特异性明显提高，灵敏度可达10―17mol/L，高于放射免疫分析法，且无放射性危害，标记物稳定，检测速度快，经十多年的发展，实现了全自动化测定，精密度更好，可自动检测的激素已达30余种。自70年代中期由Arakawe等首次报道CLIA以来，该法从实验室的稀有技术逐渐过度到临床医学的常规检测技术，在最近十余年获得了快速发展。它是利用免疫反应系统和化学发光系统相结合的产物，检测灵敏度可达10―18mol/L，测试简便快速，已实现全自动化分析，可测的激素项目达几十种之多。ECLIA不同于一般化学发光分析技术，它采用电促发光原理，能产生高效、稳定的连续光源供检测，试验步骤大大简化，反应时间短，测定速度快，检测灵敏度达10―12mol/L，能满足临床的诊断要求，已有几十种激素和各种抗原或抗体的测定实现了商品化。IPCR分析技术是Sano等于1992年首次报道的，它将抗原抗体反应的特异性与PCR强大的扩增能力结合起来，是迄今建立的最敏感的分析技术，可检测到的最低浓度为10―16mol/L（HCG）- 10―19mol/L（TSH），对小牛血清白蛋白（BSA）的检测灵敏度则达到9.6×10―22mol/L。因该方法创建时间短，尚需不断改良，可望在未来新激素的发现和超微量分析技术领域中发挥重要作用。
上述各方法都是以抗原-抗体的免疫反应为基础的激素测定技术。此外，还有基于先分离后分析为特征的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）和毛细管电泳法（capillary
electrophoresis, CE），在激素的测定领域也得到了广泛应用。由于HPLC和CE具有分离效能高（可分离同分异构体物质）、分析速度快、样品用量少（可分析单个细胞内液）、分析精密度和灵敏度高、应用范围广等优点，已成为医学研究和临床诊断的最常用分析技术之一，它们可测定的激素种类已达几十种之多。
回顾激素测定技术的发展历史，不难发现，正是因为激素检测技术的进步，才使许多新激素得以发现，并极大地推动了临床内分泌学研究的深入和内分泌疾病诊治水平的提高。现在激素测定的新技术和新方法不断涌现，但它们均朝着测定灵敏度更高，特异性更强（或更能反映其生物活性），更精密准确，分析仪器自动化和测定快速的方向发展。
第一节& 光谱分析技术
光谱分析技术是基于物质的分子和原子吸收或发射光谱而建立的一类分析方法，也是最基础和应用最广泛的分析技术之一。光谱法主要包括可见光谱法、紫外光谱法、原子吸收光谱法、荧光光谱法、火焰光谱法和（化学、生物）发光光谱法等，其中可见光谱法（比色法）、紫外光谱法和原子吸收光谱法是以物质的分子或原子选择性吸收某些特征光谱为基础的一类方法，常称为吸收光谱法或分光光度法；而荧光光谱法、火焰光谱法和发光光谱法则是以物质的分子或原子受光能或化学能激发后发射光谱为基础的另一类方法，属于发射光谱法范畴。
【紫外-可见光谱法】
光谱是一种电磁波，其波长可用长度单位（nm, 1nm = 10―9m）表示。波长为400~760nm的光谱称为可见光谱（如太阳光和白炽灯光等），即可见到的由红、橙、黄、绿、蓝、青、紫等颜色组成的复合光；波长为200~400nm的光谱称紫外光谱；波长短于200nm的光谱依次分别称为远紫外光谱、X射线和γ射线；波长长于760nm的光谱依次称为红外光谱、远红外光谱、微波和无线电波。
用棱镜或光栅等分光器将复合光分成单色光的现象叫分光，如果让一束可见复合光穿透一装有有色溶液的玻璃杯再经棱镜分光后，其中某些单色光带变暗了，即某些单色光被有色溶液选择性吸收，这种现象称吸收光谱。吸收光谱的产生是由于溶液中物质的分子或原子受入射光照射时，其电子从基态跃迁至较高能级并吸收入射光的辐射能所致。吸收光谱也可发生在其他非可见光（紫外光或红外光等）。不同物质的分子和原子具有吸收不同光谱的特性，因此，可以利用物质的光谱特性和强度研究物质的组成，测定其含量。
一、基本原理
紫外-可见光谱法属于吸收光谱法范畴，其理论基础是Lambert-Beer的光吸收定律[1~4]，即某一波长的光穿过一匀质透明溶液时（图1-2-1），其中一部分被吸收，另一部分被散射和反射，透过光的强度（I）与溶液的液层厚度（b）、溶液的浓度（C）和入射光的强度（I0）有关。当I0一定时，b和C越大，则I越小；反之，当b和C一定时，I0越强则I也越强。这里I0和b可以是恒定的常数，则C与I在一定条件下成简单的反比关系，即溶液的浓度（C）越大，透过光的强度（I）越小；换言之，溶液的浓度越大，吸收光的强度越大，透过光的强度就越小。溶液吸收光的强度常用吸光度（absorbance, A）表示，当条件一定时，A与上述各因素之间的关系可用A = log I0/I = abC表示（式中a为吸光系数，是与入射光波长和溶液性质有关的常数），这就是Lambert-Beer的光吸收定律，即溶液对入射光的吸收程度（A）与溶液的液层厚度和溶液的浓度的乘积成正比。当a和b为常数项时，在一定条件下，A仅与C成正比关系，通过测定溶液的A与参考品比较可求得待测物质的浓度。
溶液中物质的吸光系数（a）是吸收光谱的一个重要参数，它与物质的测定灵敏度密切相关，不同的物质具有不同的a。a是指溶液的液层厚度为1cm和物质的浓度为1mol/L时的吸光度，又称摩尔吸光系数（ε）。物质的ε越大，表示其对某波长（最大吸收波长）的光的吸收能力越强，即被检测的灵敏度就越高。如铁离子与硫氰酸盐的结合物ε为7000，而与亚铁嗪的结合物ε为27900，后者约是前者的4倍，也就是说后者的测定灵敏度比前者高3倍。了解待测物质分子的吸光系数对提高分析灵敏度至关重要。未知分子量的物质也可用百分浓度代替摩尔浓度，求出其百分吸光系数，同样可反映物质对光的吸收特性。
二、方法分类与应用
利用光吸收定律而设计的光谱分析法又称光度法。光度法有比色法和分光光度法两种，其基本原理相同，不同的是比色法采用滤光片获取单色光，而分光光度法是采用棱镜或光栅等分光器获得单色光，但分光器所得单色光的纯度远高于滤光片。比色法又分目视比色法和光电比色法，但因其分析误差较大，已逐渐被淘汰。
分光光度法分可见光分光光度法和紫外光分光光度法，前者是指利用可见光波长范围内（400~760nm）的某一波长的光作光源的分析方法，多用于测量溶液中的有色化合物，如尿中的雌二醇、雌三醇、孕二醇、皮质醇、肾上腺素和去甲肾上腺素的代谢产物香草基扁桃酸（VMA）、17-酮类固醇、17-羟皮质类固醇等的化学比色测定法就属于可见光分光光度法；后者是指用紫外光波长区域内（200~400nm）某一波长的光作光源的分析方法，可对具有π-π或P-π共轭结构的化合物进行直接检测，待测物质不需显色，样品不被破坏，该法常用于检测核酸、芳香氨基酸及芳杂环类化合物，如在350nm波长下测定尿液间甲肾上腺素（TMN）等。该技术还被广泛用作高效液相色谱、高效毛细管电泳和流动注射分析的检测器，其样品用量少（数μl），检测灵敏度高（10―7~10―12g）。依测定目的不同，分光光度法在测定单组分物质时，还可分吸收系数法和差示分光光度法；测定多组分混合物时，有解联立方程法、双波长法、等吸收点法和导数光谱法等。随着技术的进步，当紫外光分光光度法用二极管阵列取代光电倍增管时，收集的信号经计算机处理，可得到待测组分吸收峰的三维图像。
【原子吸收光谱法】
原子吸收光谱法（atomic absorption
spectrometry, AAS）又称原子吸收分光光度法，它是基于物质所产生的原子蒸气对特定光谱线的吸收作用来进行定量分析的一种方法。这种方法在仪器结构及操作上与分光光度法很相似。原子吸收光谱与原子发射光谱的产生是互相联系的相反过程，每一种元素的原子不仅可以发射一系列特征的光谱线，而且也可以吸收与发射线波长相同的特征谱线。当光源发射的某一特征波长的光通过原子蒸气时，原子中的外层电子将选择性地吸收其同种元素所发射的特征谱线，使入射光的强度减弱。在此过程中，原子蒸气对入射光吸收的程度符合比尔定律[2，5]，即入射光的强度（I0）、入射光所通过原子蒸气的厚度（L）、被原子蒸气吸收后透过光强度（I）与吸光度（A）和试样待测元素浓度（C）之间的关系式为：A = log I0/I
= K·L·C，式中K为常数，在同等条件下L也为常数，则A仅与C有关。A = K·C，即元素的吸光度与元素的浓度成正比关系。
原子吸收光谱仪主要由光源、原子化器、单色器和检测系统（光电倍增管、信号放大器和显示器）组成，其工作原理见图<span lang="EN-US" style="color:#FF-2。光源为空心阴极灯，采用短脉冲电源提供电子，使惰性气体电离成阳离子，再强烈轰击镀有待测金属元素的阴极表面，使其原子发生溅射，并受到高速电子及离子流的撞击而被激发和发射出待测金属元素吸收的特征谱线。原子化器通常用石墨炉或氧化亚氮-乙炔火焰等提供高温，使试样中的待测原子蒸发成原子化蒸气，吸收来自光源发出的特征谱线。该法对大部分金属元素的检测灵敏度可达10―10~10―14g；元素之间的干扰小，测定的选择性好；测量速度快，仪器操作简便。由于AAS具有上述优点，而被广泛应用于众多行业的许多研究领域，在临床和实验室常被用于测定人体内含有的铁、铜、锌、锰、钴、铬、镁、钠、钙、硒、铅等微量金属元素[6~14]。AAS的主要缺点是不能同时进行多元素分析，每分析一种元素，必须用该元素的空心阴极灯作光源。
【荧光光谱法】
荧光光谱法（spectrofluorometry, SFM）[2~5]也称荧光光度法，它与紫外-可见光谱法或原子吸收光谱法的本质区别是，SFM是测量待测物质发射光谱的强度，而前者均是测量待测物质的分子或原子吸收光谱的强度。荧光的产生是多原子分子吸收光量子时，电子根据量子力学的选择原则，从基态的最低振动能级跃迁到高能电子态，然后分子又通过无辐射过程驰豫到一种激发态的最低振动能级，并在回到基态时以发射光子的形式释放能量，通常把这种发射光子称为荧光。由于发射前后的振动驰豫，荧光发射的能量总是低于所吸收的能量，因此溶液中溶质分子的荧光光谱与吸收光谱相比总出现在较长波长区。激发用的辐射光常采用紫外光或激光。SFM测定的基本原理是待测物质受激发光激发后发射的荧光强度（F）、荧光效率（Φ）、激发光强度（I0）、摩尔吸光系数（ε）、溶液中荧光物质的浓度（C）、溶液厚度（L）和仪器常数（K）之间存在下列关系：F = KΦI0εC L。条件一定下，式中的K、Φ、I0、ε和L均可以是常数，则F与C在一定浓度范围内成正比关系。
一种物质受能量激发后，能否产生荧光是由其本身的分子结构决定的，只有共轭体系的以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物的分子才能在从激发态返回基态时发射荧光。其发射荧光的强度受溶液的pH值、实验温度、溶剂种类、光分解作用、荧光猝灭剂和自吸收等因素的影响。如苯酚在酸性溶液中以分子形式存在，可发生荧光；在碱性溶液中离解成苯酚阴离子，就不显示荧光。如荧光色素罗丹明B在甲醇溶剂中的荧光效率为0.97，而在水溶液中仅为0.25。又如一般物质的荧光强度随温度下降而增加，因为温度下降后，溶液的粘度增加，荧光物质的分子与溶剂的分子碰撞随之减弱，致荧光效率和荧光强度增加；温度升高时，荧光强度下降甚至消失，称为温度猝灭。所以，精密的荧光分析必须在严格控制影响因素的前提下进行。
SFM的检测灵敏度通常比可见光光谱法和紫外光谱法高2~3个数量级（可达pg级），因而在氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物和酶类等的分析中得到广泛应用，如定性或定量测定尿中的儿茶酚胺（多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素）等。SFM还被用作高效液相色谱法（HPLC）、高效毛细管电泳法（HPCE）和流动注射分析法（FIA）等的检测器，其检测灵敏度可达10―15mol；用激光诱导（激发）时，检测灵敏度会更高。大多数氨基酸、生物胺、甾体、生物碱、脂肪酸等本身都不含发射荧光的分子结构或基团，必须与荧光衍生化试剂反应，连接上能产生荧光的基团后才能用SFM分析。
SFM的主要缺点是影响因素多，影响程度高，但只要严格控制条件和排除影响因素，仍能做到精密测量。
【火焰光谱法】
火焰光谱法（flame photometry，FPM）[1，2]又称火焰分光光度法，是用火焰作为激发光源的一种发射光谱法。其基本原理是用高温火焰将样品中待测元素的原子激发成激发态，当它们从激发态返回到基态时，以发射光谱的形式释放出所吸收的能量，火焰分光光度计的结构和工作原理见图<span lang="EN-US" style="color:#FF-3。由于不同元素的原子或分子具有不同的能量状态，因此，它们发射的光谱线波长也具有各自的特征。如钾发射的光谱波长为766.5nm，钙为422.7nm等。该法常用空气-丙烷（煤气）或空气-乙炔作燃烧气，其火焰温度分别约为1840℃和2300℃，能量较低，可激发的元素仅限于碱金属和碱土金属。待测元素发射谱线的强度（I）与该元素浓度（C）之间的关系可用I = a·Cb公式表示，式中a是同试样的组成与蒸发、激发过程有关的一个参数，在同等条件下与参考品比较，a又是一个常数；b为自吸收系数，在低浓度时，元素的自吸收可忽略不计，即b = 1。则公式I = a·Cb可改写成I = a·C。这样，待测元素发射谱线的强度与该元素的浓度即成简单的正比关系。
火焰光谱法常用于测定K、Na、Ca、Mg、Li、Sr等元素[15~19]。由于各元素发射的光谱相互存在不同程度的干扰，其测定的灵敏度受到限制（10―4~10―6mol/L）。
【发光光谱法】
发光光谱法（luminescent spectrum, LS）又称发光分析法，是利用发光现象研究而建立的一种分析技术。化学发光是指物质伴随化学反应过程所产生的光的发射现象，而生物发光是指在生物体内由蛋白质或酶参加反应引起的发光，如荧火虫、水母和某些细菌的发光现象。LS以其灵敏度高、分析快速、简便，而在生物学和医学研究领域得到广泛应用。发光分析法主要包括化学发光分析法和生物发光分析法两种。
一、化学发光法（CLA）
某些物质在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物的分子激发到电子激发态，当分子从电子激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级时，多余的能量以光子（光谱）的形式发射出来，其发射的光谱强度与参加反应的物质浓度在一定条件下成正比；与参比物比较后，可求得待测物的浓度[2，5，20]。
化学发光有直接化学发光和间接化学发光或敏化化学发光之分。在化学反应中能释放足够的自由能而把一种反应物的分子激发到激发态，若被激发的是反应产物，则叫直接化学发光，可用A + B→C*→h·υ+ C表示。式中A、B分别为参加反应的A物质和B物质；C*为处于激发态的反应物；C为发射光子（h·υ）后返回基态的反应物。当反应释放的能量传递到另一个未参加反应的D物质分子时，使其激发到电子激发态，并产生发光现象，则称间接化学发光，反应过程式为：A + B + D→C + D*→C + h·υ+
CLA与荧光光谱法（SFM）的区别是物质的分子在形成激发态所受的激发能不同，后者是吸收了光能而发射的光谱，而前者是吸收了化学能而发射的光谱。因此，化学发光的前提是反应必须提供足够的激发能，通常只有那些焓变（?H）介于170~300kJ/mol之间的快速放能（如大多数氧化-还原）反应，才能在可见光谱范围内观察到化学发光现象。
化学发光技术常用于激素、葡萄糖、胆固醇、L-氨基酸及其氧化酶、次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶等的测定[21~25]以及细胞的代谢与功能研究。常用的化学发光剂有鲁米诺（luminol）、洛粉碱（lophine）、光泽精（lucigenin）和草酸盐类等。
二、生物发光法（bioluminescence assay，BLA）
生物发光是发生在生物体内的一种化学发光，其基本原理与化学发光类似[2，10]。生物发光法有荧光素-荧光素酶发光系统和细菌发光系统，在前者，当反应体系中同时存在荧光素（LH2）、荧光素酶（E）、ATP和Mg2+时，先形成E-LH2-AMP（单磷酸腺苷）复合物，然后在氧的参与下，被氧化脱羧产生激发态氧化型LH2，当其从激发态回到基态时，以发射光谱的形式释放出多余的能量。细菌发光系统是在细菌荧光素酶的催化下，需要黄素单核苷酸（FMN）、氧和直链脂肪醛（RCHO）参与的一个复杂的反应过程，其发射的光谱（420~670nm）均在可见光波长范围内。
生物发光技术在临床生物化学和微生物学领域得到广泛应用，如测定体液或血液中的抗生素和维生素浓度，检测血小板功能和细胞β2-肾上腺素能受体[26]，测定细菌的生长和细菌的药敏试验等。
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第二节& 放射性核素标记免疫分析技术
放射性核素标记免疫分析技术主要指放射免疫分析（radioimmunoassay,
RIA）和免疫放射分析（immunoradiometric
assay, IRMA）技术。该技术已成为分析微量和超微量生物活性物质的有效技术手段。1959年，Yalow和Berson在研究胰岛素代谢时，发现标记131I的胰岛素能与胰岛素抗体发生特异性结合，而且标记的胰岛素和抗体的结合量与血液中的内源性胰岛素含量有关，即内源性胰岛素含量越高，标记胰岛素与其抗体的结合量就越少，内源性胰岛素和标记胰岛素与胰岛素抗体之间存在竞争性结合关系。基于这一发现，他们首先建立了竞争性RIA法测定胰岛素，并因此荣获1977年度诺贝尔生理医学奖。
随着抗体制备和纯化技术的发展， Miles和Hales于1968年应用放射性核素标记抗体建立了非竞争性IRMA法。由于该法利用标记抗体作示踪剂，在反应体系中加入过量的抗体，使其检测灵敏度比RIA法明显提高，标准曲线的测量线性范围更广，优于RIA法。此后，Addison等又相继建立了双位点（夹心）IRMA法。
随着科学技术的突飞猛进，抗体制备经历了非抗原或半抗原与载体蛋白连接成完全抗原、用杂交瘤技术获得单克隆抗体、用基因工程获得抗原等过程，使RIA和IRMA技术的应用领域不断扩大。理论上认为，只要能获得纯品的具有生物活性的物质均可用相应的RIA或IRMA法进行分析。随着放射性核素标记技术和反应体系分离技术的不断改进及亲和素-生物素系统放大技术在RIA和IRMA中的应用，RIA和IRMA的检测灵敏度、分析精密度和特异性进一步提高，分析速度更快，操作更简便。
【放射免疫分析】
放射免疫分析（RIA）[1~8]是体外放射分析技术中建立最早和应用最广的一类技术，它与放射受体分析和竞争性蛋白结合分析都属于竞争性体外放射分析技术，都基于抗原抗体的竞争性抑制反应原理，只是配体和结合剂的种类不同而已。
一、RIA的基本原理
RIA的基本原理是放射性核素标记抗原和非标记抗原（待测成分）同时与其限量的抗体进行竞争性结合反应，反应式如下：
+ Ab&&&& Ag*·Ab + Ag*
&&&&&& &&&&&& &&&&&&
&&Ag·Ab + Ag
式中Ag*为放射性核素标记抗原；Ag为非标记抗原（待测组分）；Ab为限量抗体；Ag*·Ab为标记抗原与抗体形成的复合物；Ag·Ab为非标记抗原与抗体形成的复合物。在反应体系中，当Ag*和Ab的量一定时，二者结合形成免疫复合物的量受Ag含量的竞争性抑制。由于Ag*和Ag同Ab具有相同的亲和力，且Ag*和Ag的分子总数超过Ab所拥有的结合位点数，Ag*·Ab复合物的形成将与Ag量的增减呈函数关系（图1-2-4）。当反应达到平衡后，将游离抗原（Ag*和Ag）与形成的免疫复合物（Ag*·Ab和Ag·Ab）分离，并分别测定其放射性强度，游离部分的放射活性（F）与免疫复合物的放射活性（B）即可分别反映Ag*和Ag*·Ab的量。同理，Ag的量也可从反应体系中的F%或B%或B/F的变化中推算出来。
在实际工作中，将已知不同浓度的标准抗原分别与一定量的标记抗原混合，再与一定量的抗体反应，当反应达到平衡后，分离B与F并分别测定其放射活性，求得标记抗原-抗体复合物的结合率。以已知标准抗原的浓度为横坐标，标记抗原-抗体复合物的结合率为纵坐标，绘制剂量反应曲线（或称校正曲线，图1-2-5）。这样，通过待测样品在同一实验条件下测得的放射性或结合率，即可由此校正曲线推算出待测抗原的浓度。
二、抗原和放射性核素的标记方法
（一）抗原 &&&
用于RIA的抗原或半抗原必须纯度高，否则所含杂质也可能同时被标记上放射性核素，影响RIA反应的特异性，降低检测灵敏度。对于天然抗原（大于5000Da的多肽物质），须选用适当的材料，应用盐析、层析、电泳、离心或结晶等生物化学方法，在保存抗原免疫活性的前提下，将其分离纯化。对半抗原（小于5000 Da的肽类等），通常用化学方法将其共价连接到载体蛋白上。常见的半抗原主要为小分子肽类、类固醇化合物、各种降解产物的片段、药物及其他小分子活性物质。几乎任何蛋白质都可用作半抗原的载体，甚至包括同源的血浆蛋白。目前最常用的有牛血清白蛋白、卵清白蛋白和甲状腺球蛋白等。半抗原与载体蛋白偶联的方法很多，常用的有戊二醛法、碳二亚胺法、活泼酯法等。方法的选用原则是反应条件不致改变半抗原的结构，不使载体蛋白变性，对抗原决定簇的空间不造成影响。
（二）放射性核素 &&&
用于RIA标记抗原的放射性核素有125I、131I、3H和14C等，其中最常用的为放射性碘，因它的化学性质活泼，用较简便的方法即可标记成功；容易获得高比活的放射性标记物，检测灵敏度较高；衰变时释放的γ射线可用一般晶体闪烁计数仪直接测量，方法简便。而3H和14C的标记方法较复杂，释放的β射线需较昂贵的液体闪烁计数仪测量，难以在一般实验室推广应用，两者的半衰期（14C为5730年和3H为12.3年）时间长，放射性废弃物处理困难。与131I比较，125I的放射性核素丰度高（＞95%），半衰期较长（60天），稳定性较好，试剂盒的保存时间相对较久。而131I的核素丰度（20%）、半衰期（8.04天）和稳定性均不如前者，但其释放的γ射线能量较高，在放射自显影技术中显影时间短，图像清晰。
（三）标记方法 &&&
以125I标记抗原为例，有氯胺T法、乳酸过氧化物酶（或双酶）法和氯甘脲法。标记物碘原子可与被标记的抗原分子所含有的酪氨酸残基或组氨酸残基等基团结合，一般蛋白质和多肽类完全抗原的分子结构中均含有上述基团，可直接标记。低分子量的类固醇激素、某些蛋白质的降解片段和药物不含上述基团时，必须在其分子结构上偶联上述某种基团后，方能进行标记。
1. 氯胺T法&
& 1963年，由Greenwood等首先报道，其标记原理是氯胺T系氯代酰胺类氧化剂，在水溶液中易分解并形成次氯酸，将125I―氧化成放射性单质碘（125I2），然后取代抗原分子中酪氨酸残基苯环上的氢原子，或与组氨酸残基的咪唑环共价连接，使蛋白质或多肽发生碘化反应而成为标记有125I的抗原。
2. 乳酸过氧化物酶（LPO）法&&&
由Marchalonis等于1969年建立，其标记原理是LPO与H2O2先形成络合物，并将125I―氧化成125I2，然后在LPO催化下，使125I2离子活化而取代肽链中酪氨酸残基苯环上的氢原子。其反应式为：
&& 如果在反应体系中加入葡萄糖氧化酶（GOD）和葡萄糖，GOD在氧化其底物时可不断产生微量H2O2作为LPO的底物，以减少H2O2浓度过大对被标记物的损伤，故又称双酶标记法。该法的不足之处是在标记体系中引入了另外的蛋白质（LPO和/或GOD），LPO和GOD本身亦可能发生碘化反应。
3. 氯甘脲（Iodogen）法&&& 系Fraker等于1978年首先报告。氯甘脲的化学名为1,3,4,6-四氯-3α,6α-双苯基乙二醇脲，是一种不溶于水的固相氧化剂，该法标记原理类似于氯胺T法，Iodogen能将125I―氧化成125I2，125I2再与蛋白质或多肽分子中酪氨酸残基上羟基邻位的氢原子发生置换反应而标记到抗原上。该法的优点是标记率高，可获得高比活的标记化合物；标记时对抗原的损伤程度最轻，对肽类被标记物无聚合作用；标记反应时间长（一般为2~20分钟），易于控制，标记反应产物主要为单碘标记物。该法在一定程度上克服了其他标记方法的缺点。
对半抗原等小分子物质也可用直接或间接碘标记法标记。直接法是先在甾体激素等半抗原分子上连接一个芳香族胺（组氨酸甲酯或酪氨酸甲酯），然后选用上述任一标记方法将125I标记到半抗原分子连接的结合基团上。间接法是先用一标记方法（如氯胺T法）将125I标记在酪氨酸或酪胺、组氨酸或组胺等衍生物上，经纯化后再将其与类固醇进行衍生反应，组胺的氨基与类固醇衍生物的羧基将相互连接成标记抗原。此外，酪氨酸或组氨酸衍生物经碘化作用后能制备出反应灵敏的标记物，与任何蛋白质或含氨基的半抗原均可连接。
（四）标记产物的纯化 &&&标记后的产物必须除去游离的放射性核素（125I等）和标记时反应体系中的其他物质。通常根据被标记物相对分子量的大小，选用孔径适合的葡聚糖凝胶（如Sephadex G-50等）柱进行层析分离纯化。
【免疫放射分析】
免疫放射分析（IRMA）[1~8]属非竞争性抗原抗体免疫反应分析法，它有别于RIA的根本点是用过量的标记抗体与样品中待测成分（抗原或半抗原）充分结合，而RIA是利用过量的抗原（标记抗原和待测抗原）同时竞争性结合限量的抗体。因此，在IRMA反应体系中，标记抗体与待测抗原的结合很少受抗体亲和常数的影响，反应在较短时间（2~3h）内就可达到化学平衡状态，即使单克隆抗体的亲和力较低，也能满足试验要求。同时，一个抗原分子也可以结合多个标记的抗体分子，使IRMA的分析灵敏度比RIA高10~100倍。
一、IRMA法的基本原理
在待测样品中加入过量的标记抗体（Ab*）与待测抗原（Ag）进行非竞争性结合反应，反应式如下：
&&&& Ab*(过量) + Ag &&&&Ab*·Ag + Ab*
待反应达到平衡后再加入固相抗原免疫吸附剂与反应体系中过剩的标记抗体结合，或加入另一个未标记单克隆抗体与Ab*·Ag复合物结合，离心分离测定上清液或沉淀中的Ab*·Ag复合物的放射性强度，其放射性强度与待测抗原含量有关。若以抗原抗体复合物的结合率（B%）为纵坐标和标准抗原的浓度或浓度的对数为横坐标作图，则呈现随抗原浓度增加而上升的校正曲线（图1-2-6），从该曲线可求得待测抗原的含量。由于该方法为非竞争反应体系，因而在待测物浓度较低时，也不会出现或者形成标记复合物或非标记复合物。所以一个可靠的IRMA系统，其检测灵敏度明显高于RIA。
但IRMA的不足之处是要分离游离抗体和复合物，两者都是大分子，一般分离方法难以奏效，目前主要靠用单克隆抗体作分离剂。也就是说，建立一个IRMA系统至少要用两个抗体，一个起测定作用，另一个起分离作用。因此，待测抗原的每个分子至少要含有两个抗原决定簇。这样，IRMA又不适用于测定某些分子量较小的半抗原。
二、IRMA法的分类
1968年,Miles等首次建立了单位点结合的胰岛素IRMA法，即将待测抗原与过量标记抗体结合形成复合物，游离过剩的标记抗体，用固相抗原吸附剂吸附并离心除去之，测定上清液的放射性强度，但这种直接IRMA法的应用范围受到限制。此后，Hales等又建立了双抗体夹心IRMA法，该法采用固相抗体作分离剂，待测抗原的分子必须含有多个抗原决定簇，其中一个结合固相抗体而另一个结合标记抗体，非结合标记抗体可离心弃去，测定固相复合物的放射性。随着单克隆抗体制备技术和生物素-亲和素放大系统的应用以及固相分离技术的进步，不但IRMA法的检测灵敏度和精密度不断提高，而且方法的种类逐渐增多。按实验所用抗体、固相材料及分离剂等的不同，可将IRMA法分为以下几种类型。
（一）双抗体夹心法 &&&可用下列反应式表示：
&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&& SP·Ab1(过量) + Ag
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&& &↓
&&&&&&&&&&&&& SP·Ab1·Ag
&&&&&&&&&&&&
SP·Ab1·Ag·Ab2* + Ab2*
反应体系中的过量固相抗体（SP·Ab1）先与待测抗原（Ag）结合成复合物（SP·Ab1·Ag），再加入过量的标记第二抗体（Ab2*），与SP·Ab1·Ag形成SP·Ab1·Ag·Ab2*复合物，离心弃去上清液（游离的Ab2*），测定固相复合物的放射性。
（二）标记第三抗体法& &&其反应表达式为：
&&&&&&&&&&&&& SP·Ab1 + Ag + Ab2
&&&&&&&&&&&&& SP·Ab1·Ag·Ab2
&&&&&&&&&&&&
SP·Ab1·Ag·Ab2·Ab3* + Ab3*
反应体系中各种抗体分子都是过量的。该法类似于双抗体夹心法，但标记的第三抗体（Ab3*）为抗Ab2的抗体。这一设计可省去标记其他抗体的步骤，此标记抗体可作为通用示踪剂。例如用125I标记了兔抗鼠或羊抗鼠的抗体（Ab3*），则所有应用非固相鼠抗体作为Ab2的方法，均可用Ab3*作为示踪剂。
（三）双标记抗体法 &&&利用待测抗原分子有多个（3个以上）决定簇的条件，在抗体制备时选择3个以上单克隆抗体（McAb），其中一个结合在固相上，另两个分别标记同一种放射性核素。反应体系中待测抗原分子的一个决定簇与固相抗体相连，另两个各结合一个标记单克隆抗体。这样，复合物的放射性比活成倍增加，有利于提高检测灵敏度和精密度。可用下列反应式表示：
&&&&&& SP·Ab1 + Ag
&&&&&& &&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&& SP·Ab1·Ag
&&&&&&&&&&&&& &Ab2*
↓ Ab3*&&&
&& &&SP·Ab1·Ag&&&& &&& + Ab2*
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &
&&& &&&Ab3*
（四）配体抗体桥式法& &&将一个与待测抗原无关的特异性配体（L）包被于试管作为固相（SP·L），加入待测抗原（Ag）及其标记抗体（Ab1*）和连接配体的第二抗体（Ab2·L），待形成Ab1*·Ag ·Ab2·L复合物后，再加入抗L的第三抗体（Ab3），Ab3在反应体系中起连接桥的作用，使之形成更大分子的复合物，便于分离。反应式如下：
&&&&&&&&&&&&& SP·L + Ag + Ab1* +
&&&&&&&&&&&&&
&&&&&& SP·L + Ab1*·Ag·Ab2·L + Ab1*
&&&&&&&&&&&&&
↓Ab3(抗L)
SP·L·Ab3·L·Ab2·Ag·Ab1* + Ab1*
（五）生物素-亲和素法& , 1986年，Odell等首次将生物素-亲和素系统（biotin-avidin system, BAS）引入IRMA法测定促甲状腺素，并获得成功。此法的最大优点是BAS具有很强的亲和力及最终扩大结合标记亲和素的能力，其亲和常数（KA）值达1015L/mol，是抗原抗体反应的10~100万倍，使其稳定性和方法的检测灵敏度与精密度大大提高。它的基本原理是先将固相抗体（SP·Ab1）与待测抗原（Ag）和生物素化抗体（B·Ab2·B）连接成中间复合物，再加入标记亲和素（A*）与生物素相连接并形成最终复合物。一个生物素化的抗体分子连接了十几个生物素分子，而标记亲和素又有4个相同亚基都可与生物素分子结合。因此，其终产物是结合相对牢固和放射性强度倍增的大分子复合物。其反应式如下：
&&&&&& &&&&&&&&&&&&& SP·Ab1 + Ag + B·Ab2·B
&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&& &&&&& &&&&&&&&&&&& B
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& SP·Ab1·Ag·Ab2
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&& A*&&&&&&&&&&&&&&&& B
&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &
&&& &&&&&&&&B·A*
&&&&&&&&&&&&& SP·Ab1·Ag·Ab2 &&&&&&&&&& &&&&+
&&&&&&&&&&&&& &
&&& &&&&&&&&B·A*
（六）生物素-亲和素分离剂法& &&反应体系中的待测抗原分子具有多个决定簇，一些决定簇与生物素化的单克隆抗体（B·Ab2）结合，另一些与标记核素的单克隆抗体（Ab1*）结合，再加入涂布有亲和素的聚苯乙烯珠（SP·A）与生物素连接成固相终产物。该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心洗涤的麻烦，待测复合物与固相结合更牢固，方法更稳定，操作更简便。其反应式如下：
&&&&&& Ag + Ab1* +
&&&&&& Ab1*·Ag·Ab2·B + Ab1*
Ab1*·Ag·Ab2·B·A·SP + Ab1*
三、抗体和核素的标记方法
（一）抗体 &&&IRMA法所用抗体通常由人工制备获得。抗体主要有多克隆抗体（PcAb）、单克隆抗体（McAb）和基因工程抗体三种类型。其中基因工程抗体多用作药物载体。获得PcAb的传统方法是将纯化抗原免疫动物（如家兔、羊、马或豚鼠等），由动物体内B细胞产生抗体。因使用的抗原分子具有多种抗原决定簇，且每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞，产生针对相应抗原决定簇的抗体，所以获得的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为PcAb。McAb通常由杂交瘤技术获得，该技术又称抗体的细胞工程技术，随着细胞工程技术的进步，已在小鼠-小鼠杂交瘤的基础上发展了大鼠-大鼠、小鼠-人及人-人杂交瘤技术等。制备McAb的基本原理是利用致敏的B淋巴细胞能分泌特异性抗体和骨髓瘤细胞能在体外大量繁殖的特点，而将两者融合成既能分泌特异性抗体又能在体外大量繁殖的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞经大量克隆化培养产生的针对单一抗原决定簇的抗体称为McAb。纯化抗体的方法较多，一般常采用综合技术，如纯化IgG类抗体，多使用盐析与离子交换法；纯化IgM类抗体则应用凝胶过滤与制备电泳法，或应用离子交换与凝胶过滤法等。
（二）放射性核素& &&用于IRMA法标记抗体的放射性核素类同于RIA法标记抗原，详见本节RIA法。
（三）标记方法&&& 以125I标记物为例，IRMA法与RIA法基本相同。IRMA法标记抗体与RIA法标记抗原比较，其优点是克服了RIA法中存在的某些抗原不易标记，或在标记过程中容易发生化学或放射性损伤的缺点。而且抗体（IgM）分子中含有多个酪氨酸残基，经标记过程中的碘化反应后不影响其免疫活性，能结合较多的放射性碘原子，标记物的放射性比活较高。同时，抗体的来源较抗原丰富（和纯品易得），标记方法容易掌握。如果将抗体分子经胃蛋白酶消化，再用2-巯基乙醇裂解成单价抗体（Fab），然后用125I标记应用于IRMA法，则显著提高敏感性。
【应用与评价】
放射性核素标记免疫分析技术具有检测灵敏度高（可达ng-fg级水平），特异性强（可识辨结构类似的抗原），重复性好（CV小于10%），样品和试剂用量少，测定方法容易规范化和自动化等优点，已在医学和临床实验诊断等研究领域得到广泛应用。该技术首创时被用于测定胰岛素，在测定激素类活性物质中的应用历史最长。现可用此项技术测定的激素已达数十种之多，除作为下丘脑-垂体-甲状腺轴和肾上腺皮质激素、性激素、APUD激素、PTH、降钙素、GH等[9~24]的常规测定技术外，近年又开展了胰岛素Lispro[25]、肾素[26]、瘦素[27~29]、骨钙素[<span style="color:#FF]、LH-β核心片段和LH-α片段及LH二聚体[32,
33]、重组的人GH、血和尿中的TRH类似物TA-910[34]、CRH结合蛋白（CRH-BP）[35]、PTH相关蛋白（PTHrP）[36]、心钠素N-末端片段[37]、SHBG[38, 39]、IGF-1[27，<span lang="EN-US" style="color:
#FF]、红细胞生成素[27]、（CGRP）[41]、肾上腺髓质素（adrenomedullin） [42]、IGF-BP3和PRL[39，43]等多种物质的测定。
IRMA与RIA比较的主要优点是抗体获得容易，标记简单方便，抗原抗体反应属非竞争性反应，两者反应速度快（约2~3h）；灵敏度比RIA高10~100倍，测定线性范围广；固相抗体和标记抗体是分别针对一个抗原分子的两个决定簇的McAb，不易发生非特异性交叉反应，测定特异性高。IRMA的缺点是:
如果用典型的双抗体夹心法，则待测抗原的分子必须具有两个以上抗原决定簇，对短肽和半抗原活性物质的测定受到限制。
放射性核素标记免疫分析技术的主要不足之处是具有放射性污染，标记试剂的放射性强度随时间而衰变，保存期受到严格限制，试剂盒需按计划定期供给，不方便随意使用。
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（伍贤平）
第三节& 酶免疫分析技术
酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术（enzyme immunohisto chemical technique）和酶免疫分析技术（enzyme immunoassay, EIA）两类。酶免疫组织化学技术主要用于抗原的定位检测。利用酶标记的抗体与组织切片上相应抗原起反应，然后与酶底物作用，形成有色沉淀物。在技术上与荧光抗体技术类似，其优点是可以在普通光学显微镜下观察。EIA技术主要用于液体中抗原或抗体的定性或定量测定, 将酶促反应的高效率和抗原抗体反应的特异性有机结合起来，具有荧光免疫试验和放射免疫试验的优点，并克服了上述两法的缺点，目前该项技术已普遍用于肿瘤、自身免疫病、血液病，以及细菌、病毒、寄生虫等感染的诊断。
【原理与分类】
EIA技术由免疫反应系统和检测系统两部分组成。在免疫反应系统中，抗原与抗体反应，形成抗原-抗体复合物。生物酶作为标记物的指示剂，同时又是一种生物催化剂，可与其底物发生特异性催化反应，生成的产物又可与另一种能产生反应（生色源）或使紫外吸光值变化的化合物发生氧化还原反应。用分光光度计测定底物溶液的吸光值，检出指示剂的变化情况。
广义的EIA工作原理[1,2]，可用以下三个反应式来表示：
①免疫反应：抗原 + 抗体&&&&&&&&&&&&&&&&&
抗原-抗体复合物
②酶活性放大：抗原-抗体复合物 + 酶标记物&&&&&&&&&&&&&&&&&&
抗原-抗体-酶复合物
生色源或供氢体
③显色：抗原-抗体-酶复合物+底物&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&& &&&&产物 （出现颜色反应或紫外线吸
光值发生变化）
一、根据抗原-抗体反应动力学分类
（一）竞争性酶免疫法（competitive enzyme immunoassay）
待测抗原（半抗原）或抗体与标准抗原（半抗原）或标准血清竞争结合对应的免疫反应物反应，其竞争性主要表现在如下两个方面。
1. 待测抗原或待测抗体（包括标准抗原或标准血清）直接与酶标抗原或酶标抗体竞争，使最终检测体系中的酶含量减少，因此，最终检出的酶活性与待测物浓度呈负相关，由此建立的标准曲线斜率为负值。
2. 待测抗原与底物标记抗原、辅酶标记抗原或亲和素标记抗原等竞争结合相应抗体，从而改变酶的活性（增强或减弱），使最终检测体系中的酶活性增强或减弱。如果酶活性增强，则最终检出的酶活性与标准品（或待测样本）的浓度呈正相关，标准曲线的斜率为正值。相反，如果竞争结合后酶活性减弱，则在标准曲线中酶活性与标准品的浓度呈负相关，标准曲线的斜率为负值。
（二）非竞争性酶免疫法（non-competitive enzyme
immunoassay）
待测抗原（半抗原）或抗体直接与对应的免疫反应试剂结合，利用酶标记抗抗体或酶标记非免疫识别物质，将酶与待测物连接起来，最后根据所检出的酶活性来推测待测物的含量。在这类方法中，通常最终检出的酶活性与待测物的含量呈正相关，建立的标准曲线斜率为正值。
二、根据抗原和抗体在反应体系中的存在方式分类
在所有的EIA技术中，抗原与抗体在反应体系中的存在方式有固相和液相两种，由此可将EIA技术分为下述两类。
（一）固相酶免疫分析法（非均相酶免疫分析法）[3]&
&&抗原、半抗原、半抗原-蛋白质结合物、抗体或某些非免疫试剂（如亲和素）等与固相载体连接，对应的配位体（如抗体、抗原和生物素）酶标记物再与固相化的上述免疫反应物联系。根据这一原理建立的EIA方法称为固相EIA（solid-phase
enzyme immunoassay, sEIA）或非均质法（non-homogeneous methods）。
sEIA方法在所有EIA方法中占很大的比重。目前常用的EIA方法大多数为sEIA类型。最典型、最常用的sEIA方法有酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和限量抗原底物珠法（defined antigen substrated sphere, DASS）。现以这两种方法为例，介绍sEIA的操作原理。
1. ELISA法 &&&以微量反应板、试管、齿轮、棒、纸和珠等在水中不改变其形状的材料作为固相载体的EIA方法，均可称为ELISA法。
其原理是基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，将待测标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成抗原-抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中待测物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应的效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，有下列6种类型。
(1) 双抗体夹心法测抗原&&& 如图1-2-7，其反应原理是：①将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗去未结合抗体及杂质。②加入受检标本，与固相抗体接触反应，让标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原-抗体复合物。洗去其他未结合物质。③加入酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。洗去未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶的量与标本中受检抗原的量呈正相关。④加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定。
双抗体夹心法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。双位点法测抗原也属于此类，用此法测定β-HCG的原理见图1-2-8。
(2) 间接法测抗体&& 利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。反应原理（图1-2-9）是：①将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗去未结合的抗原及杂质。②加入稀释的受检血清。血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗原-抗体复合物。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合被洗去。③加入酶标抗免疫球蛋白（酶标抗抗体，一般为酶标抗人IgG），它与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。清洗后，固相载体上的酶的量与特异性抗体的量相关。④加底物显色。颜色深度与标本中受检抗体量相关。本法主要用于对病原体抗体的检测，其主要缺点为受检标本须经稀释（1: 50~1:200）后才能进行测定，否则血清中高浓度的非特异性IgG和其他干扰物质会引起本底过高，影响结果的判断。
(3) 双抗原夹心测抗体&&& 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。同属抗体检测，与间接法不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。在间接法不适用时（如包被抗原中的杂质可与酶标记的抗人IgG反应），可试用此法。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。在临床检验中，抗HBs的ELISA常采用本法。
(4) 竞争法测抗体&&& 当相应抗原材料中含有与抗人IgG反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原进行包被时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量愈多，结合在固相上的酶标抗体愈少。因此阳性反应呈色较浅于阴性反应。一般在包被时多采用捕获法，即先包被与抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原，以测定HBcAg为例，其反应原理如图1-2-10。
(5) 竞争法测抗原&&& 小分子抗原和半抗原因缺乏可作夹心的二个或二个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定。竞争法的原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原与固相抗体竞争结合。标本中抗原量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少。因此标本中抗原含量较多时，呈色较淡。小分子激素或药物的ELISA测定多用此法。反应原理如图1-2-11。由于这些定量测定的准确度要求较高，试剂制备较困难。
(6) 双夹心法测IgM抗体&&&
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接ELISA一般仅适用于检测IgG抗体。如用酶标记的抗人IgM作为二抗进行间接ELISA测定IgG抗体，标本中同时存在的不同浓度的IgG抗体将与IgM抗体竞争，而使结合在固相抗原上的IgM抗体相应减少。另外标本中如含有类风湿因子，也会产生干扰。因此用一般的间接法测定IgM抗体不能得到准确的结果。在双夹心法中，用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继加酶标记针对抗原的特异性抗体，再与底物作用，呈色即与标本中的特异性IgM呈正相关，其反应原理以检测IgM抗HAV为例（图1-2-12）。
2、DASS法&&& 将抗原或抗体交联到溴化氰活化的琼脂糖4B上，用于检测待测样本中的抗体或抗原含量。测定时，在试管内加入与抗原（或抗体）交联的琼脂糖珠和待测样本，室温下作用，离心除去上清液，用缓冲液洗涤底物珠2~3次，加酶标记抗体（或抗原）。室温孵育后离心、洗涤、加底物显色。由于固相载体为琼脂糖珠，整个免疫反应都在试管内完成，故又称为试管法。如果将固相载体置于涂布明胶的玻片上，所建立的方法则称为玻片法。为了便于分离免疫复合物与游离物，也可将磁性琼脂糖珠（magnogel，含7%氧化铁的聚丙烯酰胺-琼脂糖微珠）用5%戊二醛活化后与抗体或抗原结合，然后加入待测血清，再用酶标记抗体（或抗原）与之作用，形成双抗体（或抗原）夹心。由于magnogel中含Fe3O4，故洗涤时可用磁场将magnogel吸住后反复清洗（不需离心）。
（二）液相酶免疫分析法（又称均相酶免疫分析法）&&& 在这类方法中，抗原或半抗原、抗体和酶标记物等均游离于整个反应体系中（包括免疫反应和酶促反应）。结合物与游离物必须通过特定方法才能进行分离（如类似于液相RIA的双抗体离心分离法）。
然而也有一些液相EIA方法，如邻连法和竞争性均质EIA方法等，由于所用的酶比较特殊，其活性受免疫反应的调节，所以不必对反应体系中的结合物与游离物进行分离。
常见的液相EIA有双抗体法（double antibody method）和均质法（homogeneous enzyme
immunoassay, HEIA）两种类型。
1. 双抗体法&&&
抗体和抗抗体的分子量较大，它们结合后形成分子量更大的免疫复合物，在离心力的作用下可以沉淀下来。当酶标记抗原与抗体结合后，可用抗抗体将其沉淀。相反，未与抗体结合的酶标记抗原因不能与抗抗体结合而不能沉淀（游离状态），从而将结合的酶标记物与游离的酶标记物分开。根据这一原理建立的液相EIA方法称为双抗体法。该法通常在试管内进行，不需要固相载体，因此不存在固相载体质量影响测定结果的问题。
2. 均质法&&&
将抗原（半抗原）、抗体和酶或酶标记物及底物混合在一起，反应结束后，即可直接测定结果。基于这一原理建立的液相EIA法叫作均质EIA或均相EIA（homogeneous phase EIA）。现已发展了多种HEIA方法，其原理、操作方法和适用范围各不相同。该法早先仅用于测定激素（如甲状腺素）、药物（如吗啡）等小分子物质，现也可用于大分子物质（如蛋白质激素、细菌、病毒和抗体等）的测定，该方法的主要优点是操作简便。
根据抗原与抗体反应动力学特点，可将均质法分为竞争性和非竞争性两类。根据标记物的特点又可将均质法分为三类，即标记抗原系统、标记抗体系统和配对酶双标记系统。在标记抗原系统中，抗原可与全酶（如酶放大EIA）、辅酶（辅酶循环EIA）或底物（底物标记荧光EIA）偶联，从而建立各种HEIA方法。在标记抗体系统中，抗体与酶分子偶联，使酶活性增强（酶增强EIA）、减弱甚至被抑制（标记抑制酶抑制EIA）。在配对酶系统中，通常需要两种配对酶。这些酶的催化活性受免疫反应的影响。
三、根据反应体系与检测体系之间的关系分类
反应体系是指酶免疫测定中抗原与抗体的反应。检测体系是指借助于酶活性测定而对参与免疫反应的待测抗原、半抗原或抗体进行定量检测所采取的一切措施。通常，反应体系可有一步或两步反应。第一步反应为抗原、半抗原-蛋白结合物、抗体或非免疫识别物质等与固相载体之间的反应（只有固相EIA法才有该反应）；第二步反应为抗原或半抗原与抗体之间进行的免疫反应；而在检测体系中只有一次反应，即酶促反应。
根据反应体系与检测体系之间的关系，可将EIA分为直接法和间接法两类。
（一）直接法&& 检测体系与反应体系直接联系，中间不需任何环节。这类方法的特点是操作简便，特异性强，但灵敏度较差。
（二）间接法&&& 在反应体系与检测体系之间，连接一个或多个中间体或连接桥，如非免疫识别系统、免疫识别系统等，以增强酶的相对含量或增强酶的比活性，这类方法的显著特点是灵敏度高，但精密度较差，而且需要制备中间体，故增加了测定成本并使方法变得繁琐。
【酶促反应的特性】
在EIA技术中使用的酶，无论是化学本质还是催化反应的基本特性都与其他生物酶类是一致的，它们通常与免疫识别物质（抗原或抗体）、非免疫识别物质（如IPA、亲和素等）或酶底物有机结合。酶促反应充当免疫反应化学定量的示踪物，酶与其特异性底物构成EIA的指示系统。
一、酶的催化特性
酶的催化作用特点之一是效率极高，可比一般催化剂高106~1010倍，远远超出一般催化剂的催化能力。当酶作用于特异的底物，使其变成复合物时，中间要经过一个生成过渡状态分子（酶底物复合物）的阶段，由于过渡状态分子含能量很高，极易释放能量转变成产物，所以酶促反应的速度与过渡状态分子的生成量成正比关系。通常使反应物变成过渡状态分子需要一定的能量（称活化能），如果活化能很高，则只有少数分子可以达到活化能，所以生成的产物很少，故反应速度慢。若在此过程中，温度升高，可促进底物分子的运动，使进入过渡状态分子的数目增多，增加分子的有效碰撞机会，故能加速反应的进程。
酶催化作用的另一特点是具有较高的特异性，即一种酶只作用于一类化合物（如过氧化物酶）或一定的化学键，以促进一定的化学变化，得到相应的产物。有些酶甚至具有绝对特异性，只能作用于一种专有底物，催化一种反应（如苹果酸脱氢酶）。
酶促反应的速度可用Michaelis-Menten方程（米-曼式方程）计算出来：
上式中，Vo：初始反应速度；Vmax：最大反应速度；[s]o：底物初始浓度；Km：米氏常数。
当[s]o=Km时，Vo=Vmax/2，即酶促反应达到最大反应速度的一半。从米-曼式方程可以看出，当[s]o远大于Km时，Vo=Vmax即底物浓度过量时，反应速度达到最大。
但在实际工作中，底物过量的程度要注意如下三个因素：①底物对酶是否有抑制作用；②底物的成本和来源；③底物的溶解度。通常底物的用量为100Km，若底物用量不足，则酶促反应有可能朝逆反应方向进行，从而影响产物的生成速度。
二、酶活性的抑制
酶活性的抑制有不可逆和可逆两种类型，不可逆指抑制剂与酶活性中心的必须基团结合，使酶分子中一个或多个功能基团遭到破坏或改变，（如有机磷化合物能与多种酶活性中心的丝氨酸残基的-OH结合，使之失去活性，重金属离子能与酶活性上半胱氨酸残基的巯基结合而抑制酶活性）。这种结合不能借助稀释或透析等简单方法而解除。所以酶标记物的制备、提纯以及酶促反应过程中，应避免污染这一类抑制剂。
可逆性抑制又可分为竞争性、非竞争性、反竞争性和混合性抑制四类。①竞争性抑制在EIA中比较常见，抑制剂与酶可逆性结合生成酶-抑制剂复合物，其结合部位和酶与底物的结合部位相同，通常可通过增加底物浓度而使抑制作用减弱，即抑制作用的强弱取决于抑制剂的浓度与底物浓度的相对比例。②非竞争性抑制可能是抑制剂在酶分子上的结合部位与结合底物的部位不同，对酶促反应的Km值没有影响，但可改变Vmax。因此不能通过增加底物浓度而使反应逆转。③反竞争性抑制其抑制剂虽不能与游离酶结合，但可与酶-底物复合物结合，从而使酶促反应的Km和Vmax同时以同样的比率降低。④混合性抑制作用是指酶促反应中同时发生竞争性和反竞争性的两种抑制作用，同时使酶促反应的Vmax和Km值按不同的比例变化。
三、影响酶促反应的因素
酶的化学本质是蛋白质，极易受外界条件的影响而改变其构象和性质，因而其催化活性必然会受到影响。温度、缓冲液成分和pH以及其他易导致蛋白质变性的因素，都对酶促反应速度有影响。
（一）温度&&& 温度对酶促反应的影响表现为正反两个方面。在一定温度范围内（0~40℃），酶促反应速度随温度的升高而加快。但酶是蛋白质，随着温度的继续升高和时间的延长，蛋白质的变性速度加快，从而使反应速度减慢或使酶完全失去活性。在酶促反应中，提高温度使反应速度加快与使酶失活这两个相反的影响是同时存在的。在温度较低时，前一影响较大，所以反应速度随温度上升而加快；当温度继续上升时，则酶蛋白变性这一因素逐渐成为矛盾的主要方面。因此，随着酶的有效浓度的减少，反应速度也减慢。只有在最适反应温度时，酶促反应速度才达到最大。通常测定酶的催化活性都在最适温度条件下进行。但是，由于酶作用的最适温度并非一个恒定不变的常数，而是与反应所需要的时间和反应体系的pH值有关。反应时间愈短，酶的最适温度可以提高。反应体系的pH值也可改变酶促反应的最适温度。如碱性磷酸酶反应体系pH值分别为10.3、10.1和9.9时，对应的最适温度分别为25℃、30℃和37℃。
过氧化物酶在温度较高（15~37℃）时，反应速度较快，但同时活性丧失的速度也加快，因此催化反应温度以15℃为宜。如果在反应体系中加入非离子洗涤剂，则可延长丧失活性的时间。在这种情况下，反应温度可以适当升高。
酶的活性虽然随着温度的降低而减弱，但低温对酶无破坏作用，只是酶的催化活性很微弱。当温度回升后，酶又恢复其活性。因此EIA中所用的酶及其标记物宜在低温保存。
（二）pH值&&& 酶蛋白亦与其他蛋白质分子一样，具有许多极性基团，在不同的酸碱环境中，这些基团的游离状态不同，所带电荷也不同。只有当酶分子处于一定的游离状态下，酶才能与底物结合。另外，一些酶的辅酶或底物也具有离子特性，pH值的变化也影响它们的游离状态，同样可影响与酶的结合。因此，溶液的pH值对酶活性影响很大。若其他条件不变，只有在最适pH值范围内酶促反应速度才能表现最大。各种酶的最适pH值不同，但多数是在中性、弱酸性或弱碱性范围内。
酶对pH值的敏感性与酶的种类和来源有关，某些酶(如溶菌酶)对pH特别敏感，pH值稍有变化（如改变0.1个单位）就可显著影响酶促反应速度。另一些酶（如过氧化物酶）对pH变化的敏感性稍弱，偏离最适pH 1~2个单位对酶促反应的影响较小（这类酶在EIA中对pH值的要求不高）。有些酶虽然催化活性相同，但因来源不同，也有不同的最适pH值。如从埃希大肠杆菌（Escherichia coli）中&&& 提取的碱性磷酸酶，最适pH值为8，但从犊牛小肠中提取的碱性磷酸酶，最适pH约为10，偏离这个值时，酶活性显著降低。
值得指出的是，虽然所有酶促反应都有一个最适pH值，但正如最适温度一样，酶的最适pH值也不是一个特有的常数，它受许多因素的影响，如酶的纯度、酶的固相法（固相EIA）、底物种类和浓度、缓冲液成分和离子强度、反应温度等因素的影响。因此在建立EIA方法时，最好对酶促反应条件（包括最适温度、最适pH值和最适反应时间）进行选择。
（三）缓冲液成分和离子强度&&& 缓冲液成分可从下列两个方面影响酶促反应：①不同的酶对缓冲液成分的要求不同。一些酶要求缓冲液中含二价离子，而另一些酶（如碱性磷酸酶）则要求缓冲液不含二价离子。一些缓冲液（磷酸盐缓冲液）甚至对某些酶（如碱性磷酸酶）有抑制作用。②不同的酶底物和生色源（或供氢体）对缓冲液成分也有要求。如辣根过氧化物酶对H2O2的作用，如果生色源为邻苯二胺，则宜用磷酸氢二钠和柠檬酸组成的缓冲液；如果用四甲基联苯胺作生色源，则须用乙酸钠和柠檬酸配制缓冲液。
缓冲液的离子强度（即浓度）对酶促反应也有影响。离子强度过低，势必降低缓冲液溶液的缓冲容量；相反，离子强度过高，则能改变酶的表面活力和介电常数，从而影响酶的结构和活性。EIA中底物缓冲液的配制浓度虽然随酶、底物和生色源种类不同而有差异，但一般为0.1 ~0.2mol/L。
四、固相载体
在固相EIA中，常将抗原（或半抗原-蛋白质偶联物）或抗体通过物理或化学作用包被在固相载体上，酶标记物则通过免疫反应（如酶标记抗原与包被抗体，酶标记抗体与包被抗原）使酶转变成不溶于水但仍保留酶活力的衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，而不同于以液相状态作用于底物的酶促反应。固相的直接接触成分严重影响酶的活性，因为固相酶与液相底物之间有可能被一层膜（约1μm，相当于蛋白质分子平均直径的100倍）隔离（可能由于微环境扩散受到限制或多电解质微环境表面电荷性质受到影响所致），从而影响酶促反应速度，并使酶促反应的最适pH值和最适温度发生偏移。
酶的固相化有可能使酶分子结构发生变化，导致部分酶失活，从而影响催化能力和Km。如变构酶可因固相化而使变构活化的能力降低。此外，固相酶也可因为空间屏障作用而使酶与底物或效应物的结合能力减弱，降低酶的催化活性。某些固相载体本身直接影响酶活性，如聚苯乙烯材料易使辣根过氧化物酶失活。
酶固相化后，蛋白质分子的空间构型（特别是活性部位的构型）发生变化。这种变化能够影响抑制剂对酶的作用。同时，载体的存在也会产生空间位阻效应，阻碍抑制剂接近酶分子。因此抑制剂对固相酶的抑制作用与对液相酶的抑制作用有所不同，这主要取决于抑制剂离子和载体聚合物离子的性质，载体上的离子对同电荷抑制剂有排斥作用，而对异电荷抑制剂有吸引作用。微环境对固相酶作用产物扩散的约束和限制也对抑制剂的抑制作用有影响。底物浓度很高时（无扩散限制）引起的抑制作用与液相酶类似。由于对产物的抑制作用不能迅速扩散，所以抑制剂对固相酶的抑制作用比对液相酶大。使用碱性磷酸酶作为标记物时，抑制作用特别明显。但是，底物的抑制作用（如H2O2对过氧化物酶的抑制）可因扩散的限制而减弱。
在固相EIA中，提高底物浓度（与液相EIA比较）可以抵消一部分扩散的限制，从而提高酶的催化活性。由于固相对酶的催化活性有影响，所以液相EIA的工作条件不能直接用于固相EIA。也就是说，在固相EIA中，为确定酶标记物的酶促反应条件，只有在固相条件下进行酶活性测定（如酶标记物先与包被的免疫反应试剂结合）才能反应真实情况。如果将酶标记物直接作用于底物，这样得到的酶促反应最适工作条件就不一定适合固相EIA的酶促反应。
五、EIA中常用的酶及其底物系统
适用于EIA中使用的酶，必须满足下列条件：①纯度高，催化反应不仅专一性强，而且转化效率高。②酶对底物的Km值较低，但对产物的Km值较高，使酶促反应永远朝正方向进行。③Ki或KI值均高，不易受酶抑制剂的抑制。④分子中含有足够的偶联用标记基团，用各种化学的或免疫学的方法与半抗原、抗原、抗体蛋白分子偶联处理后，仍保持较高的催化活性。⑤酶和底物的使用稳定性和保存稳定性均好。⑥酶活性测定方法简便、快速、灵敏。⑦样本中无内源酶或干扰物质。⑧酶和底物的来源、纯化（制备）和供应均较方便，价格亦较低廉。⑨用于固相EIA中的酶，要求受固相固定化作用的影响较小。用于均相EIA中的酶，还要求当抗体与酶标记物结合后，酶的活性表现出抑制或激活作用。⑩酶活性与EIA测定条件（pH值、离子强度、缓冲液成分等）相适应。
迄今尚未发现一种酶能完全满足上述各项条件，目前使用的酶只能基本符合上述要求（表1-2-1）。
EIA中常用的酶[4]
【临床应用】
ELISA被广泛用于临床检验中，除用于抗原抗体（包括自身抗体）的测量外，还可测定激素、激素转运蛋白、葡萄糖转运蛋白（GLUT）或细胞膜蛋白等[5]。但不论用哪种方法（包括ELISA）都要涉及到细胞膜亚组分的分离问题。其优点是本法有较高的特异性和敏感性，方便简便、快速，无放射污染。但和其他常规测定技术一样，ELISA在测定一些激素方面仍存在着非特异性干扰因素较多，敏感性尚不很高等缺点。Clerico等比较了用各种方法测定ANP、BNP、pro ANP、pro BNP的优缺点。由于ANP类激素的血浆浓度低（正常为3~6pmol/L）以及ANP的结构与代谢特点，竞争性分析法的敏感性和特异性均低，而IRMA、ELISA或免疫发光分析法明显优于前者，但仍需进一步提高特异性和敏感性[6]。由于许多肽类激素均有与ANP相似的特点（如低浓度、多种类似物等），故要灵敏反映激素的变化必须采用新一代的测定技术。
酶免疫技术主要用于自身抗体的定位诊断，尤其常用于免疫组织化学及细胞的自身抗原定位。用制备性抗体还可定位一些酶类，并可测定酶的活性。例如，5α-还原酶有1型和2型两种，它们分布的部位不同，即使在皮肤毛囊中，其分布也不相同，1型5α-还原酶主要定位于皮脂腺内，主要调节皮脂的生成量，用1型5α-还原酶的特异性抑制剂可治疗痤疮。Thiboutot等发现，1型5α-还原酶抗体主要定位于皮脂腺内，而2型抗体主要定位于毛囊根底部[7]。因而酶免疫定位是确定同工酶的作用部位与特异性的极好方法。又如，α-雌激素受体（ERα）的表达量是估计乳腺癌激素治疗预后的最好指标。在一般情况下，可用EIA来测定ERα，但很难测出微量的ERα，而免疫组织化学分析（immunohistochemical
assay, IHC）可探测微量组织标本的ERα。Kobayashi等用5种不同的雌激素受体抗体（ID5、C-314、G-20、C-311和HC-20），分别与不同的受体序列结合，比较EIA和IHC两种方法的敏感性和特异性，发现EIA的阳性率为68%，而不同抗体测定的IHC阳性率为44.3%~77.3%，提示用针对受体特殊序列的特异性抗体测定或定位激素受体，IHC要明显优于EIA[8]。
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（黄干& 彭健）&
第四节& 荧光免疫与时间分辨荧光免疫技术
荧光免疫分析（fluorescence immunoassay，FIA）技术是较早建立的免疫标记技术之一，它具有免疫反应的高特异性和荧光技术的高敏感性等优点。Coons于40年代首先合成了荧光染料异氰锶（anthracens
isocyanate），并用于标记抗体（或抗原），且不损害抗原或抗体的免疫学特性。50年代合成一种新的荧光素异氰酸荧光黄（fluorescein isocyanate，FIC）；1958年，Riggs等合成一种更优良的荧光素异硫氰酸荧光黄（fluorescein
isothiocyanate，FITC），FITC易与抗体（或抗原）共价结合成稳定的化合物。同年，Chadwick等还合成了罗丹明B-200（lissamine rhodamine B200，RB200），FITC与RB200形成鲜明的对衬，前者发出黄绿色荧光（495nm），后者发出橙红色荧光（560nm），这为双标记荧光免疫技术提供了有力的手段。1960年，Glodstein应用现代免疫化学技术纯化荧光抗体，在很大程度上解决了非特异性荧光染色的难题，从而大大提高了FIA技术的敏感性和特异性，荧光显微镜技术也随之得到迅速发展。
【荧光免疫技术的基本原理】
物质吸收光能后，在极短时间（10-8~10-9秒）内，产生激发态分子，释放出波长比激发光更长的可见光，将具有这种特性的物质用化学方法结合在抗体（或抗原）分子上，后者与相匹配的抗原（或抗体）结合后，通过荧光检测仪观察荧光或测量荧光强度，从而判断抗原（或抗体）的有无和分布情况，或检测样本中抗原（或抗体）的含量[1,2]。
一、荧光免疫技术的分类
荧光免疫技术主要用于抗原、抗体的定位，需要通过显微镜观察。
（一）直接法&&& 将特异性荧光抗体直接加在固定的待检标本上（含抗原），使之形成抗原-抗体复合物，以鉴定未知抗原。并可根据荧光的分布和形态，确定其抗原性。本法的优点是简便快速，特异性强；缺点是不能用已知抗原检测未知抗体，而且检测每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，其敏感性较差。常用于细菌、病毒的快速检查。
（二）间接法&&& 又称双抗体法。利用荧光标记抗体鉴定未知抗原或未知抗体，荧光标记的抗球蛋白抗体可检测各种未知抗原或抗体，其敏感性比直接法高5~10倍，缺点是参加反应的组分较多，步骤繁杂，所需对照多。常用于各种自身抗体的检测。
（三）补体法&&& 利用荧光素标记抗补体抗体，以鉴定未知抗原或抗体。本法仅需一种标记抗补体抗体，由于补体与抗原-抗体复合物结合无种属特异性，从而不受已知抗体或待测血清的动物种类限制，故可检测各种抗原-抗体系统。缺点是容易产生非特异性干扰，需要较多的对照，补体不稳定，不易长期保存。
（四）双标记法&&& 用FITC和RB200两种荧光素标记不同抗体，对同一基质