食品中氨基酸的测定方法【食品检测吧】_百度贴吧
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来源：中国标准物质网（3w_gbw114_com）一、双指示剂甲醛滴定法氨基酸含有酸性的COOH基，也含有碱性的一NH2，它们相互作用使氨基酸成为中性的钠盐，不能直接用碱液滴定它的梭基。当加入甲醛时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，使COOH基显示出酸性，可用氢氧化钠标准溶液滴定。用此法滴定的结果表示a一氨基酸态氮的含量，其精确度仅达氨基酸理论含量的90%。如果样品中只含有某一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出该氨基酸的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白水解液），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据，但一般常用此法测定蛋白质水解程度，当水解完成后，滴定值不再增加。但应注意，脯氨酸与甲醛作用产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羟基，滴定时要消耗一些碱，使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，使结果偏高。样品中氨基酸含量根据下列公式计算：X＝[(V2一V1)×C×0.014]/V×100式中：X—氨基酸含量，g/100mL;V1—中性红作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL;V2—百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL;C—氢氧化钠标准液的浓度，mol/L;V—样品液取用量，mL;0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol。说明及注意事项如下。(1)此法适用于测定食品中的游离氨基酸。(2）固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5h即可。(3)若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。(4）与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和COOH基时的pH值为8.5一9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。二、电位滴定法本法根据酸度计指示pH值控制滴定终点，适合有色样液的检测。样品中氨基酸含量根据下列公式计算：X＝[(V1一V2)×C×0.014]/（5×V）×100式中：X—氨基酸含量，g/100mL;V1—测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液，mL;V2—试剂空白试验加如甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;C—氢氧化钠标准液的浓度，moVL;V—样品稀释液取用量，mL;0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol。说明及注意事项如下。(1)本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。(2）对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。三、茚三酮比色法氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波波长为570nm，据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。样品中氨基酸含量根据下列公式计算：X=c/(m×1000)×100式中：X—氨基酸含量，μg/l00g;c—从标准曲线上查得的氨基酸的含量，μg;m—测定的样品溶液相当于样品的质量，g。说明及注意事项如下。茚三酮在放置过程中易被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化。方法为：取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性炭，摇动1min，静置30min，过滤；将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置干燥器中干燥，装瓶备用。四、氨基酸自动分析仪法食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。可同时测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。测定在氨基酸自动分析仪上完成，可控制的操作条件包括缓冲液流量、茚三酮流量、柱温、色谱柱规格。上机样品液中氨基酸总量根据下列公式计算：N=（c×A1）/A0式中：N—上机样品液中氨基酸量，nmol/50μL;c—上机标准液中氨基酸量，nmol/50μL;A1—样品峰面积；A0—氨基酸标准峰面积。样品中氨基酸含量根据下列公式计算：X=(N×f×Mr×100)/(m×V×106)式中：N—上机样品液中氨基酸量，mg/100g;f—样品的稀释倍数；Mr—氨基酸的相对分子质量；m—样品的质量，g;V—上机时的进样量（此处为50μL)。说明及注意事项如下。(1)样品中氨基酸的含量在1.00g/100g以下，保留两位有效数字；含量在1.00g/100g以上，保留三位有效数字。(2)16种氨基酸相对分子质量；天冬氨酸133.1;苏氨酸119.1;丝氨酸105.1；谷氨酸147.1；脯氨酸115.1；甘氨酸75.1；丙氨酸89.1；缬氨酸117.2；蛋氨酸149.2;异亮氨酸131.2；亮氨酸131.2；酪氨酸181.2；苯丙氨酸165.2;组氨酸155.2；赖氨酸146.2；精氨酸174.2。(3）标准出峰顺序和保留时间见表，标准图谱如图。(4)本法为国家标准食物中氨基酸的测定方法，适用于食物中的16种氨基酸的测定，最低检出限为10pmol。但本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定。【关键词】双指示剂甲醛滴定法 电位滴定法 茚三酮比色法
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有谁用甲醛法测过食品蛋白的含量？
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有谁用甲醛法测过食品蛋白的含量？
我只是做下试验，可结果同凯氏定氮法相差20多倍，我怀疑是公式的问题 。
甲醛法测过食品蛋白的含量公式：粗蛋白含量% ==0.0014*v*f*200/20*100/g*6.25
v——加入中型甲醛后，滴定至终点时消耗0.1n氢氧化钠的毫升数。
f——0.1n氢氧化钠的当量浓度校准系数
g——称取试样克数
此方法选自酒精生产分析检验一书
有用甲醛法测过食品蛋白的含量的朋友望讨论一下
qq豆制品 增稠剂，香料
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学习学习学习学习学习学习学习学习
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因不知操作步骤，从纯计算角看，“粗蛋白含量% ==0.0014*v*f*200/20*100/g*6.25”的公式不适合。应该按：
& && && && & 0。×0。014×6。25
蛋白含量%＝———————————— ————×100＝7。5754
& && && && && && && && && && && && && && && && && & 0。3722
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我测的是谷朊粉，取样0.3722克，消耗0.1007mol/l的氢氧化钠3.2ml .
用凯氏定氮法测的结果是77.23%
qq豆制品 增稠剂，香料
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甲醛值法测定的是能溶于水的氨基酸总量，其测定原理是利用氨基酸的两性即具有酸性的羧基和碱性的铵基，由甲醛固定氨基酸中的铵基使其显示出酸性再用碱标液滴定的一定的ＰＨ值，计算氨基酸态氮再乘以换算系数得出蛋白质含量，由于蛋白质是有氨基酸合成的所以可以说用这种方法测出的是真蛋白，而凯氏定氮法的测定原理是样品与硫酸一同加消化，使样品中的有机质破坏，使有机氮（其中包括蛋白氮和非蛋白氮）变成无机氮与硫酸结合形成硫酸铵，而与此同时无机氮也能与硫酸结合形成硫酸铵，因此用这种方法测出的结果不仅含有真蛋白，还有现在人们常说的矿物蛋白．
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觉得2楼的说法值得商榷，好像甲醛法测出来的也是总的铵态氮，包括游离氨基酸和无机铵盐
真蛋白与粗蛋白有什么区别？
& && && & 民以食为天，食以味为先。
& && && & 若无食和味，蹬腿脚朝天。
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我不知你测定的什么产品，哪种方法测得结果的高？
甲醛值法测定蛋白质的原理，其实就是测定出食品中的游离氨基酸态氮（ＧＢ/Ｔ5009.39）结果计算可参照ＧＢ5009.然后乘以换算系数得到蛋白质含量，是真蛋白，而用凯氏定氮法测出的蛋白是粗蛋白，因此用甲醛值法测得的蛋白质应低于用凯氏定氮法测得的结果
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(2)蛋白质含量的测定意义
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(2)蛋白质含量的测定意义
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食品中蛋白质检测应注意之处
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 前言&&& 蛋白质是食品产品标准中一项重要的理化性能指标，食品中蛋白质的测定目前通常采用的方法是半微量凯氏定氮法和自动定氮分析法。其原理是：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳氢被氧化为二氧化碳和水逸出，蛋白质中的氮转化为氨与硫酸结合生成硫酸氨在硫酸中，然后加碱蒸馏，使氨逸出，用硼酸吸收，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定。根据酸的消耗量乘以换算系数即为蛋白质含量。
公卫家园 &&& 很明显，上述方法只能检测食品中的总氮量，其中还包括非蛋白氮，由此可以给不法商贩在食品中掺假的机会，比如近日频繁发生的一系列奶制品蛋白掺假案，危害巨大。本文在着重探讨凯氏定氮法中应注意的问题之余，还简要扩展解决上述问题的方法，以完善食品检验技术。
公卫百科 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&一．样品、试剂加入量的控制1．称取试样的多少取决于样品中蛋白质的高低。蛋白质中含氮量较恒定，通过测定食品中氮的含量来确定蛋白质含量，一般固体样品称取0.2-2.0g，半固体样品称取2.0—5.0g，液体样品吸取10.0-20.0ml。样品中含氮量低的可适当增加称样量。
公卫考场 2．硫酸的加入量，通常加20ml，但试样量如超过5g时，应按每克试样5ml的比例增加硫酸用量，否则试样消化不完全造成结果偏低。3．消泡剂的加入。含脂肪或糖较多的食品在消化时产生大量泡沫，溢出瓶外，造成氮的损失，所以消化前可加入少量消泡剂。如：液体石蜡、硅消泡剂等。
公卫论坛 4．催化剂的加入量要适宜。硫酸铜是最理想的催化剂，效果好，价格便宜，环境污染小，而且是蒸馏加碱时的指示剂。硫酸钾可加快有机物的分解，使硫酸沸点从34．0℃提高到40．0℃以上，但加入量不能太大，否则温度过高会使铵盐分解而造成损失，除硫酸钾外硫酸钠也有同样作用。
公卫论坛 5．难消化的样品还可适当加入少量过氧化氢，次氯酸钠等氧化剂，加速有机物氧化。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 二．样品消化处理
公卫考场 1．样品一定要移入干燥的凯氏烧瓶中，否则样品易粘在瓶壁上不易消化。加硫酸时应将附在瓶壁上的粉末仔细洗至瓶中，使样品全部消化。消化时注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的碳粒冲下促进完全消化。2．样品与试剂加入摇匀后瓶口应放一小漏斗，将瓶倾斜45°角至有小孔的石棉网上，小心加热，避免喷溅。待瓶内试样全部碳化，泡沫完全停止后，再加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈澄清透明的蓝绿色后再加热半小时，样品即消化完全。
公卫百科 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 三．蒸馏过程中条件的控制1．蒸馏对温度、时间都有要求。热源温度过低直接影响氯的逸出，从而导致结果偏低。蒸馏时间应控制在30分钟左右，时间过少氯放出时间不足，使结果偏低，样品应在温度较高(1000W)的电炉子上蒸馏为宜，达到规定时间后应用PH试纸测出馏出液是否呈中性，若碱性应
公卫论坛 延长蒸馏时间直至中性。2．氢氧化钠的加入量。在蒸馏过程中，烧瓶内溶液应保持碱性，因此经消化处理样品加氢氧化钠后，瓶内液体在加热沸腾后溶液呈黑色，如果呈兰色，说明氢氧化钠的加入量不足，应补加至分解液呈黑褐色。3．硼酸作吸收液。由于硼酸是极弱的酸，只起吸收氯的作用，不影响碱滴定，但要注意硼酸吸收液温度不应超过40℃，否则氯吸收减弱，造成损失。
公卫百科 4．蒸馏装置不能漏气。蒸馏过程中不能停火断气避免发生倒吸，蒸馏完毕先将蒸馏出1：3离开液面，继续蒸馏1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，否则吸收液体将发生倒吸造成意外。5．在滴定过程中一定要将滴管中的气泡赶出，使之在0刻度线时开始滴定，滴定时不要过快，以免达到终点时不好控制。
公卫百科 总之，在检验过程中注意以上几点，才能减少误差，确保俭测结果与真实值一致。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 四．凯氏定氮法改进 公卫人 凯氏定氮法操作繁琐，试剂消耗量大，消化时排放气体对人体健康造成直接危害，而且费时、费电、费水。先进的蛋白质测定仪价格昂贵，且需专门试剂，目前尚难普及 。目前有人改良消化装置 ，采用8．8 moL／L过氧化氢一浓硫酸(4：1，v／v)混合液为消化试剂。缩短了消化时间，可以消除污染；用甲醛法代替蒸馏滴定，简化了操作。实验证明，该法分析速度快，操作简便，消除空气污染，且节约试剂和水电，测定结果与法定方法无显著性差异，为大批量测定蛋白质含量提供了良好手段。
公卫论坛 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 五．食品中蛋白质检测其他改进方法正由于近几年来食品卫生安全问题的不断出现，以及一直以来存在的蛋白质测定值虚高的问题，国家及一些检测机构组织改进了部分食品中蛋白质的测定技术，比如《乳与乳制品中蛋白质的测定 双缩脲比色法》的完成，标志着在利用其进行乳与乳制品中蛋白质测定的前提下，三聚氰胺等非蛋白含氮物将不会再被误判为蛋白质。再者食品中蛋白质水解的氨基酸检测法日渐成熟，氨基酸分析仪法、紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等都逐渐应用于检测，并大大提高了检测的灵敏度、准确性. 公卫人 食品中蛋白质检测工作事关重大，因此检测方法的选择和操作过程的规范十分重要，上述注意之处只有检验人员严谨对待，才能才能规范检验工作，确保食品的安全。 公卫人 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 参考文献[1] 单季先，陈悦. 食品中蛋白质含量测定方法的探讨[J].中国卫生检验杂志 ）：4
公卫百科 [2] 陈赞，汪之和. 食品中食源性成分分析的方法与进展[J]. 食品工业科技 [3] 胡增伦,吕建停.奶粉中蛋白质消化方法的改进[J].瑗防医学文献信息 20O1；8（7）：4[4] 郭盛斌.蛋白质检验中的关键点[J].分析检测 2000；1[5] 秦东，杨秀真. 奶粉中蛋白质含量测定结果的不确定度评定[J]中国预防医学杂志 ),6
公卫百科 [6] 中华人民共和国国家标准 食品卫生检验方法 理化部分, 食品中蛋白质的测定.北京：国家标准出版社，2004[7] 牟庆达，李伟，曲作林，高玉杰. 蛋白质测定装置的改进及使用注意事项[J] 现代化农业 2008；9[8] 胡爱锋,胡增伦. 直接比色法测定奶粉蛋白质实验报告[J]. 中国社区医师 2OO6；2（8）：77
公卫百科 [9] 张正奇,陈永湘,张郁葱. 用偶氮胂M分光光度法测定蛋白质[J]. 分析科学学报 )[10] 林树及. 《食品卫生检验方法理化部分》的评述[J]. 中国卫生检验杂志）
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蛋白质含量的检测、原理及注意事项
核心提示：本文主要阐述了蛋白的检测原理及注意事项，为基层检测人员提供理论参考
一、食品中蛋白含量测定的意义
蛋白质（protein）是的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。人体内酸碱平衡、水平衡的维持，遗传信息的传递、物质的代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食物中得到蛋白质及其分解产物来构成自身的蛋白质，因此蛋白质是人体的重要营养物质，也是食品中重要营养指标。
在各种食品中，蛋白质的含量各不相同。测定食品中蛋白含量，对评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、知道经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。
二、蛋白质的组成及结构
& 蛋白质是由C（碳）、H（氢）、O（）、N（氮）组成，一般蛋白质可能还会含有P（）、S（硫）、Fe（铁）、Zn（锌）、Cu（铜）、B（）、Mn()、I（）、Mo（）等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50% ，氢7% ，氧23% ，氮16% ，硫0~3% 及其他微量元素。一切蛋白质都含N元素，且各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。蛋白质系数：任何生物样品中每1gN的存在，就表示大约有100/16=6.25g蛋白质的存在， 6.25常称为蛋白质常数。
& 蛋白质是以为基本单位构成的生物高。蛋白质分子上氨基酸的序列和由此形成的构成了蛋白质结构的多样性。蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构，蛋白质分子的结构决定了它的功能。
& 氨基酸是构成蛋白质的基本单元，蛋白会约含有20种氨基酸，在细胞质中的核糖体上，将氨基酸分子互相连接成肽链。一个氨基酸分子的氨基和另一个氨基酸分子的羧基，脱去一分子水而连接起来，这种结合方式叫做脱水缩合。通过缩合反应，在羧基和氨基之间形成的连接两个氨基酸分子的那个键叫做肽键。由肽键连接形成的化合物称为肽。
三、蛋白质的检测原理
图2半微量法测蛋白
不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的。
样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。
2 消化过程中：
在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。
为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。
样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。
4 吸收与滴定：
蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。
半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。
准确称取样品中0.50-2.00g&于500ml凯氏瓶中&加10g无水K2SO4&加0.5gCuSO4&加20ml H2SO4&在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中&继续消化30分钟&至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却&加200ml水&连接蒸馏装置&用硼酸作吸收液&在凯氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH&立即接好定氮球&加热&至凯氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗&用0.1N HCl滴定。
五、注意事项
1 样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细过筛，液体样要混合均匀。
2 样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。
3 如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。
4 有机物分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：
1g样品 &K2SO4：H2SO4=7g：12ml&这种比例在国内外都使用，是公认的。
还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10 g：20ml
5 消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。
6 在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
7 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。
8 消化剂绿色后继续消化30分钟即可
9 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。
10 氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。
11 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。
12 蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12&4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。
13 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。
编辑：foodec007