中国HIV/AIDS患者外周血单核细胞活化及表面TLR4表达与疾病进展关系的研究--《中国医科大学》2007年博士论文
中国HIV/AIDS患者外周血单核细胞活化及表面TLR4表达与疾病进展关系的研究
【摘要】：
近二十年来研究者们一直致力于获得性免疫对HIV感染的免疫应答研究，但到目前为止在免疫治疗和疫苗方面尚无突破性进展。近来研究显示，在HIV感染中天然免疫系统可能占有非常重要的地位。单核／巨噬细胞是天然免疫中的重要细胞，能主动吞噬和清除HIV等外来抗原，并具有抗原递呈功能。单核／巨噬细胞表面带有CD4受体，由于该受体是HIV感染的主要受体，故单核／巨噬细胞是HIV攻击的靶细胞，亦可被HIV感染。受HIV激活的单核／巨噬细胞可分泌TNF-α、IL-1、IL-6等生物活性介质，调节机体的免疫应答。同时，单核细胞的细胞膜上存在Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)，通过感知病原微生物并激活细胞，在宿主的天然免疫中具有重要作用，并参与启动获得性免疫。最近研究发现，TLR4在人外周血中主要表达在单核细胞表面，而HIV感染时TLR4介导的信号途径对HIV的转录过程有促进作用。目前单核／巨噬细胞系统在HIV感染后起何作用还没有明确结论。本文首次研究了不同疾病进程的中国HIV／AIDS患者外周血单核细胞的表达与活化水平及其表面TLR4的表达情况，并结合血浆TNF-α浓度及HIV病毒载量进行分析，初步探讨HIV感染后外周血单核细胞的功能状态及其表面TLR4表达对艾滋病疾病进程的影响及可能致病机制。
1．研究对象
由中国医科大学艾滋病研究所、辽宁省疾病预防与控制中心以及吉林省疾病预防与控制中心经艾滋病确认实验室Western blot试验确认为HIV阳性，根据CD4+T细胞数量和感染时间不同，HIV／AIDS患者被分成三组：典型进展HIV感染组，CD4+T淋巴细胞≥200个／μl，无艾滋病指征性疾病，感染时间＞5年；典型进展AIDS组，CD4+T淋巴细胞＜200个／μl或出现艾滋病指征性疾病，感染时间＞5年；HIV感染长期不进展组，CD4+T淋巴细胞≥500个／μl，感染HIV 10年以上，未经抗病毒治疗，无艾滋病指征性症状。HIV抗体阴性的健康对照来自本院健康体检门诊的体检者，血液系统及肝肾功能检查结果正常，无免疫系统疾病史。
2．T淋巴细胞绝对值计数
将20μl CD4／CD8／CD3TriTEST试剂加入CD4绝对计数管中，加入50μl EDTA抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACS MULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。
3．病毒载量检测
采用RT-PCR方法，用美国Roche公司的COBAS AMPLICOR自动载量仪测定血浆病毒载量，最低检测限为400拷贝／毫升。
4．单核细胞功能测定及表面TLR4的表达
实验管加入10μl FITC标记的小鼠抗人CD14、10μl PerCP标记的小鼠抗人CD69单克隆抗体和10μl PE标记的小鼠抗人TLR4，对照管加入等体积的FITC、PerCP、PE标记同型小鼠IgG，分别加入100μl抗凝全血，混匀，室温避光孵育30min，加入溶血素3ml，室温孵育8min，1200r／min离心5min，弃上清。加入2ml PBS悬浮，室温、1200r／min离心5min，洗涤两次，加入1％多聚甲醛的PBS200μl后悬浮，24小时内上机检测。
用BD FACSDiva~(TM)软件进行获取与分析，使用前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)确定单核／巨噬细胞群，再以FSC／CD14-FITC双参数设门，每管分析门内5000个细胞，阴性界限由阴性对照管确定，分析各管中CD14+细胞的吞噬功能(SSC光散射强度)、抗原水平(荧光强度)、活化程度(表面活化分子CD69的表达率)、CD14+细胞占外周血单个核细胞的比率及CD14+细胞表面TLR4的表达水平。
5．密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
离心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液，沿管壁缓慢加入等量抗凝全血，离心2000rpm，20min。用毛细管吸取界面层的PBMC，移入另一试管中。加入5倍体积的PBS液，洗细胞2次。
6．制备细胞RNA
按照QIAGEN公司细胞RNA提取试剂盒的说明书进行操作，通过全自动紫外分光光度仪检测所得RNA的质量和浓度。
7．引物及探针的设计和合成
采用Primer express2.0软件设计引物及探针，TLR4上游引物为：TGGAAGTTGAACGAATGGAATGTG，下游引物为：ACCAGAACTGCTA CAACAGATACT，探针为：FAM-AGCACACTGAGGACCGACACACCAA-TAMRA。内参GAPDH的上游引物为：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物为：GAAGATGGTGATGGGATTTC，探针为：FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA。上述引物及探针经BLAST分析，匹配率为100％。
8．标准品质粒的构建
逆转录反应按照TaKaRa公司试剂盒说明书进行，RT反应体系为总RNA 1μg，随机引物50pmol，5×ExScript buffer 2μl，dNTP Mixture 10mM，RNase inhibitor 10U，ExScript~(TM) RTase 10U，用RNase Free dH_2O补齐10μl。反应条件为42℃30 min，95℃5min，4℃终止反应，所得cDNA-20℃冻存备用。利用上述引物进行RT-PCR扩增TLR4和GAPDH，PCR产物胶回收纯化后克隆到pUCmT—vector，转化到大肠杆菌DH5α感受态菌中，蓝白筛选后获得阳性克隆，测序验证。纯化重组质粒，紫外分光光度计定量后根据分子量换算为分子拷贝数，稀释标准质粒，产生梯度浓度：10~9、10~7、10~5、10~3、10作为标准品质粒。
9．实时定量PCR
采用Taqman法，应用LightCycler(Roche，Mannheim，Germany)荧光定量PCR仪进行定量检测，以GAPDH为内参照，进行双标准曲线法进行相对定量。反应条件：反应体系为20μl，Premix Ex Taq~(TM)(2×)10μl，上下游引物各0.2μM，探针0.4μM，cDNA 2μl。反应条件为：95℃10s，95℃15s，62℃1min，40个循环。反应结束后电脑用不同浓度标准品质粒的拷贝数和CT值自动绘出TLR4和内参GAPDH的标准曲线，并可根据待测样本的CT值中自动计算出TLR4mRNA的拷贝数。每一份标本均行复管检测，取其均值做为目的基因的表达水平，结果以TLR4／GAPDH mRNA比值计算。
10．血浆TNF-α的检测
采用ELISA法，按照试剂盒说明书进行检测，所有实验均重复两次检测，结果取平均值。
11．统计学处理
实验所得的数据用均数±标准差表示，实验组和健康对照组各指标的比较采用t检验，各指标之间的相关关系采用Person相关系数分析。所有资料采用SPSS11.5进行分析，P＜0.05有统计学意义。
1．HIV／AIDS患者外周血单核／巨噬细胞的活化及吞噬功能的比较
HIV／AIDS患者CD14+细胞占外周血单个核细胞的比率、CD14+抗原水平与健康对照组相比差别无统计学意义；两组分别以CD14+细胞设门，HIV／AIDS组中CD14+细胞早期活化分子CD69的表达率明显高于健康对照组。其中AIDS组CD14+细胞早期活化分子CD69的表达率高于HIV组及LTNP组，HIV组高于LTNP组，差别有统计学意义(p＜0.05)，LTNP组和对照组相比无明显差异。
2．HIV／AIDS患者外周血单核／巨噬细胞的CD69表达率与疾病进展的关系
HIV／AIDS患者外周血单核／巨噬细胞的CD69表达率随着CD4+T淋巴细胞绝对值的降低而升高，经相关分析可知单核／巨噬细胞的CD69表达率与CD4+T淋巴细胞绝对值呈明显负相关，r=-0.872，P＜0.01；检测不同疾病进展阶段的HIV／AIDS患者，我们发现HIV组和AIDS组外周血单核／巨噬细胞CD69表达率显著增加，HIV-1 RNA病毒载量水平较高。经相关分析得出，HIV／AIDS患者外周血单核／巨噬细胞CD69表达率与HIV-1 RNA病毒载量呈显著正相关，r=0.697，P＜0.01。
3．PBMC中TLR4mRNA在各组HIV／AIDS患者和健康对照者中的表达
各组TLR4 mRNA含量的定量检测结果显示，LTNP组、HIV组和AIDS组TLR4 mRNA的表达量均高于健康对照组，其中AIDS组TLR4 mRNA的表达高于HIV组及LTNP组，HIV组高于LTNP组，差别有统计学意义(p＜0.05)，LTNP组和对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。
4．PBMC中TLR4mRNA的表达水平与HIV-1病毒载量的相关性
检测不同疾病进展阶段的HIV／AIDS患者，我们发现HIV组和AIDS组PBMC中TLR4mRNA的表达水平显著增加，HIV-1 RNA病毒载量水平较高。HIV╱AIDS患者PBMC中TLR4mRNA的表达水平与HIV-1 RNA病毒载量呈显著正相关(r=0.697，P＜0.01)。
5．HIV／AIDS患者外周血单核细胞上TLR4的表达及血浆中TNF-α浓度
HIV／AIDS患者外周血单核细胞上TLR4表达阳性率和平均荧光强度(MFI)分别为52.19±4.37％和74.254±7.06，明显高于健康对照组，p＜0.0001：HIV／AIDS患者血浆中TNF-α浓度为35.794±5.08pg／ml，与健康对照组相比差别均有统计学意义，p＜0.001。
6．HIV／AIDS患者外周血单核细胞TLR4的阳性表达率与血浆TNF-α浓度的相关性
HIV／AIDS患者血浆TNF-α浓度随着外周血单核细胞TLR4的阳性表达率升高而升高，经相关分析显示HIV／AIDS患者血浆TNF-α浓度与外周血单核细胞TLR4的阳性表达率成正相关，r=0.645，p＜0.01。
7．HIV／AIDS患者外周血单核细胞TLR4的阳性表达率与HIV-1病毒载量的相关性
随着外周血单核细胞上TLR4的表达率的升高，血浆中HIV-1病毒载量有上升趋势。经相关分析结果显示，HIV／AIDS患者HIV-1病毒载量的对数值与外周血单核细胞TLR4的阳性表达率呈显著正相关，r=0.708，P＜0.01。
1．中国HIV／AIDS患者外周血单核／巨噬细胞的活化和吞噬功能较健康对照组有显著上升，且与疾病进展密切相关。
2．从分子水平证实了TLR4 mRNA在中国HIV／AIDS患者中的表达上调，并且TLR4 mRNA的表达量高低与艾滋病疾病进展有明显相关性。
3．中国HIV／AIDS患者外周血单核细胞上TLR4表达上调，而且该受体可能通过促进TNF-α的分泌来介导HIV病毒复制。
【学位授予单位】：中国医科大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：R512.91
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