目的基因CT值大于35怎么进行相对定量计算_百度知道
目的基因CT值大于35怎么进行相对定量计算
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如何通过荧光定量目的基因和GAPDH计算相对表达量内参就是一个表达量在各个组基本保持不变的基因，又叫看家基因，比如常用的GAPDH， actin。或者18s rRNA也可以。如果内参表达量一致，说明你PCR的上样量一致，样本的质量也一致。如果出入很大，说明你的样本的浓度或者是质量有问题。测到的目的基因的表达量就不可靠了管家基因是用来定量的。用来计算相对表达量。管家基因在相同量样品中的表达量我们认为是一致的。然后根据这个量来计算你的基因在不同样品中的表达量。所以每一个都需要单独的样品。基因组干扰需要你在提取RNA以后用DNase处理样品。如果不放心，可以拿处理过的RNA做膜版，跑一次，如果有带就是有污染，如果没有可以合成cDNA库了。
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ct值为20hu是啥子意思，HU是啥子？
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亨氏单位，是CT值的单位，简称Hu,用来表示CT图像上组织结构的相对密度，水的CT值是0亨氏单位。简单说，物质的CT值越高相当于物质密度越高
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凝血的CT值大约是A.20 HuB.30 HuC.40 HuD.50 HuE.60 Hu
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凝血的CT值大约是A.20 HuB.30 HuC.40 HuD.50 HuE.60 Hu请帮忙给出正确答案和分析，谢谢！
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1关于CTA成像技术的叙述，错误的是A.SSD、MIP常用于各种CTA的成像B.必要时应做冠状面三维图像重组C.颅内动脉CTA重建间隔为1mmD.横断面扫描按高分辨算法重建图像E.冠状动脉CTA应做容积再现成像(VR)2纵隔疾病首选的影像学检查方法是A.X线胸片B.X线透视C.B超D.MRE.CT3下列组合，错误的是A.层厚响应曲线——SSPB.多平面重组——MPRC.CT血管造影——DSAD.表面阴影显示——SSDE.最大密度投影——MIP4英文缩写“CTVE”表示的是A.多层面重组B.容积再现成像C.最大密度投影D.仿真内窥镜E.表面阴影显示
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中国早发性帕金森病患者的parkin和PINK1基因突变分析及临床特征
浙江大学医学院 硕士学位论文 中国早发性帕金森病患者的parkin和PINK1基因突变分析及临床 特征 姓名：胡正祥 申请学位级别：硕士 专业：神经病学 指导教师：张宝荣
浙江大学硕士学位论文摘要中国早发性帕金森病患者的 ｐａｒｋｉｎ和ＰＩＮＫｌ基因突变分析及临床特征浙江大学医学院 硕士研究生 导 师 神经病学 胡正祥 张宝荣教授中文摘要 研究背景：帕金森病（ＰＤ）是最常见的神经退行性疾病之一。在６５岁以上的人群中帕金 森病的患病率达到１％以上。在临床上主要表现为静止性震颤、强直、运动迟缓以 及对左旋多巴治疗有明显疗效，特征性的病理改变主要是黑质致密部大量多巴胺 神经元的丢失和残存多巴胺神经元内路易小体形成．到目前，帕金森病的确切病 因仍未阐明，但是，越来越多的基因被认为对ＰＤ起致病作用，ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵＣＨ－ＬＩ， 和ＬＲＲＫ２的突变被认为参与了家族性常染色体显性遗传性帕金森病的发病，而 ｐａｒｋｉｎ，ＰＩＮＫｌ，ＤＪ－１和ＡＴＰｌ３Ａ２被认为是早发型常染色体隐性遗传帕金森病的致病 性基因。据我们所知，帕金森病通常被划分成早发型ＰＤ（ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ＰＤ，ＥＯＰＤ）和 晚发型ＰＤ（１ａｔｅ―ｏｎｓｅｔ ＰＤ，ＬＯＰＤ），家族性和散发性，以及常染色体显性遗传和隐性 遗传．大多数文献把发病年龄小于５０岁的帕金森病定为早发型。在１９９７年，通过连锁分析Ｐ破ｉＩｌ基因被Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ等锁定在染色体６ｑ２５．２一ｑ２７。Ｐａｒｋｉｎ基因突变在ＥＯＰＤ中具有很高的检出率。在亚洲，韩国、中国以及台 湾地区都对ｐａｒｋｉｎ基因有过研究报道。ＣｈｕｎｇＥＪ等采用基因定量分析的方法在９４ 例ＥＯＰＤ中发现３例患者携带ｐａｒｋｉｎ基因的复杂杂合突变；Ｇｕｏ ＪＦ等采用直接测ＩＩ浙江大学硕士学位论文摘要序和实时定量ＰＣＲ的方法对２９个中国家系的４５例ＥＯＰＤ患者的ＤＮＡ进行分析， 发现１４个家系中的２５例患者携带不同类型的ｐａｒｋｉｎ基因突变，包括点突变、杂 合突变、纯合突变以及复合型杂合突变；Ｗｕ ＲＭ等在４ｌ例ＥＯＰＤ中发现４例患 者携带ｐａｒｋｉｎ基因的突变。 ＰＩＮＫｌ基因是在研究肿瘤抑制物ＰＴＥＮ的作用机制过程中被发现的．到目前， 文献报道ＰＩＮＫｌ基因的外显子重排突变极其罕见，主要是点突变。因此，针对ＰＩＮＫｌ 基因的突变分析，大多采用变性高效液相色谱技术（ＤｅｎａｔｕｒｉｎｇＬｉｑｕｉｄ Ｈｉｇｈ ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＤＨＰＬＣ）和直接测序的方法。ＰＩＮＫｌ基因突变率在不同的族群中有所不同，基本在ｌ％一９％，成为继ｐａｒｋｉｎ之后，ＥＯＰＤ的第二常见突变基因。 目前国内对ＥＯＰＤ患者的ｐａｒｋｉｎ和ＰＩＮＫｌ基因的突变分析报道仍很少见，且 缺乏对基因突变和临床表型之间的相关分析。因此，对中国ＥＯＰＤ患者的ｐａｒｋｉｎ 和ＰＩＮＫｌ基因的突变筛查以及相关临床特征的分析显的很有必要．目的：运用ＤＨＰＬＣ和直接测序的方法分析研究中国ＥＯＰＤ患者ｐａｒｋｉｎ和ＰＩＮＫｌ基 因点突变情况，以及运用实时定量ＰＣＲ分析ｐａｒｋｉｎ基因外显子重排突变，并探讨 ＰＤ患者基因型与临床表型之间关系。方法：按照以下标准在浙江大学医学院附属第二医院神经内科收集６９例ＥＯＰＤ患 者，（１）发病年龄小于５０岁；（２）至少具备帕金森病四项特征性症状中两项（静止性 震颤、运动迟缓、肌肉强直、姿势障碍）；（３）对左旋多巴治疗有好的反应；（４）排除 由其他神经系统疾病或药物或毒性物品引起的继发性帕金森病患者。首先，采用¨Ｉ浙江大学硕士学位论文摘要实时定量ＰＣＲ的方法检测ｐａｒｋｉｎ基因１２个外显子的重排突变；对没有重排突变 或只有杂合重排突变的外显子再作ＤＨＰＬＣ分析和直接测序排除ｐａｒｋｉｎ基因点突 变；最后，对仍未查到突变或只有杂合突变的病例作ＤＨＰＬＣ分析和直接测序筛查 ＰＩＮＫｌ基因的点突变。结果：第一：应用荧光定量ＰＣＲ方法发现１９例ＰＤ患者具有ｐａｒｌａ＇ｎ基因不同外显子 的重排突变。其中， Ｍ６３０和Ｍ６３１患者为两姐妹都为３号、４号和７号外显子的杂合缺失；Ｍ５患者含有３号和４号外显子的纯合缺失；Ｍ６患者含有２号、６号 外显子的杂合缺失；Ｍ１０患者含有４号外显子纯合缺失；Ｍ３０患者６号外显子杂 合缺失和１１号外显子杂合重复；另外，６例患者含有单－；，１－显子的杂合缺失；７ 例患者含有单－Ｙｌ－显子的杂合重复。 第二：应用ＤＨＰＬＣ和直接测序的方法在一例患者的ｐａｒｋｉｎ基因上发现一新 的呈杂合状态的单一碱基变异位点ｃ．２Ｔ＞Ｃ 因上发现多个ＳＮＰｓ。 第三：临床上，在含有纯合突变或复合杂合突变的患者中，其ＰＤ起病时常为 双侧对称出现症状，如抖动，肌肉强直、运动迟缓。有突变（包括单一杂合突变） 的患者起病年龄明显早于不含突变的患者。０．Ｍ１Ｔ），另外，在ｐａｒｋｉｎ和删基结论：第一：在本组患者中，ｐａｒｋｉｎ基因的突变率为２８％，低于大多文献报道的５０％， 很可能是因为我们选的患者多是散发性的，而不是家族性ＰＤ。 第二：除了ＳＮＰ外，本研究在ＰＩＮＫｌ基因上没有发现突变，这正是说明了Ⅳ浙江大学硕士学位论文摘要ＰＩＮＫｌ基因的低突变率，而且在我国的ＰＤ患者中尤为低． 第三：有ｐａｒｋｉｎ基因突变的患者除了ＰＤ起病年龄明显早于无ｐａｒｋｉｎ基因突 变的患者外，没有其他区别于无ｐａｒｋｉｎ基因突变患者的特异临床症状，所以从临 床表现上无法去判断ＰＤ患者是否含有ｐａｒｋｉｎ或ＰＩＮＫｌ基因的突变．关键词：帕金森病ｐａｒｋｉｎ基因ＰＩＮＫｌ基因荧光定量ＰＣＲ ＤＨＰＬＣ突变分析Ｖ浙江大学硕士学位论文摘要Ｍｕｔａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｐａｒｋｉｎ ａｎｄＰＩＮＫｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ－－ｏｎｓｅｔＰａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ＣｈｉｎａＳｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｚｈｅｊ ｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ：Ｚｈｅｎｇｘｉａｎｇ Ｈｕ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．Ｂａｏｒｏｎｇ ＺｈａｎｇＡｂｓｔｒａｃｔ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｗｉｔｈａｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）ｉｓｏｎｅｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １％ａｍｏｎｇ ｐｅｒｓｏｎｓ ｏｌｄｅｒ ｔｈａｎ ６５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ａｇｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ＰＤ ｉｎｃｌｕｄｅ ｒｅｓｔｉｎｇ ｔｒｅｍｏｒ，ｒｉｇｉｄｉｔｙ，ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａａｎｄａｇｏｏｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｅｖｏｄｏｐａ；ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｒｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｎｉｇｒａ ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｓｕｒｖｉｖｉｎｇｎｅｕｒｏｎｓｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ．ａｒｅＴｏ ｄａｔｅ，ｔｈｅ ｄｅｆｉｎｉｔｅ ｒｅａｓｏｎ ｏｆ ＰＤ ｉｓ ｕｎｋｎｏｗｎ，ｂｕｔ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｇｅｎｅｓ ＰＤ―ｃａｕｓｅｄｒｅｇａｒｄｅｄａｓｆａｃｔｏｒｓ，ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｇｅｎｅｓｏｆａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵＣＨ－Ｌ１，ａｎｄ ＬＲＲＫ２ａｒｅｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｃａｕｓａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｓｆａｍｉｌｉａｌ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ＰＤ，ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｃａｕｓａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒｏｆｐａｒＭｎ，ＰＩＮＫｌ，ＤＪ－１，ａｎｄ ＡＴＰｌ３Ａ２ ａｒｅａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔＰＤ．Ｔｏｏｕｒｋｎｏｗｌｅｄｇｅ，ＰＤ ｉｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ＰＤ（ＥＯＰＤ）ａｎｄ ｌａｔｅ?ｏｎｓｅｔ ＰＤ（ＬＯＰＤ），ｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ ＰＤ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉｃ ＰＤ，ｏｒ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ＰＤ ａｎｄ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ＰＤ．Ｏｎｓｅｔ ａｇｅ ｏｆ ＰＤ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ５０ｙｅａｒｓ Ｗａｓｄｅｆｉｎｉｔｅｄ ａｓＥＯＰＤ ｉｎ ｍｏｓｔ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｓ．ｔｏＩｎ １ ９９７，ｐａｒｌａ＇ｎ ｂｙ ｌｉｎｋａｇｅｇｅｎｅ Ｗａｓ ｍａｐｐｅｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ６ｑ２５．２?ｑ２７ ｂｙ Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ ｅｔ ａ１．ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｐａｒｋｉｎ ｇｅｎｅ ｉｓ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈａｍｏｎｇ ＥＯＰＤ．Ⅵ浙江大学硕士学位论文摘要Ｅｘｃｅｐｔｉｎｇ Ｊａｐａｎ ｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐａｒｋｉｎＡｓｉａ，Ｃｈｉｎａ，Ｋｏｒｅａ，ａｎｄｇｅｎｅ ｉｎ ＥＯＰＤＴａｉｗａｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ａｌｓｏ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＥＪｅｔｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｈｕｎｇａ１．ｄｅｔｅｃｔｅｄｃｏｍｐｏｕｎｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ３ ｐａｔｉｅｎｔｓａｍｏｎｇ ９４ ＥＯＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｄｏｓａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ；Ｇｕｏｅｔａ１．ａｎａｌｙｚｅｄ４５ ＥＯＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ 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ｐａｒｋｉｎ ｉｎａｎｄ ＰＩＮＫｌｐａｔｉｅｎｔｓＺｈｅｊ ｉａｎｇ ａｎｄｐｒｏｖｉｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｇｅｎｏｔｙｐｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｓｖｅｒｙ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ．ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐａｒｋｉｎａｎｄ ＰＩＮＫｌｇｅｎｅｓ ｉｎ ＥＯＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐａｒｋｉｎ ｇｅｎｅＺｈｅｊｉａｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ｗｉｔｈ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｈｉｇｈ ｄｉｒｅｃｔ―ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｘｏｎ（ＤＨＰＬＣ）ａｎｄｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ａｌｓｏ ｗｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ．ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄＶ¨浙江大学硕士学位论文摘要Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｗｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ６９ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｃｒｉｔｅｒｉａ：（１）ａｇｅａｔｏｎｓｅｔ＜５０ ｙｅａｒｓ；（２）ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｗｏ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｃａｒｄｉｎａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ（ｒｅｓｔｉｎｇ ｔｒｅｍｏｒ，ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ，ｒｉｇｉｄｉｔｙａｎｄ ｐｏｓｔｕｒａｌｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）；（３）ａｇｏｏｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｅｖｏｄｏｐａ；（４）ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｏｔｈｅｒ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｅｏｒｋｎｏｗｎ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｐａｒｋｉｎｏｒｔｏｘｉｎｓ．Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｗｅｒｅａｌ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｏｎｌｙ ｏｆｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ １ ２６９ ｐａｔｉｅｎｔｓ；ｔｈｅｎｅｘｏｎｓｇｅｎｅ ｗｉｔｈｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｉｎｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈＤＨＰＬＣｏｒｄｉｒｅｃｔ―ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃａｒｒｙ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃａｒｒｙ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ；ｌａｓｔｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ８ｎｏｔ ｃａｒｒｙｅｘｏｎｓＰＩＮＩＫｌ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ｄｉｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｒｏｎｌｙ ｃａｒｒｙ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓＲｅｓｕｌｔｓ：Ｆｉｒｓｔ，ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ ｔｉｍｅｅｘｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰｅＲ，ｗｅ ｆｏｕｎｄｔｈａｔ １ ９ｃａｓｅｓｃａｒｒｉｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｒｋｉｎ ｇｅｎｅ．Ｍ６３０ ａｎｄ Ｍ６３ １ｅｘｏｎａｒｃｓｉｓｔｅｒｓ，ｂｏｔｈ ｃａｒｄｅｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｅｘｏｎ３，４，ａｎｄ７ｏｆｐａｒｋｉｎ；Ｍ５ｃａｒｄｅｄ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓｅｘｏｎ３ａｎｄ ４ ｏｆｐａｒｋｉｎ；Ｍ６ｃａｒｒｉｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎｅｘｏｎ２ａｎｄ６ ｏｆｐａｒｋｉｎ；Ｍ１ ０ｃａｒｒｉｅｄ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎｅｘｏｎ４ ｏｆｐａｒｋｉｎ；Ｍ３０ ｃａｒｒｉｅｄｅｘｏｎｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅｓｅ，６６ａｎｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ１ １ ｏｆ ｐａｒｋｉｎ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏｅｘｏｎｃａｓｅｓｃａｒｒｉｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅｅｘｏｎｏｆ ｐａｒｋｉｎ；ａｎｄ ７ｃａｓｅｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉ ｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅＳｅｃｏｎｄ，ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｇｅｎｅ ｉｎｏｎｅ ａｏｆｐａｒｋｉｎ． ｐａｒｋｉｎｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｅ．２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｍ １ Ｔ）ｉｎｐａｔｉｅｎｔ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＤＨＰＬＣ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｓｅｖｅｒａｌ ＳＮＰｓｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｐａｒｋｉｎ ａｎｄ ＰＩＮＫｌ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｉｒｄ，ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓＶｉｌｉ ｏｒｃｏｍｐｏｕｎｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ浙江大学硕士学位论文摘要ｐａｒｋｉｎ ｇｅｎｅ ｍｏｓｔｌｙ ｈａｄａｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｏｎｓｅｔ，ｓｕｃｈａｓｒｅｓｔｉｎｇ ｔｒｅｍｏｒ，ｒｉｇｉｄｉｔｙａｎｄ ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ；ａｎｄ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ａｇｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｌ＇ｋｉｎ ｉｓ ｅａｒｌｉｅｒｔｈａｎ ｔｈａｔｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｒｋｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｆｉｒｓｔ，ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｐａｒｋｉｎ ｉｓ ２８％ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｌｏｗｅｒｔｈａｎ５０％ｉｎＰＤ，ｎｏｔｍａｎｙｏｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅａｓｏｎ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｉｓ：ｍｏｓｔ ＰＤ ｉｎｏｕｒｐａｔｉｅｎｔｓ ａｒｅｓｐｏｒａｄｉｃｆａｍｉｌｉａｌｓｔｕｄｙ．Ｓｅｃｏｎｄ，ｅｘｃｅｐｔｉｎｇ ＳＮＰ，ｎｏ ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ＰＩＮＫｌ ｇｅｎｅ，ｔｈｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆＰＩＮＫｌ ｉｓ ｖｅｒｙ ｌｏｗ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｈｉｒｄ，ｔｈｅｏｎｓｅｔ ａｇｅ ｏｆ ＰＤ ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ ｐａｒｋｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅａｒｌｉｅｒｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐａｒｋｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ，ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｉｓ，ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｆｅａｔｕｒｅ，ＳＯ ｗｅｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌｏｒｃａｎｎｏｔｊｕｄｇｅｗｈｅｔｈｅｒａｐａｔｉｅｎｔ ｈａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｒｋｉｎＰＩＮＫｌ ｇｅｎｅａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ；ｐａｒｋｉｎ；ＰＩＮＫＩ；ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｃｈｉｎｅｓｅ浙江大学硕士学位论文缩略词表缩略词表ＰＡＧＥｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ聚丙烯酰胺凝胶电泳Ｘ浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿态堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。…一龋钎…屹和…日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：乙争妒丫日导师签名：签字日期：２，ｆ夕年签字日年、月弋日浙江大学硕士学位论文致谢致谢由衷感谢我的导师张宝荣教授在两年半的研究生生涯里给予我的谆谆教诲和 悉心指导．导师渊博的知识、精湛的医术以及在面对疑难病症时所表现出的缜密 的逻辑分析能力使我敬佩，也激起了我对医学的浓厚兴趣。导师刻苦求实、一丝 不苟的科学态度使我敬畏，也无形中帮助我养成了严谨、求是的科学作风。 感谢浙二神经内科丁美萍教授、宋水江主任医师以及科室所有老师同学对我 学习的指导和帮助。 感谢罗巍老师、殷鑫浈老师、赵国华老师、刘志蓉老师、欧阳志远老师给予 我无私的帮助。 感谢师姐李盈枝博士、严雅萍博士在实验过程中给予的悉心指导。 感谢浙江大学肿瘤研究所蔡善荣老师、方永明老师、蒋文智老师以及肿瘤研 究所所有老师和同学对我在实验过程给予的帮助和支持。感谢胡涵光博士、张旭 照博后帮助解决实验过程中遇到的问题。感谢我的师弟雷小光，师妹蔡苗、浦佳 丽在实验过程中给予的帮助和通力合作。 感谢我的父亲、母亲、我的妻子宋玮钕以及所有我的家人和朋友，正是他们 在生活上、学＞－ｊ上给予的无微不至的关怀激励着我全身心投入到课题研究和实验中。浙江大学硕士学位论文引言中国早发性帕金森病患者的 ｐａｒｋｉｎ和ＰＩＮＫｌ基因突变分析及临床特征浙江大学医学院 硕士研究生 导 师神经病学胡正祥 张宝荣教授１引言帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是一种常见的神经退行性疾病，以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为病理特征。英国人Ｊａｍｅｓ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ于１８１７ 年在他的一篇关于震颤麻痹的随笔中首次对帕金森病作了比较详细的描述。目前 帕金森病的临床表现主要被归纳为两个方面：运动症状和非运动症状。运动症状 有静止性震颤、运动迟缓、姿势平衡障碍和肌强直；非运动症状有植物神经症状、 认知改变和精神异常。ＰＤ的好发人群为６５岁以后的老年人，但是仍有５％的ＰＤ 患者在４０岁以前发病【１１．在欧洲，４５岁以前发病的ＰＤ患者中，１８％１均散发性患 者和４９％１均家族性患者能够检测到ｐａｒｋｉｎ基因的突变【２，３１。ＰＤ的病因仍然处于探 索阶段，但普遍认为是环境因素与遗传因素相互作用的结果【４１，而年龄很可能是导 致具有遗传易感性个体发生神经退行性变和ＰＤ最重要的环境因素【５１．近些年，越 来越多关于ＰＤ遗传因素方面的发现被报道，至今已有十五个基因位点的突变被发 现可以引发ＰＤ（表１．１）。 从以往的报道发现有ｐａｒｋｉｎ和ＰＩＮＫｌ基因突变的帕金森病患者与不含突变的 帕金森病患者相比，从临床表现上很难区别．有突变患者其最明显的临床特点是 起病年龄早，其它的还包括更倾向于双侧肢体对称起病，对左旋多巴治疗的效果浙江大学硕士学位论文引言更好，而且疾病进展更为缓慢【２１１。Ｌｕｃｋｉｎｇ及其同事还发现有ｐａｒｋｉｎ基因突变的患 者出现痴呆的几率会比没有突变的ＰＤ患者低【２２１． Ｐａｒｋｉｎ基因自从首次在常染色体隐性遗传的青少年型帕金森病人群中被识别 后［２３１，在这一基因序列上已经有越来越多的新突变被相继报道．许多研究显示 １８％．４９％的早发型ＰＤ（Ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔＰａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＥＯＰＤ）患者归因于ｐ枷ｎ蛋白功能的丧失【２１。很多突变类型在ｐａｒｋｉｎ基因上被发现，包括错义突变、无义突 变、外显子重排突变（有外显子缺失、双重重复和多重重复）１２４］。 表１．１帕金森病的致病基因２浙江大学硕士学位论文引言Ｐａｒｋｉｎ基因是杂合还是纯合突变影响着ＰＤ的发病年龄，含有ｐａｒｋｉｎ基因纯合 突变的患者，其平均发病年龄最早；只有一个等位基因发生突变的杂合突变患者，其发病年龄相对较晚；而ｐａｒｋｉｎ基因没有突变的患者发病年龄最列２引。但是，ｐａｒｋｉｎ基因突变无论阳性还是阴性，其与是否患病还没有必然的因果关系，ｐａｒｋｉｎ基因突 变阴性的个体并不能排除可能患ＰＤ的风险，而ｐａｒｋｉｎ基因突变阳性的个体也不能 认为其一定会患上ｐＤ［２６１。 Ｐａｒｋｉｎ蛋白作为一种Ｅ３泛素连接酶参与到泛素蛋白酶体路径中，催化对异常 蛋白的泛素化标记，促进蛋白酶体对异常蛋白的降解。Ｐａｒｋｉｎ基因的突变能够削 弱连接酶的活性，从而导致ｐａｒｋｉｎ的底物蛋白在细胞内堆积，这些异常蛋白的堆 积对神经元细胞，特别是多巴胺能细胞有明显的毒害作用［２７１。 临床上，ｐａｒｋｉｎ基因突变引起的ＥＯＰＤ很难与没有基因突变或其他基因突变 的ＰＤ区分开。有几个对日本家系的报道描述了这种ＰＤ的临床表现，除了发病年 龄早外，还有发病时就有肌张力障碍，腱反射亢进，左旋多巴治疗早期出现一系 列并发症等［７，２２，２８】。 为了全面检测ｐａｒｋｉｎ基因突变，目前国外普遍应用直接测序结合定量ＰＣＲ方 法进行ｐａｒｋｉｎ基因的突变分析。ＬｉｖａｋＫＪ和ＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎＴＤ对ｐａｒｋｉｎ基因外显子重 排突变的检测方法给予了详细的介绍【２９１。其中，以相对荧光定量ＰＣＲ的方法应用 最多，用此方法不用得到ＰＣＲ绝对的拷贝数，而只需要计算待测基因相对某个管 家基因的扩增差异即可，扩增差异通常采用２’△Ｍ法来计算。对ｐａｒｋｉｎ基因点突变 的检测则通过ＰＣＲ扩增后进行直接测序，也有将ＰＣＲ产物先作单链构象多态性分析（Ｓｉｎｇｌｅ．Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）或变性高效液相色谱技术 （Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｈｉｇｈ ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＤＨＰＬＣ）分析，然后把发现的异常ＰＣＲ产物进行测序。 ＰＩＮＫＩ基因是在一次研究肿瘤细胞表达谱的实验中被发现的，其转录活性受３浙江大学硕士学位论文引言ＰＴＥＮ的调节１３０１。Ｐ１－ＮＫｌ基因含有８个外显子，其ｃＤＮＡ长１．８ｋｂ，编码含５８１个 氨基酸的蛋白．在蛋白的氨基端含有线粒体靶向传输序列，蛋白中段为高度保守 的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结构域，Ｖａｌｅｎｔｅ等通过对西班牙和意大利三个近亲结婚 家系的突变研究，发现并首次报道了ＰＩＮＫｌ基因上的点突变【１０】。到目前，被报道 的ＰＩＮＫｌ突变绝大多数为错义或无义点突变【３１１，但“等在２００５年报道了一大片段纯合缺失的家系，缺失范围包括第６至８号外显子【３２】。在华人人群中，删基因突变多分布在第２，３，４，５，７号外显子上［３３－３５】。 ＰＩＮＫｌ蛋白在全身各组织中都有表达，且含有线粒体靶向序列，定位于线粒体 基质和膜间隙中。但，到目前为止，这一蛋白的功能还不清楚。普遍公认的ＰＩＮＫｌ 的底物蛋白还没有发现。Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ等【３６１和Ｓｉｍ等【３７】发现Ｃ端截断的ＰＩＮＫｌ蛋白或 ＰＩＮＫｌ蛋白突变体会下调丝氨酸／苏氨酸激酶活性，并产生不同的自身磷酸化模式。 体外实验发现野生型ＰＩＮＫｌ基因的过表达能够防止星形孢菌素诱导的线粒体细胞 色素ｃ的释放，从而阻止细胞凋亡的发生，而这一功能因ＰＩＮＫｌ基因的突变而丧 失【３８１。果蝇实验，ｓｉＲＮＡ或致病突变会引起ＰＩＮＫｌ功能丧失，从而导致肌肉和多 巴胺能细胞的变性，而这种变性能够通过ｐａｒｋｉｎ基因的过表达得到补救１３９－４１】。而 且，ＰＩＮＫｌ功能丧失引起的氧化损害会激发抗氧化因子ＤＪ一１的表达，通过ＤＪ．１ 的过表达帮助ＰＩＮＫｌ使线粒体形态和含量维持在一个稳定的水平【４２１。这些现象提 示ｐａｒｋｉｎ，ＰＩＮＫｌ，ＤＪ一１在线粒体正常形态的维护以及功能调节上都具有很重要的作用。本研究对浙江大学医学院附属第二医院神经内科收集到的ＥＯＰＤ患者进行基因分析，通过荧光定量ＰＣＲ，ＤＨＰＬＣ和直接测序的方法检测ｐ口砌基因在这一群体中突变率，根据以往对华人人群的突变研究发现ｐａｒｋｉｎ基因点突变主要分布于第 ２，７，ｌｌ，１２号外显子【３３＇３４’４３舢】，对这些外显子区域，本实验采用了直接测序，其余外 显子采用ＤＨＰＬＣ。对ＰＩＮＫｌ基因的突变分析，目前多采用直接测序检测点突变，４浙江大学硕士学位论文引言也有结合实时荧光定量ＰＣＲ，检测ＰＩＮＫｌ基因外显子重排突变，但重排突变的检出率很低，在本研究未作ＰＩＮＫｌ基因的重排分析．鉴于华人人群中胱，基因突变多分布在第２，３，４，５，７号外显子上１３３－３５ｌ，在本研究中采用直接测序的方法对ＰＩＮＫｌ 基因第２，３，４，５，７号外显子进行点突变的分析，而对第１，６，８号外显子采用 ＤＨＰＬＣ分析。５一一 ――――――――――――――――――――――――――’――――――――――――――――――――――――――――――一塑坚奎堂堡主兰垡垒苎实验材料、方法以及结果 ：：二：：：：：：：：＝：：＝：：＝：：：２实验材料、方法以及结果２．１ＥＯＰＤ患者ｐ口心觑基因外显子重排突变与点突变的分析２．１．１实验材料 ２．１．１．１主要实验仪器 １）移液器 ２）水平振荡仪 ３）台式离心机 ４）６００Ａ医用低速离心机 法国Ｇｉｌｓｏｎ公司ＬａｂｎｅｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公司上海安亭科学仪器厂安新县白洋离心机厂５）台式高速离心机Ｈｅｒａｅｕｓ公司 ６）２Ｄ一９５５６水平摇床 ７）微量电子天平 ８）微波炉９）ＲＮＡ／ＤＮＡＣａｌｃｕｌａｔｏｒ太仓市科教器材厂 北京赛多利斯科学仪器公司ＬＧ ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ公司１０）ＰＣＲ循环机 １１）垂直电泳槽 １２）水平电泳槽１３）电泳仪Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司 Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司 北京六一仪器厂Ｅ―Ｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ１４）凝胶图像分析仪 １５）实时荧光定量ＰＣＲ仪１６）ＤＨＰＬＣ美国ＡＢＩ公司Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ公司２．１．１．２实验试剂及耗材１）０．１一ｌＯｕｌ ２）１０―１００ｕｌ６ｐｉｐｅｔ Ｔｉｐ ｐｉｐｅｔ ＴｉｐＡｘｙｇｅｎ公司 Ａｘｙｇｅｎ公司浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果３）１ ００一１０００ｕｌｐｉｐｅｔ ＴｉｐＡｘｙｇｅｎ公司 Ａｘｙｇｅｎ公司４）０．２ｍｌ ＰＣＲ管 ５）１．５ｍｌ ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管Ａｘｙｇｅｎ公司ＣｏｍｉｎｇＩｎｅ．６）１５ｍｌ一次性离心管 ７）５０ｍｌ一次性离心管 ８＿）一次性ＰＥ手套 ９）Ａｒｉｓｔａ无粉橡胶手套１０）２．５ｍＭ ｄＮＴＰ １１）１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １２）２ｘＧＣ ｂｕｆｆｅｒ１ ３）２５ｍＭＣｏｍｉｎｇ Ｉｎｃ．上海都德利塑料制品公司ＡｒｉｓｔａＬａｔｉｎｄｏ公司Ｔａｋａｒａ公司 Ｔａｋａｒａ公司 Ｔａｋａｒａ公司 Ｔａｋａｒａ公司 Ｔａｋａｒａ公司Ｍｇｃｌ２１ ４）ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １５）ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００Ｔａｋａｒａ公司１ ６）６ｘＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１７）丙烯酰胺 １８）Ｎ，Ｎ’．亚甲双丙烯酰胺 １９）过硫酸铵２０）冰醋酸 ２１）无水乙醇 ２２）Ｉ甲醛溶液日本三菱株式会社 日本三菱株式会社 日本三菱株式会社 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 烟台三和化学试剂Ｉｎｃ． 杭州高晶精细化工Ｉｎｅ． 天津市大茂化学试剂厂 中国上海试剂一厂上海生工生物工程Ｉｎｃ．７２３）三氯甲烷 ２４）氢氧化钠２５）硝酸银 ２６）１四甲基二乙胺ＴＥＭＥＤ浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果２７）ＥＤＴＡ ２８）蛋白酶Ｋ ２９）琼脂糖２．１．１．３上海博亚生物技术Ｉｎｃ． 上海博亚生物技术Ｉｎｃ．Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ Ｉｎｃ．常用实验试剂的配制１）１ ０ｘＲＢＣ裂解液ＮＨ４ＣｌＫＨＣ０３ ＥＤＴＡ ８２．９９ １０．０９ ０．３７９加ｄＨ２０至ｌＯＯＯｍｌ（高压灭菌，４。Ｃ保存） ２）ｌｘ细胞核裂解液２Ｍ ４ＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ ＮａＣｌ ＥＤＴＡ０．５ｍｌ １０ｍｌ １０ｍｌＯ．１Ｍ加ｄＨ２０至１００ｍｌ（高压灭菌，４。Ｃ保存）３）蛋白酶Ｋ溶液蛋白酶Ｋ１００ｍｇ加ｄｄＨ２０至５ｍｌ（一２０。Ｃ保存）４）ＤＮＡ电泳液５０ｘＴＡＥ电泳缓冲液＂Ｉ ｒｉｓ ２４２．２９冰醋酸 ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（Ｐｈ８．Ｏ）５７．０ｍｌ１ ００ｍｌ调ｐＨ至８．０，ｄｄｎ２０定容至１０００ｍｌ１０ｘＴＢＥ电泳缓冲液８浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果瓢ｓ硼酸１０８９ ５５９０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．Ｏ）４０ｍｌ加ｄｄＨ２０定容至１０００ｍｌ ５）聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＧＥ）ｄＥ泳使用试剂配制 ３０％丙烯酰胺丙烯酰胺２９９Ｎ，Ｎ’一亚甲双丙烯酰胺ｌｇ加ｄｄＨ２０至１００ｍｌ室温避光保存１０％过硫酸铵过硫酸铵加ｄｄＨ２０至１０ｍｌ ４０Ｃ避光保存６％非变性胶３０％丙烯酰胺１０ｘＴＢＥ６ｍｌ １．５ｍｌ３００ｕｌ１０％过硫酸铵加ｄｄＨ２０定容至３０ｍｌ ＰＡＧＥ胶固定液 无水乙醇 冰醋酸 加一蒸水至５００ｍｌ５０ｍｌ ２．５ｍｌＰＡＧＥ胶染色液硝酸银 加一蒸水至５００ｍｌ９１９浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果ＰＡＧＥ胶显色液ＮａＯＨ ３．７５９ ２．７ｍｌ甲醛（３０％） 加一蒸水至５００ｍｌ ６）２％琼脂糖胶琼脂糖粉１×ＴＡＥ０．８９ ４０ｍｌ２．１．２实验方法 ２．１．２．１研究对象和基因组Ｉ）ＮＡ的提取２．１…２１１研究对象６９例ＥＯＰＤ患者，主要根据以下标准进行收集：（１）患者的临床表现必需具备 帕金森病四主症中的两项（静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势障碍）；（２）对左旋 多巴治疗效果明显；（３）发病年龄小于５０岁．但，由其他神经变性疾病、脑炎、反 复脑卒中、外伤、有毒物或药物引起的继发性帕金森病患者不包括在内。所有患 者均为２００３年一２００７年浙江大学医学院附属第二医院神经内科所收集的病例，除５ 例来自江西，２例来自安徽，其他６２例都是浙江的ＰＤ患者。所有患者的神经系 统检查均由擅长于运动障碍疾病诊断的神经病学专家执行．在一级或二级亲属中 有ＰＤ的患者被认为是家族性ＰＤ，其余患者被认为是散发性ＰＤ，依据这一界定， １７例患者为家族性ＰＤ，５２例患者为散发性ＰＤ。其中家族性ＰＤ的起病年龄为８．４７ 岁，平均起病年龄（ｍｅａｎ＿－ｋＳＤ）为２８．９４－１２岁，患病时间为３．３４年不等（平均１２．２４－８．６ 年）；散发性ＰＤ的起病年龄为１５―４９岁，平均年龄为３８．３４－８．９，患病时间为２．３５ 年（平均９．６＋５．８年）。 １１０例正常对照，在同一医院收集，神经系统检查由同一个神经病学专家执行。 １ｌＯ例对照均无ＰＤ，或其他神经变性疾病。另有３例由中南大学湘雅医学院提供的１０浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果ＰＤ患者ＤＮＡ样本，他们分别含有ｐａｒｋｉｎ基因２号、３号和４号外显子的杂合缺 失．２．１…２１２基因组ＤＮＡ的提取和纯化以及ＤＮＡ浓度测定苯酚／氯仿法抽提外周血ＤＮＡ： （１）将患者的外周血（ＥＤＴＡ抗凝）６－８ｍｌ，倒入５０ｍｌ的离心管中，再加入３倍体 积的１×红细胞裂解液，颠倒混匀后常温下静置１５分钟。 （２）等混合液变透明后，３０００转／分离心１０分钟。 （３）离心后在管底可见有白色沉淀，将上清液倒掉，在其中加入３ｍｌ １×细胞核裂解 液，在振荡器上充分振荡混匀后，再在其中加入３００９ｌ的２０％ＳＤＳ液和４０ｐ，１ 的蛋白酶Ｋ，充分混匀后放入３７＂（２的摇床中过夜或至少６小时。 （４）将蛋白酶Ｋ消化后的样本取出，加入等体积饱和酚３ｍｌ，充分颠倒混匀后，３０００ 转／分离心１０分钟，可见液体分层，用剪过头的１．５ｍｌ的ｔｉｐ头将上清液移入１５ｍｌ 离心管中，再在其中加入饱和酚１．５ｍｌ和氯仿１．５ｍｌ，充分混匀后３０００转／分离 心１０分钟，再将上清液移入１５ｍｌ离心管中，加入３ｍｌ氯仿混匀，３０００转／分 离心１０分钟。 （５）取１５ｍｌ离心管，在其中加入９―１０ｍｌ左右的一２０。Ｃ无水乙醇，将离心好的样本 的上清液移入无水乙醇中，轻轻晃动，看见有白色絮状沉淀析出。用剪头ｔｉｐ 将该沉淀吸出，装入１．５ｍｌ ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，再用无水乙醇清洗后，加入ｌｍｌ无 水乙醇，置．７０。Ｃ冰箱保存。 基因组ＤＮＡ的纯化： 从．７０＊（２冰箱中取出待纯化样本，１２０００转／分离心１０分钟，倒去上清；加入７５ ％乙醇ｌｍｌ，１２０００转／分离心ｌｏ分钟，倒去上清后再加７５％乙醇ｌｍｌ，１２０００ 转／分离心２－３分钟，倒ｋＪ：清，点离，将剩余的乙醇用１０ｕｌ的ｔｉｐ头移出，然 后于室温下凉ｌＯ分钟左右，加入双蒸水３００ｕｌ溶解，置一２０。Ｃ冰箱保存备用。ｌｌ浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果基因组ＤＮＡ浓度测定： （１）取ＤＮＡ溶液５ｕｌ，加双蒸水９５ｕｌ稀释标本２０倍，混匀。 （２）以双蒸水做空白，在紫外分光光度计上测标本的ＯＤ２６０值． （３）计算ＤＮＡ浓度 ＤＮＡ浓度（ｎｇ／ｕ１）＝ＯＤｚ６０×５０×２０ （４）根据所测ＤＮＡ浓度，用双蒸水稀释标本至６０ｎｇ／ｕｌ。 ２．１．２．２引物设计 作ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ定量ＰＣＲ时，Ｐａｒｋｉｎ基因各外显子引物和探针的来源说明如下： １号外显子的引物和探针由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司设计提供；其余１１个外显子的引物和探针采用Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ２．０软件（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）设计产生；内参基因ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ的引物和探针从参考文献获得【４５１。探针的５’端为荧光基团Ｆａｍ，３’端为淬灭基团 Ｔａｍｒａ。引物和探针序列见表２．１。表２．１ｐａｒｋｉｎ基因定量ＰＣＲ用引物和探针序列浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果１３浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果Ｐａｒｋｉ挖基因作点突变检测时所用到的引物序列与张宝荣等的相同【４７１，具体引 物序列见表２．２。 表２．２ ｐａｒｋｉｎ基因点突变检测用引物序列（５’－３’）片段大外显子正向引物ＣＧＣＧＴＴＡＧＡ ＡＣＴＡＣＧＡＣＴＣＣ ＣＧＧＴＩ＇ＧＡＧＡＡ反向引物小（ｂｐ）３０９ ３００１ ２Ａ＝ｒＧＴ眦ＴＡＴＣＴＡＡＡｎ盯ＧＣＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧ３９５２０５５ＴＧＧＡＡＡＣＡｒＧＴＣＴｌＡ ＡＧＧＡＧＴＡＣＡ ＴＴＧＡＣＡｒｒｒｒｌ３ＴＣＴＣＴＡ Ａ１１ＴＣＣＴＧ２４３ ２６４６ ７ＣＧＧＧ啜Ｃｃ蹑Ｇ忑吼Ｇ忑Ｑ陬ＧＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡ（１．ＧＡＣＡＧＧＴＡＧ－ＣＴＣＧＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＡＴＡ Ａ Ａ Ｋｎ℃ＴＴＣＴＧＣＴＡＧＧＧ下ｎ’ＡＣＧ２９６８ ９ＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＧ ＴＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＡＣ觚ＡＴＧＣＡ ＡＡ ＡＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡ ＧＧＡＡＣＩ℃ＴＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＡ２１７ ２５０１０ １１ＴＴＧＣＣＡＡＡｒＩＧＣＡＡＣＣＴＡＡＴＧ２２３ ２５０ ２４２ＧＣＴＧＡＧＡ丌ＡＡＡＣＧＣＣＴ丌ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴｒｒＧＴＩｖ兀℃ＣＡＧＡＣＡＧＣＡ：ｒＣＴＣＣＴ订ＡＡＴＣＣｌ２以上引物及探针均由上海英骏生物技术有限公司合成，将装有引物及探针粉 剂的ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管；以１２０００转／分低温离心２０分钟，使引物或探针粉末充分沉着于 管底，然后加入适量双蒸水使引物及探针工作液浓度达到ｌＯｐｍｏｌ／ｕｌ，充分震荡混 匀后置．２０＂Ｃ冰箱保存备用。 ２．１．２．３实时定量ＰＣＲ对ｐａｒｋｉｎ基因重排突变的分析２．１…２１４３ １实时定量ＰＣＲ反应体系及反应条件浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果实时定量ＰＣＲ反应体系： 体系总体积１ ０ｘＢｕｆｆｅｒ ２５ｕｌ２．５ｕｌ １．０ｕｌ ２．０ｕｌＭｇｃｌ２（２５ｍＭ）ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ） 上游引物（１０ｍＭ） 下游引物（１０ｍＭ） 探针（１ ＯｍＭ）ＤＮＡ模板（６０ｎｇ／ｕ１）Ｈｏｔｓｔａｒｔ０．５ｕｌ ０．５ｕｌ ０．４ｕｌ ２．Ｏｕｌ ０．１２５ｕｌＴａｑ―ＤＮＡ聚合酶（ＤＲ００７）ｄｄＨ２０１ ５．９７５ｕｌ实时定量ＰＣＲ反应条件： ――――――――?――――――＋４０ｃｙｃｌｅｓ５０℃２ｍｉｎ―――◆９５℃１０ｍｉｎ―――◆９５℃１５ｓｅｃ?一一一．一６０℃ｌｍｉｎ２．１…２３２待测基因和内参基因标准曲线的制作将ＤＮＡ模板梯度稀释ｌＯ倍，１００倍，１０００倍，１００００倍进行定量ＰＣＲ反应， 用稀释倍数的ｌｏｇ值对每个稀释样品的ＣＴ值作图，即为标准曲线。要求曲线Ｒ２＞Ｏ．９８ 或ｒ＞ｌ一０．９９０１。ｐａｒｋｉｎ基因１２个外显子及ｂ－ｇｌｏｂｉｎ的标准曲线图如下：１５浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果１６浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果１７浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果１８浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果１９浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果用Ｅ＝ＩＯ’１腑率；％效率＝（Ｅ一１）ｘ１００％计算以上内参基因和待测基因的扩增效率都界于８５％．１１５％，且内参基因和待测基因的扩增效率接近，适合运用２’雠Ｔ法．２．１…２ ３ ３２－ＡＡｃＴ法对ｐａｒｋｉｎ基因各外显子重排突变的分析实验设置如下：待测样本（ｔｅｓｔ） 待测基［霾（ｐａｒｋｉｎ ｅｘｏｎｓ）校准样本（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）ＣＴ（ｐａｒｋｉｎ，ｃａｌ）Ｃ砸ａｒｋｉｎ，ｔｃｓｔ）Ｃ啦ｔａ，ｔｅｓｔ）内参基［霾（ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ）ＡＣＴ（ｔｅｓｔ）＝ＣＴ（ｐａｒｋｉｎ，ｔｅｓｔ）一Ｃｍ．ｅｔａ，ｔｅｓｔ）ＣＴ（Ｉ加，ｃａｎ）ＡＣＴ（ｃａ¨ｂｍｔｏｒ）《Ｔ（ｐａ币ｎ，∞ｌｉｂｒａｔｏｒ）一ＣＴｍ啦，ｃａｌｉｂｒ抛ｒ）ＡＡＣＴ＝ＡＣＴ（ｔｅｓｔ）一ＡＣＴ（ｃａｌｉｂｒ＇ａｔｏｒ）２’峨比值比值＝０．４．０．６被认为是外显子的杂合缺失；０．８．１．２被认为是正常；１．３．１．７被认为是 杂合重复突变；１．８―２．３被认为是纯合重复或杂合三倍体；＜ｏ．３被认为是纯合缺失．浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果２．１．２．４用ＤＨＰＬＣ对ｐａｒｋｉｎ基因第ｌ＇３，４，５，６，８，９，１０号外显子点突变的分析２．１…２４ １ＰＣＲ反应体系与反应条件（引物序列见表３）反应体系： 体系总体积１ Ｏ×Ｂｕｆｆｅｒ ２５ｕｌ ２．５ｕｌ １．０ｕｌ ２．０ｕｌ ０．５ｕｌ Ｏ．５ｕｌ ２．０ｕｌ Ｏ．１２５ｕｌ １ ６．３７５ｕｌＭｇｃｌ２（２５ｍＭ） ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ） 上游引物（１０ｍＭ）下游引物（１０ｍＭ） ＤＮＡ模板（６０ｎｇ／ｕ１）Ｔａｑ―ＤＮＡ聚合酶ｄｄＨ２０反应条件：９５℃５ ｍｉｎ９５℃３０ｓｅｃ／’６０士２℃３０ｓｅｃ＼３０ｃｙｃｌｅｓ，７２℃３０ＳＣＣ１Ｌ７２℃１０ ｍｉｎ４℃６０ｍｉｎ浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果２．１…２４ ２２％琼脂糖胶电泳检测ＰＣＲ产物称取琼脂糖粉０．８９，加入ｌｘＴＡＥ溶液４０ ｍｌ，微波炉加热完全溶解后，待琼脂糖溶液冷却至６０。Ｃ左右，加溴化乙锭至终浓度为０．５ｕｇ／ｍｌ，混匀后将混合液倒 入已准备好的制胶床内，凝胶厚度约Ｏ．５ｃｍ。室温下放置半小时，待凝胶固化，拨 出梳子，撕去胶床两端胶带，放入电泳槽中备用。吸取５ｕｌＰＣＲ产物与适量６×加样缓冲液以ｌ：５比例混和后，加入加样孔。ｌｘＴＡＥ溶液作电泳缓冲液，１２０Ｖ电 泳半小时，在凝胶图像分析仪下观察分析凝胶并拍照，检测ＰＣＲ产物的量和特异性。２．１…２４ ３６％非交性聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＧＥ）电泳检测ＰＣＲ产物的特异性取３０％丙烯酰胺６ｍｌ，１０ｘＴＢＥ １．５ｍｌ，１０％过硫酸铵３００ｕｌ，加去离子水至总体积３０ｍｌ，胶液充分混匀后取出５ｍｌ加入ＴＥＭＥＤ ３０ｕｌ，快速混匀后迅速倒入已 准备好的两块玻璃板之间形成封底胶．１０分钟后封底胶基本凝固，在剩余的２５ｍｌ 胶液中加入４０ｕｌＴＥＭＥＤ，混匀后将胶液缓慢灌入玻璃板之间（灌胶时要连续，避免 产生气泡），胶液灌好后在玻璃板上方插入相应的点样梳（插梳子时注意去除梳齿下 的气泡）。室温下静止３０分钟后，小心拔出梳子，用电泳槽内的ＴＢＥ液冲洗胶孔， 去掉封口胶带以及玻璃板两边的夹子，将胶板固定在电泳槽内，接通电源，３００Ｖ 预电泳ｌＯ分钟，然后吸取５ｕｌＰＣＲ产物与适量６×加样缓冲液以１：５比例混和后，加入加样孔。上样结束后，３００Ｖ恒压电泳，待电泳指示剂电泳至合适位置后停止电泳．用银染法显色：将凝胶移入托盘内，固定液固定１０分钟一染色液染色１０分 钟一一蒸水漂洗两次，每次半分钟＿放入显色液直至显色，出现清晰ＰＣＲ产物条 带，用一蒸水漂洗凝胶，最后拍照保存。２．１…２２２４４变性高效液相色谱检测方法的建立１）温度预测浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果使用Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ公司ＤＨＰＬＣ检测仪自带的Ｎａｖｉｇａｔｏｒ软件包对所有扩增片断的 检测温度和分离梯度进行预测，根据预测的结果选择最佳的检测温度和分离梯度。 在对ＤＨＰＬＣ的检测温度和梯度进行实际摸索，最后优化了ｐａｒｋｉｎ基因８个扩增片 断最佳的检测条件。通过ＷＡＶＥ核甘酸片段分析仪的系统分析软件预测了８个扩 增片断的部分变性温度，见表２．３。 表２．３ ｐａｒｋｉｎ基因８个扩增产物部分变性预测温度２）配制缓冲液 ＤＨＰＬＣ洗脱液由乙腈（ＡＣＮ）和／或ＴＥＡＡ（Ｌ酸三乙基胺）配制而成，液体配置如下：Ａ液珈．１Ｍ ＴＥＡＡ水溶液：２Ｍ ＴＥＡＡ５０ ｍｌ＋ＡＣＮ ２５０ｐｌ一加去离子水至１０００ｇｌ；Ｂ液―０．１Ｍ ＴＥＡＡ水溶液和２５％ＡＣＮ：２Ｍ ＴＥＡＡ５０ ｍｌ＋ＡＣＮ ２５０ｍｌ＿加去离子水至１０００肛ｌ；Ｃ液一８％ＡＣＮ溶液：ＡＣＮ ８０ｍｌ＋去离子水９２０ ｍｌ＿共１０００ｇｌ；２＝Ｉ浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果Ｄ液一７５％ＡＣＮ溶液：ＡＣＮ ７５０ ｍｌ＋去离子水２５０ｍｌ＿共１０００１．ｔｌ；３）ＤＨＰＬＣ异常峰型分析 在本实验中采用ＤＨＰＬＣ部分变性的模式进行突变检测，在部分变性的条件 下，异源双链比同源双链更易于解链成单链，从而与分离柱的结合力弱于 同源双链，在浓度逐渐增高的乙腈的洗脱下先于同源双链分离下来，从而 被ＤＨＰＬＣ上的紫外检测仪检测出来，而同源双链则在后来较高浓度的乙腈 洗脱下才分离下来。因此，将待测样品峰型与野生型的峰型进行比较，只 要存在差异便可认为有异常． ４）据我们所知，ｐａｒｋｉｎ和ＰＩＮＫｌ基因的点突变检出率都是小于５０％的，所以， 在进行ＤＨＰＬＣ上样分析前，两个不同样本的ＰＣＲ产物被混匀在一个上样管中进 行检测，发现有异常检测峰图时再将两个不同样本的ＰＣＲ产物分别做ＤＨＰＬＣ分 析，以明确具体异常的ＤＮＡ样本，最后做直接测序。这样可以节约时问，也可以 减少检测费用。 ２．１．２．５直接测序分析ｐａｒｋｉｎ基因第２，７，１１，１２号外显子点突变 ＰＣＲ反应条件、体系以及电泳检测同ＤＨＰＬＣ。 直接测序由上海英骏生物技术有限公司进行，采用正反引物双向测序。然后采用 ＤＮＡＳｔａｒ软件对测序结果进行分析，测序为异常者与基因突变数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｄ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋ／ａｃ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ ）和基因多态数据库（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ＵＣＳＣ．ｅｄｕ／ｅｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＢｌａｔ？ｅｏｍｍａｎｄ＝ｓｔａｒｔ）Ｉ），戈及文献报道相比对，明确是 否为新的序列变异。 ２．１．３实验结果２．１．３．１实时定量ＰＣＲ外显子重排突变的分析结果１９例患者被发现有ｐａｒｋｉｎ基因外显子的重排，２－△△ＣＴ比值结果分列如下（Ｍ为患者２４浙江大学硕上学位论文实验材料、方法以及结果编号）：Ｍ３３５：ｅｘ２：０．４８士Ｏ．２７；ｅｘ７：０．４５＋０．１９；ｅｘ８：０．４５＋０．１ ８：ｅｘ９：０．５６＋０．０４ Ｍ５５４：ｅｘ３：０．４８士０．０６ Ｍ６３０：ｅｘ３：０．４９ａ：０．２：ｅｘ４：０．３８＋０．１２；ｅｘ７：０．４７＋０．１８ Ｍ６３ １：ｅｘ３：０．５ １＋０．２５；ｅｘ４：０．４２＋０．２：ｅｘ７：０．６６＋０．２６ Ｍ７３０：ｅｘｌＯ：１．５２＋０．２１ Ｍ８４２：ｅｘｌ２：１．４５士０．１７ Ｍ５：ｅｘ３：０士０：ｅｘ４：０－士Ｏ．２９ Ｍ６：ｅｘ２：０．４２＋０．０３；ｅｘ６：０．３３＋０．Ｏｌ Ｍ１０：ｅｘ４：Ｏａ：Ｏ．００５ Ｍ１６：ｅｘ７：０．６６－ａ：０．０４ Ｍ３０：ｅｘ６：０．３５＋０．１１ Ｍ７６：ｅｘ６：０．５９＋０．１ Ｍ４８５：ｅｘｌ０：１．４５＋０．０７ Ｍ５２７：ｅｘ７：０．３５＋０．２５ Ｍ６００：ｅｘ３：Ｏ．５８＋０．１ ８Ｍ６０３：ｅｘ５‘１．４６士０．２１Ｍ６９４：ｅｘ４：１．９４＋０．２６Ｍ７５５：ｅｘ２：１．６２＋０．１ｌＭ８４０：ｅｘ７０．５２士０．０３由此，判断这１９例患者外显子重排突变类型： Ｍ３３５：第２，７，８，９外显子杂合缺失；Ｍ５５４：第３外显子杂合缺失； Ｍ６３０：第３，４，７外显子杂合缺失；Ｍ６３１：第３，４，７外显子杂合缺失； Ｍ７３０：第ｌＯ外显子杂合重复；Ｍ８４２：第１２外显子杂合重复； Ｍ５：第３，４外显子纯合缺失；Ｍ６：第２，６外显子杂合缺失； ＭＩＯ：第４外显子纯合缺失；Ｍ１６：第７外显子杂合缺失； Ｍ３０：第６外显子杂合缺失；Ｍ７６：第６外显子杂合缺失；浙江太学硬±学位论文实验材料、方法蛆Ａ站＊Ｍ４８５：第１０外显子杂台重复；Ｍ５２７：第７外显于杂合缺失 Ｍ６００：第３外显子杂合缺失；Ｍ６０３：第５外显子杂合重复； Ｍ６９４：第４外显子纯合重复；Ｍ７５５：第２外显子杂合重复： Ｍ８４０：第７外显子杂合缺失。２．１，３．２ＤＩＴＰＬＣ点突变检测结果ＤＨＰＬＣ分析前ｐａｒｋｉｎ基因外显子（ｅｘｌ，３，４，５，６，８，９，ｌ ０１的ＰＣＲ产物经２％琼脂糖肢和 ６％ＰＡＧＥ胶电泳显示条带清晰，特异性良好。ＤＨＰＬＣ检测到４例异常峰型，经 ＤＮＡ剥序证实３例为４号外显子上的多态位点ｃ ５００Ｇ＞Ａ，１例为１号外显子起始 密码子上的点突变ｃ．２Ｔ＞ｃ（ｐ Ｍ１Ｔ）。 ２％琼脂糖胶电泳例图：Ｅｘｏｎ ６ ５ ４ ３ ２ １６％ＰＡＧＥ胶电泳例囤：Ｅｘｏｎ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ ｌｌ １２浙江大学硬±学位论文宴驻材科、方法以厦结果ＤＨＰＬＣ检测例田：】号外显予正常ＤＨＰＬＣ峰图号外显予异常ＤＨＰＬＣ峰目（Ｍ６００）４号外显子正常ＤＨＰＬＣ峰囤４号外显子异常ＤＨＰＬＣ峰Ｉ雷（Ｍ４８６，Ｍ５０４，Ｍ８４０）新Ⅱ＾学磺±学位论文实验材科、方法以＆结果剥序例图： ①Ｉ例患者ｌ号外显于ＰＣＲ产物测序结果显示第１９２号碱基杂合突变１二＋ｃ，经基 因突变数据库和基因多态数据库比对，提示为一新的点突变位点，依据突变命名 规则将其命名为ｃ．２Ｔ＞Ｃ（ｐＭｌＴ）：Ｉ△必８』型边６丛ｎ。迅型］醚越ｌ！△△丛必△丛６△Ｃ Ｃ Ａ ｃ ｃ Ａ／－ｃ ｃ＾Ｇ ６＾ｃ ｃ＾ ０＾ ＾Ｇ Ｇ Ａ［Ｇ ｃ Ｇ Ｇ②３例患者４号外显子ＰＣＲ产物测序结果显示１２９号碱基纯合突变Ｇ＿÷Ａ，经基 因多态数据库比对，提示为己报道的多态位点１３．５００Ｇ＞Ａ：―Ｌ！―！―！―！―！―！―Ⅱ―Ⅱ―Ⅱ―二―！―！―！―Ⅱ―！―ｉ―！―ｉ―――￡―ｉ―ｉ―￡―ｔ―ｉ―！―！―Ｌｉ―●！―ｉ―Ｌ２．１３．３直接测序结果 直接测序前ｐａｒｋｔｎ基因外显子（ｅｘ２，７，１ｌ，１２）Ｎ ＰＣＲ产物经２％琼脂糖胶和 ６％ＰＡＧＥ胶电泳显示条带清晰，特异性良好。直接测序发现９例患者在２号外显 子有多态变异ｃ １７１＋２５Ｇ＞Ｔ，１例患者在７号外显子有点突变ｃ ８５０Ｇ＞Ｃ，５倒患者 在１２号外显子有多态变异ｃ＊１５Ｃ＞Ａ。 ２％琼脂糖肢和６％ＰＡＧＥ胶电泳图同ＤＨＰＬＣ部分，不再图例。 ①９例患者２号外显子ＰＣＲ产物测序结果显示２７２号碱基杂合宪查Ｔ＿＋ｃ，经基因 多态数据库对比，提示为已报道的多态位点ｃ１７１＋２５Ｇ＞Ｔ／１：吕２８９５１ＳＴ＞Ｃ：新扛大学磺士学位论文实璧材料、方法以及结晕②１例患者７号外显予ＰＣＲ产物测序结果显示１７０号碱基杂合突变Ｇ＿ｃ，经基因突变数据库和基因多态数据库比对，证实为已报道的点突变ｃ８５０Ｇ＞Ｃ：蝴燃趔！盘业础衄拙塑＠５例患者１２号外显予ＰＣＲ产物剥序结果显示１６２号碱基杂合突变ｃ―＋Ａ，经基 因突变数据库和基因多态数据库比对，证实为已报道的多态位点ｃ‘１５Ｃ＞Ａ：２．２ＥＯＰＤ患者ＰＩＮＫＩ基因点突变分析２．２．１实验材料 除实验仪器里荧光定量ＰＣＲ仪不用外，其他同第一章的实验材料。 ２．２．２实验方ｊ圭 ２．２．２．１研究对象和基因组ＤＮＡ的提取 ２．２．２．１．１研究对象 除３例患者有ｐａｒｋｉｎ基因外显子的纯合重排突变（Ｍ５女２９岁，１６岁起病； Ｍｌｏ－女４４岁，３４岁起病：Ｍ６９４：女３０岁，２５岁起病）外，其他６６倒同第一章。 ２．２．２．１．２基目组ＤＮＡ的提取 方法同第一章。 ２．２．２．２引袖设计与合成 Ｐ１ＮＫＩ点突变检测所需引物序列来裸于已报道的文献（１号外显子引物同 Ｓｃｈｌｉｔｌｅｒ等娜Ｉ．２号至８号外显于引物同Ｖａｌｅｍｅ等ｍ１），并由上海英骏生物技术有＂浙江大学硕士兰篁丝壅 限公司合成，引物序列见表２．４。 表２．４塞竺塑整：塑鎏坠垄望墨ＰＩＮＫｌ基因点突变检测用引物序列（５’－３’）５０７ ５２２ ３２３ ４２９３ ４ＣＴＣＧＡＡＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣ ＧＡ―口ＧＴＣＡＧＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡ（、１℃ＡＧＴＣＣＸＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＧＧＣＡＴＣＧＡＧＴＣＴＣＣ３００ ３０９ ４１６ ５２０８ＧＡＧＡＡＧＣａ３ＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＣＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＴ２．２．２．３ ２．２．２．３．１ＰＣＲ产物的合成 ＰＣＲ反应体系和反应条件反应体系： 体系总体积１０ｘＢｕｆｌ５玎 ２５ｕｌ ２．５ｕｌ １．０ｕｌＭｇｃｌ２（２５ｍＭ）ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ） 上游引物（１０ｒａＭ） 下游引物（１０ｍＭ） ＤＮＡ模板（６０ｎｇ／ｕ１）Ｔａｑ－ＤＮＡ聚合酶ｄｄＨ２０２．ＯｕｌＯ．５ｕｌ ０．５ｕｌ ２．０ｕｌ ０．１２５ｕｌ １ ６．３７５ｕｌ浙江大学硕上学位论文实验材料、方法以及结果反应条件：９４℃１１ ｍｉｎ土９４℃３０ｓｅｅ／退火３０ｓｅｅ―――◆ｋＮＮ３５ ｅｙｅｌｅｓ７２＂Ｃ３０ｓｅｅ上７２℃７ｍｉｎ上４℃６０ｍｉｎ退火温度：１号外显子５４０，２号３号外显子５２。，４－８号外显子５８０。２．２…２３２ＰＣＲ产物特异性的检测２％琼脂糖胶和６％ＰＡＧＥ胶的制作过程以及电泳的操作过程同第一章。 ２．２．２．４作ＤＨＰＬＣ对ＰＩＮＫＩ外显子点突变的分析 鉴于ＰＩＮＫｌ第１，６，８号外显子在华人人群中的突变很少有发现，在不影响 检测质量的前提下，为了加快实验进度，节约时问，实验中对这三个外显子采用 ＤＨＰＬＣ方法检测，具体操作过程同第一章。ＰＩＮＫＩ基因３个扩增产物部分变性预测温度见表２．５。表２．５ＰＩＮＫＩ基因３个扩增产物部分交性预测温度２．２．２．５直接测序分析ＰＩＮＫｌ基因第２，３，４，５，７号外显子点突变 直接测序由上海英骏生物技术有限公司进行，采用正反引物双向测序。然后３１浙江大学硕士学位论文实验材料、方珐以厦结果呆用ＤＮＡＳｔａｒ软件对涮序结果进行分析，测序为异常者与基因突变数据库（ｈｔｔｐ：ｌｌｗｗｗ．ｈｇｍｄ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋ／ａｃ／ｉｎｄｅｘ ｐｈｐ）和基因多态数据库（ｈｔｔｐ：／／ｇｃｎｏｍｃ．ｕｃｓｃ ｅｄＷｃｇｉ＿ｂｉｎ，ｈｇＢｌ砒？ｃｏｍｍ觚ｄ＿ｓ协啦以及文献报道相比对，明确是否为斩的序列变异。 ２．２．３实验结果２．２．３．１ＰＣＲ产物的特异性挂测结果２％琼脂糖胶电泳结果见下图：Ｅｘｏｎ ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ ｌ６％ＰＡＧＥ肢电泳结果见下圈：８ ７ ６ ５ ４ ４ ３ ２∞∞Ｌ一?一一 ，∞＿５００■● －：‘Ｉ兰＿■２５０６－塞漓浙江大学碟士掌啦论文实鞋材料、矗诖以及结粜２．２．３．２ＰＩＮＫｌ第２，３，４，５，７号外豆子溯序结果经直接测序，在２号外显子上发现３个多态位点，分别为２例含有ｅ．５８６Ｃ＞Ｔ，５９ 倒台有ｃ．３８８－７Ｇ＞＾１２０倒含有ｃ ３８８－６５Ｇ＞Ｃ；在４号外显子上发现２个新的变异位 点，分别为Ｉ倒台有ｃ ８７３Ｃ＞Ｔ和１例台有ｃ．７７７．３４Ｔ＞Ｃ；在５号外显子上发现２ 个多态位点，分别为５０例含有ｅ．９６０．５ｃ＞ｃ，，２５倒含有ｃ １０１８Ｇ＞Ａ；在３号和７号 外显于上没有任何发现。①２例患者２号外显子ＰＣＲ产物测序结果显示３１５号碱基杂合突变ｃ―＋Ｔ，经基因多态数据库对｝匕，提示为已报道的多杰位点ｃ５８６１２＞１＂：赵！刈妞删△螋盘丛脞△△丛＆矗虹』蚣？ｔｒ１＾ＧＧＧＡＢＡ００１ｃＡ５０ＴＡ’１Ａ５―６Ａ二ｒＡ０②５９例患者２号外显予ＰＣＲ产物剥序结果显示１１０号碱基杂合宪变Ａ叶Ｇ，其中 １９倒为杂台形式，４０侧为纯合形式，经基因多态数据库对比，提示为已报道的多态位点ｃ５８６Ｃ＞Ｔ：纯旮】△△．！刖呔｝厶竺进ｊ△｜丛！趔虹应垃螳羔量：△杂台幽岖监！！：△然艘艘越：，羔．上：渐盯大糨｝学位论文宴鞋材辩、方法以厦结果③２０例患者２号外显子ＰＣＲ产物测序结果显示５２号碱基杂合突变ｃ－呻０，经基 因多态数据库对比，提示为已报道的多态位点ｃ ３８８＿６５Ｇ＞Ｃ：烈必溢出她幽逖姓！：羔必．！④１例患者４号外显子ＰＣＲ产物测序结果显示１９３号碱基杂台突变ｃ－＋Ｔ，在７０ 例对照样本中未有发现，经基因多态数据库和基因突变数据库对比，提示为一新的变异位点ｃ ８７３Ｃ＞Ｔ：边燃！盐凸应幽幽垃碰凸燃划ｋ⑤１例患者４号外显子ＰＣＲ产物测序结果显示６３号碱基杂合突变１二－ｃ，在７０ 例对照样本发现ｌ例对照样本也含有这一变化，经基因多态数据库和基因突变数 据库对比，提示为一新的变异位点ｃ．７７７－３４Ｔ＞Ｃ：⑥５０例患者５号外显子ＰＣＲ产物搠ｌ序结果显示５２号碱基杂合突变Ｇ叶Ａ，其中 １７例为杂合形式，３３倒为纯台形式，经基因多态数据库和基因突变数据库对比， 提示为已报道的多态位点ｃ ９６０．５Ｃ＞Ｇ：浙Ⅱ大字磺±学位论文实验村料、方法以及蛄粟纯合６ ｇＧ ｇｃｃｃＣｃｃｃｅｃｃ ｃｃｃｃｃｃｃ ｃｃｔ ｃ ｃｃｃｃ＾ＣｃｃｃｃＡＧｃＡｃ＾ｃｃｃｃｃＣ６ｔ＾ｃａ ｃａ口ｃｃ々ｇ杂合⑦２５例患者５号外显子ＰＣＲ产物剥序结果显示５２号械基杂合突变Ｇ―＋Ａ，其中 ２０倒为杂台形式５例为纯合形式，经基因多态数据库和基因突变数据库对比，提 示为已报道的多恋位点ｃ纯台９６０－５Ｃ＞Ｇ：…ｇ…Ｃ ｇ…ｅｃ ｃ＾６ ｃｃｃＣｃｃＧｃｃＴｃ６ ｇｃ ｃｃ、…ｔｃＡｃｃＡＧ＾７ ｇ８ ｔ６ ｇＣｃｉＢ ｇＣ’Ｇ ｃ‘ｇＣｏｃ杂合浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果２．２．３．３ＰＩＮＫｌ基因第１，６，８号外显子ＤＨＰＬＣ分析未见异常２．３Ｐａｒｋｉｎ基因突变与临床表现本实验对６９例帕金森病患者的临床表现做了较详细的描述，并从发病年龄上对有ｐａｒｋｉｎ基因突变和无ｐａｒｋｉｎ基因突变的帕金森病患者作了统计意义分析。 ２．３．１统计学分析 本研究中使用了统计软件ＳＰＳＳｌ６．０，具体采用了ｔ检验的方法分析ｐａｒｋｉｎ基 因突变与无突变患者，纯合突变与杂合突变患者以及杂合突变与无突变患者在发 病年龄上的差异。Ｐ＜０．０５被认为有统计学意义。 ２．３．２结果 有家族史的帕金森病患者的发病年龄明显早于散发性帕金森病患者；有ｐａｒｋｉｎ 基因突变的患者发病年龄明显早于无ｐａｒｋｉｎ基因突变的患者；含有ｐａｒｋｉｎ基因纯 合突变或复杂杂合突变的患者发病年龄明显早于单一杂合突变的患者；但单一杂 合突变患者与无突变患者在发病年龄上的差异无统计学意义。而且，以上三组患 者在发病问期上的差异没有统计学意义。具体数据见表２．６。 表２．６帕金森病发病年龄与患病问期起病年蝌围）家族性ＰＤ ３０．０－Ｉ－１２．４（８－４７） ３８．２土８．９（１５－４９）１患病嗍范围）ｆ．爹罂篱）１．９±８．９（２－３４）１７ ５２散发性ＰＤ９．４±５．８（２―３４０．３７Ｐ值０．００４突变ＰＤ 无突变ＰＤＰ值３０．２±１１．３（８－４７） ３８．５－Ｉ－９．２（１３－４９）０．００３１１．１±５．２（４―２７） ９．３±７．Ｉ（２－３４）Ｏ．３２ｌ９ ５Ｏ纯合或复杂杂合ＰＤ 单一杂合突变ＰＤＰ值２３．８±９．９（８－３９） ３５．９土９．４（１５－４７）０．０１４１２．８土６．４（５―２７） ９．７±３．３（４－１３）０．２０９ ｌ０单一杂合突变ＰＤ 无突变ＰＤＰ值３５．９土９．４（１５－４７） ３８．５－１－９．２（１３－４９）Ｏ．４２９．７±３．３（４―１３） ９．３±７．１（２?３４）Ｏ．８６ｌＯ ５０浙江大学硕士学位论文实验材料、方法以及结果在６９例帕金森病患者中，３８例为男性，３１例为女性，其中２例患者的临床 资料不全．４７例患者（６８％）是以双侧肢体不对称起病的，３６例患者以静止性震颤 为首发症状，２５例以运动迟缓和肌强直为首发症状，３例患者以肩背部不适为首 发症状，２例患者以步态异常起病，１例患者以语速变慢，口齿不清起病．含有纯 合突变或复杂杂合突变患者的临床表现见表２．７． 表２．７含纯合突变或复杂杂合突变患者的临床表现Ｍ３３５ Ｍ６３０＋Ｍ６３ｌ＋Ｍ５Ｍ６．Ｍ１０－Ｍ６００－Ｍ５５４＋Ｍ６９４－家族史 父母近亲结婚史 首发症状（１，２，３，４） 对称起病 静止性震颤 肌强直 运动迟缓 面具脸 小写症 步态异常 姿势不稳 帕金森语音 抑郁 嗅觉丧失 左旋多巴反应 疗效减退 开关现象 运动障碍 肌张力障碍 ＵＰＤＲＳ（关状态） Ｈｏｅｈｎ―Ｙａｈｒ分级（关状态）＋．．．．＋．●－．＋筇＋酗＋够＋４４ｌ１ｌ＇２－２，３＋－＋－＋＋．．＋＋＋＋＋．＋＋＋＋＋ＮＡ＋＋＋＋＋＋＋＋ＮＡ＋＋＋№ №＋．．－№ №＋ＮＡ一－＋＋＋＋ＮＡ－ＮＡＮＡ＋＋＋ＮＡ＋＋＋＋＋＋＋．ＮＡ?ＮＡ＋Ｍ 队．＋．＋№ №．ＮＡ＋．＋－－．ＮＡ－ＮＡ＋．．．ＮＡ－ＮＡ．Ｇｏｏｄ＋ＧｏｏｄＧｏｏｄ＋Ｇｏｏｄ＋Ｇｏｏｄ＋ＮＡＧｏｏｄ＋Ｇｏｏｄ＋Ｇｏｏｄ＋ＮＡ．ＮＡ ＮＡ．－＋ＮＡＮＡ－ＮＡ－＋－＋ＮＡＮＡ?一■?ＮＡ．＋＋ＮＡＮＡ４０弘３２弭２ｌＮＡ５２５２９４３．Ｏ始２．５们２．ＯＮＡ３．０３．０５．０３７浙江大学硕士学位论文讨论３讨论帕金森病是一种最常见的神经退行性疾病之一，自从１８１７年ＪａｍｅｓＰａｒｋｉｎｓｏｎ医师对帕金森病的临床表现首次作出描述以后，很长一段时间内对帕金森病病因 处于完全不知的状态．环境因素和遗传易感性的相互作用曾一度被认为是大多数 帕金森病的致病病因，但多年来大量的流行病学调查未发现环境因素引起帕金森 病的强有力的证据。随着近２０多年来对帕金森病基因遗传学的研究，越来越多的 基因被发现可以引发帕金森病的起病，且呈孟德尔式遗传，有的基因表现为常染 色体显性遗传，如ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵＣＨ－Ｌ１，和ＬＲＲＫ２；有的基因表现为常染色体隐性 遗传，如ｐａｒｋｉｎ，ＰＩＮＫｌ，ＤＪ－１和ＡＴＰｌ３Ａ２。对这些基因的突变研究发现它们可以通 过引起蛋白酶体水勰系统的异常、线粒体功能异常、氧化应激能力下降导致帕金 森病的发病。 根据以往的研究报道，ｐａｒｋｉｎ基因的突变是目前早发性帕金森病患者最常见的 致病病因，Ｌｕｃｋｉｎｇ等【４９Ｉ对７３个欧洲早发性帕金森病家系的突交研究，发现４９％ 的家系有ｐａｒｌａ＇ｎ基因的突变，而Ｇｕｏ等【３３１对国内２９个早发性帕金森病家系的突 变研究发现４８％的家系有ｐａｒｋｉｎ基因的突变。其突变类型包括引起氨基酸改变的 错义突变、引起蛋白翻译提前终止的无义突变，以及外显子的重排突变（分为外显 子缺失、双重重复、三重重复），这些突变类型的出现形式可以不一样，有纯合突 变、杂合突变和复杂杂合突变。ＰＩＮＫｌ基因在早发性帕金森病患者中的检出率达 到１－９％，其突变主要为无义突变和错义突变，外显子重排突变非常少见１５０１． 根据ｐａｒｋｉｎ和ＰＩＮＫｌ基因主要突变类型的不同，本研究针对ｐａｒｋｉｎ基因的突 变分析采用了荧光定量ＰＣＲ，ＤＨＰＬＣ、直接测序相结合的方法，针对ＰＩＮＫｌ基因 的突变分析采用了ＤＨＰＬＣ和直接测序相结合的方法。 在ｐａｒｋｉｎ基因，采用ＤＨＰＬＣ的方法发现了一个有意思的杂合形式的点突变位浙江大学硕士学位论文讨论点ｃ．２Ｔ＞Ｃ Ｏ．ＭＩＴ），这个突变使得ｐａｒｋｉｎ基因的起始密码子ＡＴＧ变成了ＡＣＧ，而 下一个ＡＴＧ位于ｐａｒｋｉｎ基因开放读码框的第８０号密码子上，处于ｐａｒｋｉｎ基因的３ 号外显子上，这样可以推测这一突变可能导致ｐａｒｋｉｎ蛋白Ｎ端泛素样结构域缺失， 或导致整个ｐａｒｋｉｎ蛋白无法合成．Ｒａｗａｌ等【５１】一个类似的点突变位点ｃ．１０２Ａ＞Ｔ， 使起始密码子ＡＴＧ变成了ＴＴＧ，另外，他们在同一个患者的ｐａｒｋｉｎ基因发现４号 外显子的杂合缺失，有趣的是本研究也在同一个患者的ｐａｒｋｉｎ基因发现了外显子 的杂合缺失，不过是在３号外显子的杂合缺失．随后检测了这个患者母亲的ＤＮＡ， 在她的ｐａｒｋｉｎ基因里发现了同一个点突变ｅ．２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｍ１Ｔ），也为杂合形式，但没 有发现有３号外显子的缺失突变。患者的父亲多年前去世，其ＤＮＡ无法获得，但 可以推测患者３号外显子的杂合缺失很有可能是来自于其父亲．通过对患者母亲 详细的体格检查和神经系统检查，没有发现她有帕金森病的迹象．根据这些结果 可以认为单一的杂合点突变ｃ．２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｍ１Ｔ）不会引发帕金森病的起病，而只有与 杂合的３号外显子杂合缺失同时出现时才具有致病性。在本研究中，ｐａｒｋｉｎ基因外 显子的纯合缺失都发生在３号或４号外显子上，这个结果与另一个中国研究机构 的报道相似【３３１，这也许提示ｐａｒｋｉｎ基因３号和４号外显子是中国帕金森病人群的 突变热点。 到目前为止，ＰＩＮＫｌ基因的外显子重排突变非常少有报道，所以，在做ＰＩＮＫｌ 基因的突变分析时未做荧光定量ＰＣＲ，只是针对ＰＩＮＫｌ基因常见的点突变形式做 了ＤＨＰＬＣ和ＤＮＡ直接测序分析。在ＰＩＮＫｌ基因上未发现任何突变，但发现了７ 个多态位点，其中２个为新位点ｃ．８７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａ２９１Ａ）和ｅ．７７７―３４Ｔ＞Ｃ。对于阴性的 突变检测结果，以下情况可能为其原因所在：（１）本研究所收集的帕金森病患者大 多数为散发性；（２）本研究只是检测了ＰＩＮＫｌ基因的外显子区域的碱基情况，而 ＰＩＮＫｌ基因的突变有可能分布在基因的其他区域，如增强子、启动子、或着一些 不知名的调节区。３９浙江大学硕士学位论文讨论在本研究中，其中２个患者为母子关系，他们在起病时都表现为双手的运动 迟缓，对他们做检查时，无法快速连续做伸掌握拳运动，检测结果只在儿子的ＤＮＡ 里发现ｐａｒｋｉｎ基因１２号外显子的杂合重复突变。也许他们很可能在其他以常染色 体显性方式遗传的基因上有突变，如ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵＣＨ－Ｌ１，和ＬＲＲＫ２等。 在本组研究，ｐａｒｋｉｎ基因突变（包括杂合和纯合形式）的检出率为２８％，这个结 果与以往关于华人的突变检测结果不同，Ｗｕ和其同事【５２１分析了４１例散发性帕金 森病患者的突变情况，发现４例患者有ｐａｒｋｉｎ基因的突变，检出率不到１０％，而 Ｇｕｏ及其同事【３３１对２９个早发性帕金森病家系进行了突变研究，发现４８％１均家系有 ｐａｒｋｉｎ基因的突变。导致这种不同结果的原因很可能是由于不同研究的病例组成不 同（在同一个研究中散发性和家族性帕金森病患者数不同）。 本组研究发现ｐａｒｋｉｎ基因的突变对帕金森病的起病年龄有明显的影响，具体 见表２．６。这个现象提示ｐａｒｋｉｎ基因的杂合突变与帕金森病的发展也有一定的关联， 但是，对于ｐａｒｋｉｎ基因杂合突变如何影响帕金森病的发展，一时还无法说清。 Ｍｉｚｕｎｏ等【５３１推断可能是由于ｐａｒｋｉｎ基因杂合突变后无法产生足够量的蛋白去维持 黑质神经元的存活．ＰＥＴ扫描研究发现ｐａｒｋｉｎ基因杂合突变携带者的脑部纹状体 区域对ＦＤＯＰＡ的平均摄取率降低【５４１，这说明单一的ｐａｒｋｉｎ基因杂合突变可能扮演 着帕金森病易感因素的角色． 在临床上，首先，本组研究中具有家族史的帕金森病患者的起病年龄为 ３０．０－士１２．４岁，而散发性帕金森病患者的起病年龄为３８．２士８．９岁，两者具有明显的 差异＠＝ｏ．００４）。这个结果很好的说明了遗传因素在帕金森病的发病上所起到的重 要作用。其次，Ｗｕ等ｆ５２１根据他们的研究得出：在相同环境下成长的具有相同突变 的亲兄弟姐妹患者在临床上的表现也是很不一样的。本组研究的发现与其不同， 一对亲姐妹含有相同的ｐａｒｋｉｎ基因突变（杂合的第３、４、７号外显子缺失），他们的 临床表型非常相似，都是以双侧肢体对称性运动迟缓，肌强直起病，没有静止性柚浙江大学硕士学位论文讨论震颤，所不同的是起病年龄不一样．第三，Ｂｒａａｋ等【５５１根据其研究认为Ｌｅｗｙ小体 通常首先出现在迷走神经背核和嗅球上，而且ｐａｒｋｉｎ基因突变引起的早发性帕金 森病往往不会出现Ｌｅｗｙ小体。而本研究中９例具有ｐａｒｋｉｎ基因纯合或复杂杂合突 变的患者都没有出现嗅觉的异常，这个结果在一定程度上为Ｂｒａａｋ等的推断提供了依据。总的来说，ｐａｒｋｉｎ基因无论是纯合突变还是杂合突变在帕金森病的疾病发生和 发展中都起着很重要的作用。４１浙江大学硕士学位论文结论４结论（１）采用荧光定量ＰＣＲ、ＤＨＰＬＣ和直接测序相结合的方法对ｐａｒｋｉｎ基因进行 突变检测，在不影响检测结果的前提下更为快速高效。 （２）本组研究中１９例患者被发现有ｐａｒｋｉｎ基因外显子的重排突变，并在国际 上首次报道了ｐａｒｋｉｎ基因１号外显子上的一个点突变位点ｅ．２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｍ１Ｔ）。本组研 究ｐａｒｋｉｎ基因的突变率为２８％，低于大多文献报道的５０％，很可能是因为我们选 的患者多是散发性的，而不是家族性ＰＤ。 （３）４例患者具有ｐａｒｋｉｎ基因外显子纯合重排突变，突变都位于３号或４号外 显子，提示ｐａｒｋｉｎ基因第３、４号外显子可能为中国帕金森病患者的突变热点．（４）在删基因上发现７个ＳＮＰｓ，其中两个为新位点ｃ．８７３Ｃ＞ＴＱ．Ａ２９１Ａ）和ｃ．７７７．３４Ｔ＞Ｃ，但没有发现致病突变，这正是说明了ＰＩＮＫｌ基因的低突变率，而 且在我国的ＰＤ患者中尤为低。（５）有ｐ删ｌ送因突变的患者发病年龄明显早于没有突变的患者，而其他临床表现没有明显差异，无法从临床表现上去判断ＰＤ患者是否含有ｐａｒｋｉｎ或Ｐ１ＮＫｌ基因 的突变。４２浙江大学硕士学位论文参考文献参考文献【１】Ｓｃｈｒａｇ八Ｓｃｈｏｔｔ ＪＭ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｄｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２００６；５（４）：３５５―３６３． ＭＪ．Ｐａｒｋｉｎｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｏｎｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ【２】ＭａｔａＩＦ，Ｌｏｃｋｈａｒｔ ＰＪ，Ｆａｒｒｅｒｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２００４；１３：Ｒ１２７一Ｒ１３３．［３】ＬｕｃｋｉｎｇＳｔｕｄｙＣＢ，Ｄｕｒｒ Ａ，ＢｏｎｉｆａｔｉＶｅｔ ａｌ；Ｆｒｅｎｃｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ＳＤｉｓｅａｓｅ ＧｅｎｅｔｉｃｓＧｒｏｕｐ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔＰａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓｄｉｓｅａｓｅａｎｄｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｋｉｎ ｇｅｎｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０００；３４２：１ ５６０―１ ５６７．［４】Ｅｒｉｋｓｅｎ儿，ＷｓｚｏｌｅｋＺ，ＰｅｔｒｕｃｅｌｌｉＬ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ，２００５；６２：３５３―３５７．【５】ＧａｓｓｅｒＴ．Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｆｏｒｍｓｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，２００９；１ ７９２：５８７―５９６．［６】Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ＭＨ，Ｌａｖｅｄａｎｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎＣ，Ｌｅｒｏｙ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ仅一ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１ ９９７；ｆａｍｉｌｉｅｓ２７６：２０４５－２０４７．【７】Ｋｉｔａｄａ Ｔ’Ａｓａｋａｗａ Ｓ，Ｈａｔｔｏｆｉ Ｎ，ｅｔａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｋｉｎ ｇｅｎｅｃａｕｓｅａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ，１ ９９８；３９２：６０５―８．【８】Ｇａｓｓｅｒ Ｔ，Ｍｔｉｌｌｅｒ－Ｍｙｈｓｏｋ Ｂ，Ｗｓｚｏｌｅｋ ＺＫ，ｅｔ ａ１．Ａ 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Ｈ．，ＪｏｎｓｓｏｎＴ，ｅｔａ１．’Ａ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｌａｔｅ―ｏｎｓｅｔｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，２００２：５２：５４９．５５５．［１６】Ｌａｕｔｉｅｒ Ｃ，Ｇｏｌｄｗｕｒｍ Ｓ，Ｄｕｒｒ Ａ，ｅｔａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎ ｔｈｅＧＩＧＹＦ２（ＴＮＲＣ １ ５）ｇｅｎｅ ａｔ ｔｈｅ ＰＡＲＫｌ １ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２００８；８２（４）：８２２＿８３３． 【１７】Ｐａｎｋｒａｔｚ Ｎ，ＮｉｃｈｏｌｓＷＣ，ＵｎｉａｃｋｅＳＫ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓａａｎｄｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ―ｂｙ－ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｓａｍｐｌｅ ｏｆ ３６２ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｆａｍｉｌｉｅｓ．Ｈｕｍ ＭｏｌｅｃＧｅｎｅｔ，２００３：１２：２５９９．２６０８．Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ【１８】ＳｔｒａｕｓｓＫＭ，Ｍａｒｔｉｎｓ ＬＭ，Ｐｌｕｎ―Ｆａｖｒｅａｕｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２００５；１４：２０９９＿－２１１ １．［１９】Ｐａｉｓａｎ－ＲｕｉｚＣ，ｅｔａ１．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＰＬＡ２Ｇ６ａｓａｌｏｃｕｓｆｏｒｄｙｓｔｏｎｉａ－ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００９；６５：１ ９―２３．浙江大学硕士学位论文参考文献【２０】ＤｉＦｏｎｚｏ Ａ，ｅｔ ａ１．ＦＢＸ０７ ｍｕｔａｔｉｏｎｓｃａｕｓｅａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ，ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ－ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００９；７２：２４０―２４５．［２ １】ＧａｓｓｅｒＴ－Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｆｏｒｍｓｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂ