【图文】细菌数量测定---标准平板计数法_百度文库
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细菌数量测定---标准平板计数法
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微生物学实验技术指导书
实验须知普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能； 了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过 实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事 求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公 物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方 法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、 及时做好实验记录， 对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验， 则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细， 全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或 瓶不慎打破、 皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时， 应立即报告指导老师， 及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险， 应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和 药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌 面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用 3%来苏尔液或 5%石碳酸液覆盖 0.5 小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻 璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在 3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指 定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果， 应以实事求是的科学态度填入报告表中， 力求简明准确， 认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。微生物学实验室常用器皿微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌后用来培养微生物，因此 对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿一般要求硬质玻璃，才不 受高温和短暂的烧灼而不至破裂；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养 基的酸碱度； 玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器 皿的方法不当，也会影响实验的结果。目前国外微生物学实验室中，有些玻璃器 皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实 验室用具。 本节将主要对玻璃器皿做详细介绍，同时也对接种或转移微生物工具 做相应的说明。 一、器皿的种类、要求与应用 1.试管（test tube） 微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这要在 塞棉花塞时管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A） ，不然，微 生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管造成污染，也不便于盖试管帽。有的实 验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需要使用螺口试管，盖以螺口胶木塞或塑 料帽（图Ⅰ-1，B，C） 。培养细菌一般用金属（如铝）帽或棉塞（图Ⅰ-1，D，E） 。 也有的用泡沫塑料塞。 试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号： （1）大试管（约 18mm ?180mm） ，可盛倒平板用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需大量菌体时用） 和盛液体培养基用于微生物的振荡培养； （2） 中试管 （约 13-15mm?100-150mm） ， 盛液体培养基培养细菌或作琼脂斜面用，亦可用于细菌、病毒等的稀释和血清学 试验； （3）小试管（10-12mm?100mm） ，一般用于糖发酵或血清学试验，和其他 需要节省材料的试验。 2.德汉氏小管（Durhamtube） 观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时， 一般在小试管内再套一倒置的小套 管（约 6mm?36mm）（图Ⅰ-2，A） ， 。此小套管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。 3.小塑料离心管，又称 Eppendorf 管（图Ⅰ-2，B） 。有 1.5ml 和 0.5ml 两种 型号，主要用于微生物分子生物学实验中，小量菌体的离心、DNA（或 RNA）分 子的检测、提取等。 4.吸管（pipette） （1）玻璃吸管（glass pipette）和吸气器（aspirator） ①玻璃吸管 微生物学实验室一般要准备 1、5、10ml 的刻度玻璃吸管。这种吸管一般有 两种类型，一种是称之为血清学吸管（serological pipette） ，这种吸管刻度指 示的容量包括管尖的液体体积，使要将所吸液体吹尽（图Ⅰ-3，A） ；另一种类型称之为测量吸管（measuring pipette） ，这种吸管刻度指示的容量不包括管尖的 液体体积，使用时不能将所吸液体吹尽，而是到达所设计的刻度为止（图Ⅰ-3， B） 。 除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图Ⅰ-3，C） 来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。 ②吸气器 在使用刻度玻璃吸管时，一般可采用几种不同的吸气器。图Ⅰ-4 中的三种 类型目前都有市售。 使用时， 将吸管插入吸气器下端， 通过旋动转盘键 （图Ⅰ-4， A 中的 a） ，或按图Ⅰ-4，B 中的不同部分（b、c、s） ，或按图Ⅰ-4，C 中的 d、e 键来吸取或释放液体。如果嘴吸，则一定要在吸管上端塞有棉花。 用刻度吸量管取液体的体积时，以液体的凹面为准（图Ⅰ-3，D） 。 （2）微量吸管（micropipette）又称微量加样器，主要用来吸取微量液体， 规格型号很多，图Ⅰ-5 表示其中的一种型号。每个微量吸管在一定范围内可调 节几个体积，并都标有使用范围，例如：0.5～10μ l、2～10μ l、10～100μ l、 100～1000μ l 等。使用时：①将合适大小的塑料嘴（tip）牢固地套在微量吸管 的下端；②旋动调节键（图Ⅰ-5，A） ，使数字显示器上（图Ⅰ-5，B）显示出所 需要吸取的体积；③用大拇指按下调节键（图Ⅰ-5，C） ，并将吸嘴插入液体中； ④缓慢放松调节键，使液体进入吸嘴，并将其移至接收试管中；⑤按下调节键， 使液体进入接收管；⑥按下排出键，以去掉用过的空吸嘴或直接用手取下吸嘴。 除了可调的微量吸管外，也有不可调的，即一个吸管只固定一种体积。因应 用范围受到限制，所以一般用得较少。 5.培养皿（petri dish） 常用的培养皿 （图Ⅰ-6） 皿底直径 90mm， 15mm， ， 高 皿底皿盖均为玻璃制成， 但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养皿表面干燥。例如 测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。 在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种， 活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。 6.三角烧瓶（erlenmeyer flask）与烧杯（beaker） 三角烧瓶有 100、250、500 和 1000ml 等不同的大小，常用来盛无菌水、培 养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有 50、100、250、500 和 1000ml 等，用 来配置培养基与各种溶液等。 7.注射器（injector） 一般有 1、2、5、10、20、25ml 不同容量的注射器。注射抗原于动物体内， 可根据需要使用 1、2、5ml 的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用 10、20、 50ml 的。微量注射器有 10、20、50、100μ l 等不同的型号。一般在免疫学或纸层析、 电泳等实验中滴加微量样品时应用。 8.载玻片（slide）与盖玻片（coverslip） 普通载玻片大小为 75mm?25mm，用于微生物涂片、染色、做形态观察等。 盖玻片为 15mm?18mm。 凹玻片是在一块较厚玻片的当中有一圆形凹窝（图Ⅰ-7） ，做悬滴观察活细 菌以及微室培养用。 9.双层瓶（double bottle） 由内外两个玻璃瓶组成（图Ⅰ-8） ，内层小锥形瓶放香柏油，供油镜头观察 微生物时使用，以瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。 10.滴瓶（dropper bottle） 用来装各种染料、生理盐水等（图Ⅰ-9） 。 11.接种工具 接种工具有接种环（inoculating loop） 、接种针（inoculating needle） 、 接种钩 （inoculating hook） 接种铲 、 （inoculating shovel） 玻璃涂布器 、 （glass speader）等（图Ⅰ-10） 。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬 适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针， 其铂丝或镍死直径以 0.5mm 为适当，环的内径为约 2-4mm，环面应平整。 图Ⅰ-11 表示一个简易地制作接种环的方法。接种某些不易与培养基分离的 放线菌和真菌有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要粗一些约 1mm。用涂布法在 琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻璃棒弯曲（图Ⅰ-12）或将 玻璃棒一端烧红后压扁而成。 二、玻璃器皿的清洗方法 清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是 实验前的一项重要准备工作。 清洗方法根据实验目的、 器皿的种类、 所盛的物品、 洗涤剂的类别和玷污程度等的不同而有所不同。现分述如下： 1.新玻璃器皿的洗涤方法 新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般 用 2%的盐酸或洗涤液（见附录Ⅶ） 。浸泡后用自来水冲洗干净。 2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法 （1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉 或去污粉等洗涤剂刷洗， 然后用自来水充分冲洗干净。 热的肥皂水去污能力更强， 可有效地洗去器皿上的油污。 洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一 层微小粒子，故要用水多次甚至十次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再 用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱内烘干。 玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若 挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。 装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸 在 2%煤酚皂溶液 （来苏水） 0.25%新洁尔灭消毒液内 24 小时或煮沸 0.5 小时， 或 再用上法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再 进行洗涤。 盛放一般培养基用的器皿经上述方法洗涤后，即可使用，若需精确配置化学 药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次， 晾干或烘干后备用。 （2）玻璃吸管 吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的玻璃吸管（包括毛细 吸管） ，使用后立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内（量筒或标本瓶底应垫有 脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损） ，免得干燥后难以冲洗干净，待实验完毕， 再集中冲洗。 若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡 皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动 洗涤器的实验室，可用冲出棉花的方法多冲洗片刻，必要时再用蒸馏水淋洗。洗 净后放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。 吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有 2%煤酚皂溶液，或 0.25% 新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24 小时后方可取出冲洗。 吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。 （3） 载玻片与盖玻片 用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸 擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸 5-10 分钟，用 软布或脱脂棉花擦拭，立即用自来水冲洗，然后再稀洗涤液中浸泡 0.5-2 小时， 自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于 95%乙醇中保存备用。 使用时在火焰上烧去乙醇。 用此法洗涤和保存的载玻片与盖玻片清洁透亮，没有 水珠。 检查过活菌的载玻片与盖玻片应先在 2%煤酚皂溶液或 0.25%的新洁尔灭消 毒液中浸泡 24h，然后按上述洗涤与保存。 三、空玻璃器皿的包装 1.培养皿的包装 培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以 5-8 套培养皿作一包，少于 5 套工作量 太大，多于 8 套不易操作。包好后行干热或湿热灭菌。如将培养皿放入金属（不 锈钢）筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒型的带盖外筒，里面 放一装培养皿的框架（图Ⅰ-13） ，此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。 2.吸管的包装准备好干燥的吸管， 在距其粗头顶端约 0.5cm 处，塞一小段约 1.5cm 长的棉 花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰 当（过紧吹吸液体太费力；过松吹气时棉花会下滑） ，然后分别将每支吸管尖端 斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约成 45°（图Ⅰ-14） ，并将左端多余的一段 纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，再将右端多余的报纸打一小结。如此 包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。 如果有装吸管的铜或不锈钢筒（图Ⅰ-15） ，亦可将分别包好的吸管一起装入 筒内，进行灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包，而直接 装入筒内灭菌，但要求吸管尖朝筒底。使用时，将筒卧放在桌上，用手持粗端抽 出。 3.试管和三角烧瓶等的包装 试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验十六）或泡沫塑 料塞， 然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用二层报纸以细线包扎好（如果能用铝 箔则更好，可省去用线扎且效果好） 。进行干热或湿热灭菌，试管塞好塞子后也 可一起装在铁丝篓中， 用大张报纸或铝箔将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的 在于保存期避免灰尘侵入。 空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外 面最好加一层牛皮纸或铝箔。实验一、显微镜的构造及使用方法 一、目的要求 （1）了解显微镜的构造、性能及成像原理。 （2）掌握显微镜的正确使用及维护方法。 二、实验器材 （1）显微镜、擦镜纸。 （2）酵母菌示教标本。 三、普通光学显微镜简介 对于微生物，使用肉眼难以直接观察其形态结构，只有借助于显微镜，才能 对它们进行研究和利用。 因此显微镜是必不可少的工具。为了充分发挥显微镜的 工作性能，首先必须了解每一部件的结构和功能，通过反复使用，熟练地掌握其 操作技术。 显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。后者包括：明视野显微镜、 暗视野显微镜、差相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、紫外显微镜及立体显微 镜等。其中以明视野显微镜常用，其它显微镜都是在此基础上发展而来的，基本 结构相同，只是在某些部分做了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。 （一）显微镜的构造 光学显微镜的基本构造可分为机械系统和光学系统两大部分（图 1-1） 。 1.机械系统 （1）镜座（Base） ：在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。 （2）镜壁（Arm） ：连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微 镜时的握持部分。 （3）镜筒（Tube） ：位于镜壁上端的空心圆孔，是光线的通道。镜筒的上端 可插入接目镜，下面与转换器相连。镜筒的长度一般为 160mm。显微镜分为直筒 式或斜筒式，有单筒式的也有双筒式的。 （4）转换器（Nosepiece） ：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有 3-4 个孔，用于安装不同放大倍数的接物镜。 （5）载物台（Stage） ：是支持被检标本的平台，呈圆形或方形。中央有孔 可透过光线，台上有用来固定标本的夹子和标本移动器。 （6）调焦旋钮：包括粗调焦旋钮（Coarse adjustment knob）和细调焦旋 钮（Fine adjustment knob） ，是调节镜筒或载物台上下移动的装置。 2.光学系统 （1）接物镜（Objective lens） ，常称为镜头，简称为物镜，是显微镜中最 重要的部分，由许多快透镜组成。其作用是将标本上的待检物进行放大，形成一 个倒立的实像， 一般显微镜有 3-4 个物镜，根据使用方法的差异可分为干燥系和油浸系两组。干燥系物镜包括低倍物镜（4-10X）和高倍物镜（40-45X） ，使用时 物镜与标本之间的介质是空气；油浸系物镜（90-100X）在使用时物镜和标本之 间加有一种折射率与玻璃折射率几乎相等的油类物质（如香柏油）作为介质，在 物镜上经常标有两组数字（图 1-2） 。 （2）接目镜（Eyepiece lens） ：通常称为目镜，一般由 2-3 块透镜组成。 其作用是将由物镜所造成的实像进一步放大，并形成虚像而反映于眼帘。目镜上 也刻有表示放大倍数的标志，如 8X、10X、16X，一般显微镜的标准目镜是 10X， 小于 10X 的目镜用得不多。 （3）聚光镜（Condenser）位于载物台的下方，有两个或几个透镜组成，其 作用是将由光源来的光线聚成一个锥形光柱。 聚光器可以通过位于载物台下方的 聚光器调节旋钮进行上下调节，以求得最适光度。聚光器还附有虹彩光圈（Iris diaphragm） ，借此调节锥形光柱的角度和大小，以控制进入物镜的光的量。 （4）反光镜：反光镜是一个双面镜，一面是平面，另一面是凹面。起着把 外来光线变成平行光线进入聚光镜的作用。使用内光源的显微镜就不需反光镜。 （5）光源：日光和灯光均可，以灯光较好，其光色和光强都比较容易控制， 有的显微镜采用装在底座内的内光源。 （二）显微镜的成像原理 显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本 S 经物镜 LO 放大后， 在目镜 LE 的焦平面上形成一个倒立的实像 I1，再经目镜 LE 的进一步放大形成一 虚像 I2，被人的眼睛 E 所观察到（图 1-3） 。 （三）显微镜的性能 1.分辨力和数值口径 显微镜的分辨力（Resolving power）是指显微镜将样品中相互接近的两点 清晰的分辨出来的能力。 它主要取决于物镜的分辨率，物镜的分辨率是所用光的 波长和物镜的数值口径的函数。分辨力用镜头所能分辨出的两点间最小距离表 示，距离越小分辨能力越好，其关系如下： D=λ /(2 N.A) 其中λ -入射光的波长 N.A -物镜的数值口径 D-显微镜的分辨率 从式中可见， 减少入射光的波长可以提高分辨能力，但由于可见光波长范围 比较窄（约为 0.38-0.77μ m） ，利用紫外光源只适用于显微摄影而不能用于直接 观察。因此提高分辨率的最好方法是增加数值口径。 物镜的数值口径（Numberical aperture）简写为（N.A） ：表示从聚光器发 出的锥形光柱照射在观察的标本上，能被物镜所聚集的量。它由下式决定：N.A=n?sinθ 式中 n-标本和物镜之间介质的折射率 θ -由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角（图 1-4） 。 光线投射到物镜的角度越大，数值口径就越大。该角度的大小取决于物镜的 直径和焦距。以空气为介质时（n=1.00） ，数值口径不超过 1，如果采用一些高 折射率的物质作介质，如使用油镜时采用香柏油作介质，则数值口径增大，从而 提高分辨能力。各种物质的折射率见表（1-1） 。 表 1-1 介质 折射率 （21℃） 空气 1.00 水 1.33 石蜡油 1.46 香柏油 1.51 玻璃 1.52 香脂 1.53 溴化萘 1.60物镜上标有数值口径。低倍镜（10X）为 0.25，高倍镜（40X）为 0.65，油 浸镜（100X）为 1.25。 这些数值是在其他条件都适宜的情况下的最高值，实际 使用时往往低于所标的值。 聚光镜也有一定的数值口径。常用的阿贝聚光器的 N.A 值是 1.25，有的可 达 1.40。在聚光器和标本之间加香柏油，也能将数值口径提高。聚光器的 N.A 可用虹彩光圈来调节， 此值和所用的物镜的 N.A 值相配合，最好是等于或稍大于 物镜的 N.A 值， 以便使进入物镜的光柱的角度达到正好能够均匀照满物镜背面透 镜的程度。 2.放大倍数、焦距和工作距离 显微镜的放大倍数是物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。放大倍数一样 时，由于物镜和目镜搭配不同，其分辨力也不同。如数值口径大的 40X 物镜和 5X 的目镜相搭配，其分辨率比数值口径小的 10X 物镜和 20X 目镜相搭配时要高 些。一般说，增加放大倍数应该是尽量用放大倍数高的物镜。物镜的放大倍数越 大焦距就越短，物镜和样品之间距离（工作距离）便缩短。在观察时必须注意防 止损坏样品或透镜。 （四）显微镜的使用指南 （1）移动显微镜时，要一手握持镜臂，一手托着镜座。 （2）使用时，应通过调整凳子高度，以便能舒适地观察，勿将显微镜倾斜。 （3）在观察标本时，应两眼同时睁开，这样既能同时绘图，又能减少疲劳。 （4）调焦应细心，应采取将物镜调离标本的方法。 （5）用低倍镜时，光圈要适当缩小，以获得较好的对比度。随着放大倍数 的增大，所需要光的量也要加大。 （6）镜检时，应首先用低倍镜进行调焦，再换高倍镜，最后用油浸镜进行 观察。 （7）保持载物台清洁、无油。除油浸镜外，其他物镜不得接触香柏油。（8）所有透镜应保持清洁，只能用擦镜纸擦拭镜头，不得用手触摸透镜。 （9）结束后，取下标本片，将油浸镜上的浸油擦拭干净，盖上防尘罩放回 箱中。 （10）显微镜发生故障，应及时向指导老师汇报，未经同意，不得随便更换 显微镜。 （五）操作步骤 （1）将显微镜平稳地置于实验台上，使其与镜检者间的距离适中，镜检者 姿势要端正，一般用左眼观察，右眼用于绘图或记录。 （2）采光：直射的阳光光线过强，会影响物象的清晰，刺激眼睛，反射热 会损坏光学装置。一般以间接日光为宜。采用白炽灯为光源时，应在聚光镜下加 一蓝色滤光片，除去黄色光。 转动反光镜，使光线集中于聚光器。升降聚光器和调节光圈，以获得合适的 光量。用低倍镜观察时，应下降聚光器，缩小光圈；如为染色标本，用高倍镜或 油浸镜观察时，应上升聚光器，扩大光圈，以获得最大的光量。 （3）固定标本：将标本固定在载物台上，将预检部位移至物镜正下方。 （4）待检标本须先用低倍镜观察，因低倍镜视野较大，易发现目标和确定 观察的位置。转动转换器，将低倍镜转入光路，在转动粗调焦旋钮，使镜筒下降 至物镜与标本片之间距离小于工作距离， 调节聚光器和光圈， 以获得合适的光量， 由目镜观察同时用粗调焦旋钮慢慢的升起镜筒，直至物象在视野中出现后，再用 细调焦旋钮调节至物象清晰为止，绘图记录，或将合适的目的物移至视野中心， 准备用高倍镜观察。 （5）高倍镜观察：显微镜的所有物镜一般是共焦点的，因此用低倍镜对准 焦点后将高倍镜转入光路， 基本上也是对焦点的，只要稍转动细调焦旋钮即可获 得清晰图像。勿忘调节光量。有些简易的显微镜不是共焦点的，或者由于物镜的 更换而不能达到共焦点，就要采取上述调焦方法，待获得清晰物象后，观察绘图 记录或继续用油浸镜观察。 （6）油浸镜观察：具体操作方法见实验五。 （7）显微镜使用完毕，取下标本片，用绸布擦净显微镜的金属部件，用擦 镜纸擦拭镜头。 （8）将各部分复原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成八字形，将镜筒下降 至最低位置，同时把聚光器降下。以免与物镜相碰。 （9）罩上显微镜防尘套，将显微镜放回箱中。 四、实验内容 （1）根据讲义内容，对照实物熟悉显微镜的构造。 （2）按显微镜的使用方法，分别用低倍镜和高倍镜对酵母菌示教标本进行观察。 五、思考题 （1）哪个物镜的工作距离最短？哪个最大？ （2）哪些部件控制着到达物镜的光量？ （3）有哪些方法可以提高显微镜的分辨力？ （4）为什么在高倍镜和油浸镜观察标本之前要先用低倍镜观察？实验二、酵母菌细胞形态观察、死活细胞的染色鉴别 一、目的要求 1.通过观察了解酵母细胞的形态结构。 2.掌握鉴别酵母细胞死活的染色方法。 二、实验材料 1.菌种：酵母菌菌悬液 2.染料：0.1%的美兰染色液 3.其他：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、擦镜纸、吸水纸等。 三、基本原理 酵母菌细胞较大，不必染色即可用显微镜观察其形态。 用美兰染色液可对酵母细胞进行死活细胞染色鉴别。美兰是一种弱氧化剂， 氧化态呈蓝色，还原态呈无色。活的酵母细胞，因新陈代谢的不断进行，具有一 定的还原能力，能将进入细胞的美兰还原，而细胞不被染色。因此，用美兰对酵 母细胞染色一定时间后，无色的为活细胞，呈蓝色的则为死亡细胞。需要注意的 是，一个活酵母菌的还原能力是一定的，必须严格控制染料的浓度和染色时间。 四、方法与步骤 1.酵母菌细胞形态的观察 取洁净的载玻片一块， 用滴管取酵母悬浊液滴于载玻片中央， 取盖玻片一块， 小心的将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢的将盖玻片放下，以避免产生气泡。 至此，一片酵母菌水浸标本就制成了。 （如图 2-1） 先用低倍镜观察， 再用高倍镜观察。 观察时注意酵母细胞的形状及出芽情况。 2.死活酵母细胞的染色鉴别 取 0.1%美兰液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，加一滴酵母菌悬液，混 合均匀，染色 3-5 分钟后加盖玻片制成水浸标本片，镜检。 五、实验内容 1.制片观察所给酵母菌的细胞形态。 2.用美兰液对酵母菌死活细胞进行染色鉴别。 六、实验结果与思考题 1.绘图表示所观察的酵母，注明菌名和放大倍数。 2.用美兰对酵母菌死活细胞进行染色鉴别时， 为什么要控制染料的浓度和染 色时间？实验三、酵母菌细胞大小的测定 一、目的要求 了解测量微生物大小的原理， 学习并掌握接目测微计的校正方法及微生物大 小的测定方法。 二、材料 1.菌种：啤酒酵母菌悬液 2.其他：显微镜、接目测微计、镜台测微计、载玻片、盖玻片。 三、基本原理 微生物细胞个体较小， 其大小的测量一般是在显微镜下用专用的测量工具― 接目测微计来进行。 接目测微计是一块圆形玻片，其中央刻有精确的等分线。测量时，将其放入 目镜的隔板上，也有专用的目镜，里面已安放好接目测微计。由于接目测微计所 测量的是微生物经过显微镜放大后所成像的大小， 而接目测微计每一小格所代表 的实际长度随目镜和物镜的放大倍数而改变，所以，在测量前必须用镜台测微计 对接目测微计进行校订， 确定此时接目测微计每小格所代表的实际长度，镜台测 微计是中央部分刻有精确等分线的载玻片。刻度总长为 1mm，被等分成 100 格， 每小格长是 1μ m，镜台测微计专用于对接目测微计进行标定。 四、方法和步骤 1.接目测微计的标定 （1）取出目镜，旋开其上的透镜，将接目测微计放在目镜的光阑上（有刻 度一面向下） ，然后旋上透镜，插入镜筒。 （2）将镜台测微计固定在显微镜的载物台上，使有刻度的一面向上，不可 放反。 （3）将低倍镜转入光路，调准焦距后，转动接目测微计，使两个接目测微 计的刻度线相平行， 调节镜台测微计，使接目测微计的一条刻度线与镜台测微计 的一条刻度线相重合，再寻另一重合线（见图 3-1） ，分别数出其间接目测微计 及镜台测微计的格数。计算接目测微计每小格所代表的实际长度。例如：若在两 条重合刻度线之间，接目测微计为 45 格，镜台测微计为 10 格，那么，此时接目 测微计每小格所代表的实际长度=（10 格?10μ m）/45 格=2.2μ m。 （4）再以高倍镜按上述方法对接目测微计进行标定。 2.酵母菌细胞大小的测定 取下镜台测微计， 换上菌体水浸片。用接目测微计测量菌体细胞的长和宽各 占几格，然后计算其实际大小。为了尽量减少实验误差，应在同一标本片上进行 测量 5-10 个菌体，取其平均值作为该菌的大小。 五、实验结果1.接目测微计校正的结果填入下表 放大倍数 目镜?物镜 10?10 10?40 16?10 16?40 2.将酵母菌细胞大小值填入下表 细胞序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 六、思考题 为什么随着显微镜放大倍数的改变， 接目测微计每格代表的实际长度也会改 变？你能找出这种变化的规律吗？ 长（μ m） 宽（μ m） 两条重合刻度线之间格数 接目测微计 镜台测微计 接目测微计 每小格代表的 实际长度（μ m）实验四、酵母菌细胞总数及出芽率的测定 一、目的要求 了解血球计数板的构造，掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、材料 1.菌种：啤酒酵母菌悬液 2.其他：显微镜、血球计数板、滴管、吸水纸、擦镜纸 三、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数法。此法是 将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液， 注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的 计数室中， 在显微镜下进行计数的。由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室 的容积是一定的， 所以可根据在显微镜下观察到的菌数或孢子数换算成单位体积 试样中的菌数。此法所计得数值为死菌与活菌的总和，故又称为总菌计数法。 血球计数板由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成（见图 4-1） ，玻片上有 4 条凹槽，构成三个平台，中间的平台较宽，其中央又被一短槽分割成两半，每个 半边上面各刻有一个方格网。 每个方格网被划分为九个大格，其中央大格再划分 为若干中格， 每个中格的四周刻有双线， 作为中格的界限， 在显微镜下便于区分。 中央大格又称为计数室，微生物计数就在此计数室中进行。 计数室的规格有两种： 目前常用的是 25?16 型，其计数室被分成 25 个中方 格，每一中方格又分成 16 个小方格。另一种是 16?25 型，其计数室被分成 16 个中方格，每一中方格又分成 25 个小方格。无论哪种规格，计数室的小方格数 都是相同的，即 16?25=400 个小方格。 中央大格的边长为 1mm，面积为 1mm2，计数室与盖玻片间的深度为 0.1mm， 所以计数室的体积为 0.1mm3。 计数时，如用 25?16 型计数板，通常数对角线上的 5 个中方格（即左上、 右上、左下、右下、中央共 80 个小方格）的细胞总数。如用 16?25 型的计数板， 通常数对角线上的 4 个中方格（即左上、右上、左下、右下共 100 个小方格）的 细胞总数，然后根据下列公式求得菌液的浓度： 25?16 型： 细胞总数/ml=（80 小方格内的菌数/80）?400?1000?10?稀释倍数 16?25 型： 细胞总数/ml=（100 小方格内的菌数/100）?400?1000?10?稀释倍数 三、方法与步骤 1.取一块洁净的血球计数板，在计数室上面加盖一块专用的厚盖玻片。 2.用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，让菌液靠毛细作用渗入计数室，注 意不能有气泡产生。将计数板置显微镜的载物台上，静止 5min，使细胞全部沉降到计数板的表面。 3.分别统计 5 个中方格（25?16 型）或 4 个中方格（16?25 型）中酵母菌 细胞总数及芽体数。酵母菌的芽在未脱离母细胞前，若已达母细胞的 1/2 大小， 则不作为芽体，而作为成熟的细胞计数。 在计数时， 若遇到位于中方格间线上的细胞，一般是只统计位于右线及上线 上的细胞。为了尽量减少实验误差，应注意以下两点： ①一般以每个小方格中平均 4-6 个细胞为宜，过多时应对样品进行稀释。 ②对同一样品要重复计数两次，取其平均值；若两次统计数据相差太多，则 应重复计数。 4.使用完毕后，应将计数板用清水清洗干净（绝对不能用硬物洗刷） ，待自 行晾干或用电吹风吹干后装入盒中。 五、实验结果 将实验结果填入下表 重复实验 1 2 平均值 六、思考题 1.为什么计数室内不能有气泡？试分析产生气泡的原因。 2.试分析影响本实验结果的误差来源及提出改进措施。 3.能不能用血球计数板在油浸镜下对细胞计数？为什么？ 5 个或 4 个中方格中 酵母菌总数 芽体总数 稀释倍数 菌液浓度 （个/ml） 出芽率（%）实验五、显微镜油浸镜的使用方法 一、 目的要求 1. 熟练掌握低倍镜和高倍镜的使用技术 2. 掌握油浸镜的使用技术及观察细菌形态的基本方法。 二、 实验材料 1.菌种：细菌染色标本。 2.其他：显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。 三、基本原理 根据显微镜物镜与载玻片之间的介质的不同，可将物镜分为两组，即干燥系 物镜和油浸系物镜。进口显微镜的油镜标有一黑圈“○I”或“HI”等字样，国 产显微镜的油镜多以一红黑或一白黑表示。在油浸系中，载玻片与镜头之间多用 香柏油作介质，因香柏油的折射率（n=1.51）与玻璃的折射率（n=1.52）几乎相 等，故透过载玻片的光线通过香柏油后，直接进入物镜，而不发生折射。与干燥 系物镜相比，油浸镜的数值口径 N.A 值较大，分辨力较高。两组物镜光线通路的 区别如图 5-1 所示。 细菌是单细胞原核微生物，形体很小，大多直径或宽度小于 1μ m，必须借 助于油浸镜方能观察清楚。 四、方法与步骤 1.将细菌染色标本放在显微镜的载物台上，先通过低倍镜和高倍镜观察， 将待检部位（即细菌较分散的部分）移至视野中央。 2.升高镜筒，将油镜转入光路。 3.将聚光器上升至最高点，并适当开放光圈，以获得较强的光线。 4.在标本片的待检部位，滴加一滴香柏油。 5.从侧面注视，用粗调旋钮将镜筒小心缓慢地降下，使镜头浸润在香柏油 内。 6.从目镜观察，用粗调节旋钮上升镜筒，直至视野内出现物象，再用细调 节旋钮较准焦距至物象清晰为止。 如果油浸镜已离开油面仍未见物像，则应重复上述操作，至看到物象为止。 为了充分发挥油镜的分辨力，也可在聚光器与载玻片之间滴加香柏油，使 由聚光器射出的光不受折射而直接进入物镜。 7.观察完后，将镜筒升起，取下标本片，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油， 再用擦镜纸沾取少量的二甲苯， 擦去镜头上的残余油渍。 再用擦镜纸擦去二甲苯。 二甲苯能渗入物镜，溶解胶粘透镜的物质而损坏镜头。 8.使用完毕，用洁净的绸布把显微镜各部位擦拭干净，放入箱中。 五、实验内容用油浸镜观察所给的细菌染色标本，记录各菌特征。 六、实验作业 1.绘出所观察到的细菌形态图，注明菌名，放大倍数。 2.在使用油镜时，应特别注意什么问题？ 3.对同一微生物制片，用油镜观察比用低倍镜观察有何优、缺点？实验六、细菌的涂片及简单染色法 一、目的要求 掌握细菌的涂片和简单染色技术。 二、材料 1.菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌。 2.染料：吕氏美兰、番红 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、生理盐水、香柏油、二甲苯 三、基本原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透 明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与 背景形成明显的色差，从而能清楚的观察到其形态和结构。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性 染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合，因细菌蛋白质的等电点较低， 当它生长于中性、碱性或弱酸性溶液中时，常常带负电荷，所以通常采用碱性染 料（如美兰、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电 荷，能与带正电荷的物质相结合，当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细 菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染 料是前两者的结合物，又称复合染料。如伊红美兰、伊红天青等。 简单染色法即只用一种染料使细菌着色。此法虽手续简便，但一般只能显 示其形态，不能辨别其构造。 染色前必须先固定细菌。其目的有三：一是杀死细菌，固定其细胞结构。 二是保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉。三是改变菌体对 染料的通透性。 一般死细胞原生质容易着色。 常用的有加热和化学固定两种方法。 固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 四、方法与步骤 1.涂片：在洁净无油渍的载玻片中央滴一小滴生理盐水，用无菌操作（见 图 6-1）挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约 1cm2。 2.干燥：涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使其干得更快些，可 将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心的在酒精灯上高处微微加热，使水 分蒸发，但切勿仅靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 3.固定：涂片面朝上，在酒精灯火焰外层快速地来回通过 3-4 次，共约 3-4 秒。要求玻片温度不超过 60℃（用手背触涂片反面，以不烫手为宜） 。待玻片冷 却后再加染料。 4.染色：在已固定的涂片上加适量染色液，以盖满菌膜为度，染色 1-3min。 5.水洗：倾去染色液，用细流水冲洗涂片的背面，直至流下的水无染色液的颜色为止。 6.干燥：自然干燥，也可用吸水纸轻轻吸取水分（注意勿擦去菌体） 。或微 微加热，以加快干燥速度。 7.镜检：以低倍镜找到着色良好的部位，再用油浸镜观察。 五、实验结果 绘出大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数、染 色方法及观察到的颜色。 六、注意事项 1.玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 2.挑菌量宜少，涂片宜薄，厚则不易观察。 七、思考题 涂片为什么要固定？固定时应注意什么问题？实验七、细菌的革兰氏染色法 一、目的要求 学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、实验材料 1.菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2.染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液。 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二 甲苯等。 三、基本原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。1884 年由丹麦医师 Gram 创立。 细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条 件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫 做革兰氏阳性菌（G+） ，后者为革兰氏阴性菌（G-） 。为观察方便，脱色后再用一 种红色染料，如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 有芽孢的杆菌和绝大多数球菌， 以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧 菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。 革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色 反应不一样。 一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合 物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低， 吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。另外，与细菌细胞壁的化学组 成及结构有关。革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处 理使细胞壁脱水，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被保留在细 胞内，细胞不被脱色。革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，肽聚糖含量较低， 乙醇溶解了脂类物质，使细胞壁通透性增加，结晶紫――碘复合物易被抽出，于 是被脱色。 再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同 pH 条件下进行染色，阳性菌吸 附碱性染料较多， 因此不易脱去， 阴性菌则相反。 所以染色时的条件要严格控制。 四、方法与步骤 操作过程如下：涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色（1min）→水洗→ 路哥氏碘液媒染（1min）→水洗→95%乙醇脱色（30s）→水洗→番红复染（1min） →水洗→干燥→镜检。 革兰氏染色的关键在于严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被 误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色 结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。五、实验内容 1.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色。 2.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进行革兰氏染色。 六、实验作业 1.绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍 数及颜色。 2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超过 24 小时？ 3.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果不一致，试分析原因。 4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确，结 果可靠？实验八、细菌芽孢染色法 一、目的要求 掌握细菌的芽孢染色法。 二、材料 1.菌种：枯草芽孢杆菌。 2.染料：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、生理盐水、香柏油、二甲苯。 三、基本原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色。若用一般的染色法只 能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状） 。芽孢染色法就是根据芽孢既 难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。 所有的芽孢染色法都基于 同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌 体脱色，而芽孢上的染料难以渗出，故保留原有的颜色。然后用对比度强的染料 对菌体复染， 使菌体和芽孢呈现不同的颜色， 因而能明显衬托出芽孢， 便于观察。 四、方法和步骤 1.将培养了 24 小时左右的枯草芽孢杆菌作涂片、干燥、固定。 2.将孔雀绿染色液加 3-5 滴于已固定的涂片上。 3.用试管夹夹住载玻片在火焰上加热，使染料冒蒸汽（但不沸腾） ，切勿使 染料蒸干，必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约 5-7 分钟。 4.倾去染色液，等玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。 5.用番红染色液复染 1-3 分钟。 6.水洗、吸干。 7.镜检：用油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 五、实验结果 如实地、按比例地绘图说明枯草芽孢杆菌菌体的形状、芽孢的形状及其着 生位置。实验九、霉菌的形态观察 一、目的要求 学习霉菌的标本制备方法，观察根霉、毛霉、青霉、曲霉的形态构造。 二、实验材料 1.菌种：根霉、毛霉、青霉、曲霉平板。 2.染料：乳酸石炭酸棉蓝液。 3.其他：显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、解剖针、培养皿、玻璃棒、 滤纸、20%甘油。 三、基本原理 霉菌菌丝较粗大，细胞容易收缩变形，孢子容易飞散，在制备霉菌标本时， 常用乳酸石炭酸溶液作为介质，具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不易干燥，能 保持较长时间等优点。若加入棉蓝，又具有一定染色效果。 霉菌的有些结构在制片过程中易被破坏，影响观察，可采用载片培养法。 此法便于直接在显微镜下观察， 尤其适用于根霉的假根，曲霉的足细胞及分生孢 子链等结构的着生和生长情况的观察。 并且还可在同一标本上观察到微生物发育 的不同阶段的形态。 四、方法和步骤 1.一般观察法：加一滴乳酸石炭酸棉蓝液于洁净的载玻片中央，用解剖针 从菌落的边缘处挑取少量带有孢子的菌丝，放入乳酸石炭酸棉蓝液中，再细心地 把菌丝挑散开，加盖玻片，注意不要有气泡产生。置于显微镜下观察，菌丝呈蓝 色，颜色的深度随菌龄的增加而减弱。 观察根霉时，注意观察其菌丝（无横隔） 、假根、孢子囊柄（与假根相对着 生） 、孢子囊、囊轴、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。 观察毛霉时，注意观察其菌丝（无横隔） ，孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及 厚垣孢子。 观察曲霉时，注意观察其菌丝（有横隔） ，足细胞、分生孢子梗、顶囊、小 梗（形状、层数及在顶囊上的着生情况） ，分生孢子的着生情况。 观察青霉时，注意观察其菌丝（有横隔） ，分子孢子梗、帚状枝（小梗的轮 数及对称性） ，分生孢子的着生情况。 2.载片培养法： （1）湿室准备：在培养皿底部先放一张圆形滤纸，在滤纸上依次放上“Z” 形玻璃棒、载玻片和盖玻片（两片） ，盖上培养皿盖，用纸包扎好，高压（9.8 ?104Pa）灭菌 20 分钟。 （2）用接种环挑取少量霉菌孢子，置于湿室的载玻片中央，用无菌滴管滴 加少量冷却至 45℃左右的察氏培养基。（3）将镊子在火焰上灼烧灭菌后，取无菌盖玻片盖在培养基上，然后轻轻 压一下。用滴管取融化的石蜡将盖玻片三边密封，如图 9-1（1）所示。 （4）将 3-5ml 20%甘油倒于湿室内，以保持湿度，在培养皿上写上菌名、 日期、姓名。将制备好的载玻片放入湿室内，盖上皿盖（如图 9-1（2），置于 ） 28℃恒温箱中培养 2 天。 （5）将培养好的载玻片取出，置于显微镜下观察。 五、实验内容 1.观察根霉、毛霉、青霉及曲霉的外观形态，并制片观察其形态结构。 2.对根霉、青霉、曲霉作载片培养，观察其形态构造。 六、实验作业 1.绘出所观察到的各种霉菌的形态图，注明各种结构的名称。 2.列表比较根霉、毛霉、青霉、曲霉形态结构及繁殖方式的异同点。 3.为什么在实验室的一般培养条件下难以观察到霉菌的有性孢子？实验十、放线菌的形态观察 一、目的要求 学会放线菌制片方法，观察其形态特征。 二、实验材料 1.菌种：泾阳链霉菌（5406） 2.染料：石炭酸复红染液，吕氏美兰液。 3.其他：显微镜、载玻片、接种针等。 三、基本原理 放线菌是单细胞原核微生物，其菌落在培养基上着生牢固，不易被接种针 挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末状。放线菌由纤细的丝状细胞组成 菌丝体，菌丝内无隔膜。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝和由营 养菌丝向上生长生成的气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪 状或分支状等，其着生形式有丛生、互生和轮生三种。菌丝有各种颜色，有的还 能分泌水溶性色素到培养基内。孢子的表面光滑或粗糙、圆或椭圆，孢子有各种 颜色， 这些形态特征都是鉴定放线菌的重要依据。 放线菌菌丝的宽度与细菌类似， 必须染色后才能进行观察。 四、操作步骤 1.营养菌丝的观察 （1）用接种铲连同培养基挑取 5406 菌菌苔置载玻片中央。 （2）用另一载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片，干燥固定。 （3）用美兰或石炭酸复红染色液染色半分钟到一分钟，水洗。 （4）干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。 2.气生菌丝、孢子丝及孢子的观察 （1）将培养 3-4 天的 5406 放线菌的培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻 找菌落的边缘，直接观察气生菌丝和孢子丝的形态（分支情况、卷曲情况等） 。 （2）取洁净的盖玻片一块，在菌落上面轻轻按压一下，然后将印有痕迹的 一面朝下，放在滴有一滴美兰染液的载玻片上，将孢子等印浸在染色液中，制成 印片，用油镜观察孢子的形态、孢子丝等。 （3）去干净载玻片一片，在玻片中央加一小滴加拿大树胶，使树胶摊成一 薄层，放置数分钟，使略微晾干（但不要过分干燥） 。然后用小刀取 5406 菌培养 体一块（带培养基切下） 。将培养体表面贴在涂有树胶的玻片上，用另一玻片轻 轻按压（不要压碎） ，然后将放线菌培养体小心弃去，注意不要使培养体在玻片 上滑动，否则印痕模糊不清。将制好的印片通过火焰固定，用石炭酸复红染液染 色 1min，水洗晾干（不能用吸水纸吸干） 。用油镜观察孢子丝的形态及孢子排列 情况。五、实验内容 按上述方法制片观察 5406 菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子链及孢 子的形态。 六、实验作业 1.将观察结果绘图，并注明各部分名称。 2.比较各种方法的优缺点；在何种情况下，适宜用何种制片方法来观察， 效果最好？ 3.放线菌的菌体为何不易挑取？实验十一、酵母菌子囊孢子的培养及染色观察 一、目的要求 1.掌握酵母菌产生子囊孢子的特殊方法 2.学会子囊孢子的染色方法 二、材料 1.菌种：啤酒酵母 2399 2.染料：石炭酸番红液、酸性酒精、美兰液 3.培养基：醋酸钠琼脂斜面，麦汁液体培养基 4.其他：显微镜、载玻片、接种环、无菌带凹穴石膏块、生理盐水等 三、基本原理 子囊孢子的生成应具有下列条件： 1.供试验的酵母需营养好，活力旺盛。 2.培养时，需接触大量空气，促进细胞氧化作用，使其剧烈老熟而进入休 眠状态。 3.不能有充分的营养，需处于饥饿状态。 子囊孢子用普通的染色方法难以着色，应先用石炭酸番红液在加热的情况 下染色，染料不仅可以进入子囊，也可进入子囊孢子。当用酸性酒精脱色时，进 入子囊的染料被脱色，而子囊孢子应保持红色，用美兰液复染后，孢子呈红色， 而菌体呈蓝色。 四、方法与步骤 1.子囊孢子的培养 （1）在无菌培养皿内放置灭过菌的石膏块，并在石膏块外注入 1.5Bx 稀释 麦汁，以浸没石膏块高度一半为宜。向石膏块的凹穴内加 2-3 滴无菌水。 （2）在经 48h 麦汁培养的菌液，倾去上清液，将沉淀于底部的菌体接入石 膏块的凹穴内，盖上皿盖。 （3）于 25-28℃培养 5-8 天后镜检。 2.醋酸钠琼脂培养法 （1）将斜面菌种接入麦汁三角瓶，摇床培养 24h，离心分离，洗涤后得到 菌株。 （2）将菌体大量涂布于醋酸钠琼脂斜面上，于 25-28℃培养 3 天以上即可 产生子囊孢子。 3.子囊孢子的染色观察 （1）滴一滴蒸馏水于洁净的载玻片上，加菌体，涂片固定。 （2）滴加石炭酸番红液，在火焰上方加热约 5min，至冒气为止。必要时可 补加染料，冷却后，水洗。（3）加酸性酒精脱色 30s，水洗。 （4）加美兰液复染 1min，水洗，干燥后镜检。 五、实验内容 1.分别用上述两种培养法培养啤酒酵母 2399，使之产生子囊孢子。 2.对子囊孢子和子囊进行染色观察。 六、实验作业 1.绘图说明实验结果。 2.如果不产生子囊孢子，试分析其原因。实验十二、假丝酵母假菌丝的培养及观察 一、目的要求 掌握假菌丝的培养及其形态观察的方法。 二、实验材料 1.菌种：热带假丝酵母 2.培养基：玉米粉琼脂培养基，马铃薯浸出汁琼脂培养基 3.其他：显微镜、培养皿、盖玻片、凹玻片、接种环、固体石蜡、镊子等 三、基本原理 假菌丝的生成与培养基的种类、培养条件等因素有关。一般在厌氧条件下， 在马铃薯浸出汁或玉米粉琼脂培养基上较容易形成。 四、方法与步骤 1.平板培养法 取新鲜的酵母菌在薄层培养基平板上划线接种 2-3 条， 取无菌盖玻片盖在接 种线上，于 25-28℃培养 4-5 天后打开皿盖，置于显微镜下直接观察划线的两侧 所形成的假菌丝的形状。 2.凹玻片培养法 （1）将洁净的凹玻片和 18?18mm 盖玻片各一块放在一只培养皿中，灭菌 （9.8?104Pa，20min）后，在干燥箱内烘干。 （2）将已融化的培养基用无菌滴管滴加在盖玻片的中央，凝固后，用接种 环从斜面上取菌种，点接在培养基表面，将接种面盖入凹玻片的凹穴内，盖玻片 四周用融化的石蜡封固，于 25-28℃培养 4-5 天。镜检，观察假菌丝的形状。 五、实验内容 分别用两种方法、两种培养基培养，并观察热带假丝酵母的假菌丝。 六、实验作业 1.绘图并记录实验结果。 2.试述假菌丝与真菌丝的区别。实验十三、培养基的配制及灭菌 一、目的要求 1.掌握培养基的配制方法。 2.掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、材料 根据实验需要确定。 三、基本原理 培养基是人工配制的适合于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 其 中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等。并需调整在一定的酸碱度范围之 内。 灭菌是指杀死一定环境中所有微生物。 微生物实验室常用的灭菌方法包括直 接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方 法的基本原理是通过加热使微生物体内的蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目 的。 四、方法和步骤 1.培养基的配制 （1）称药品：取少于总量的水于烧杯中，称取培养基成分（琼脂除外） ，逐 一加入水中。 对于牛肉膏、 酵母膏等原料， 在称量后要连同称量纸一起投入水中， 待原料被洗下后，再将称量纸取出。 （2）加热溶解：将烧杯放在石棉网上，用文火加热，并不断搅拌，待各药 品完全溶解后再补充水分至所需容量。 （3）调节 pH：培养基的酸碱度可用精密 pH 试纸或酸度计等进行测定。调 整可用 10%NaOH 或 10%HCl 溶液进行，调整时应避免调整过头再回调，因为这样 容易影响培养基的体积和渗透压。 （4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基则可用 4 层纱布趁热过 滤。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 （5）分装： A．分装三角瓶：将液体培养基倒入三角瓶中，其装量以不超过三角瓶总容 量的 3/5 为宜，然后每瓶中加入 1.5-2.5%的琼脂（视培养基的要求和琼脂的质 量而定） ，用这种方法可使融化琼脂和灭菌同步进行，以节省融化琼脂的时间。 另一种方法是先称取琼脂于液体培养基中， 待烧杯内的琼脂完全融化后再分装三 角瓶。 B．分装试管：将融化的固体培养基趁热加至漏斗上（装置见图 13-1） 。分 装时左手并排地拿数根试管，右手控制弹簧夹开关，将培养基依次加入各试管。 用于制作斜面培养基时，装量不超过试管高度的 1/5。分装时谨防培养基沾在管口上，以免使棉塞沾上培养基而造成染菌。 （6）加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花制作的棉塞，棉塞的形状、 大小和松紧要合适， 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。加塞时应使棉塞 总长的 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防止棉塞脱落。若三角瓶口较大，而棉花纤 维又短，则可在制好的棉塞外包一层纱布，这样的棉塞既耐用又便于操作。 （7）包扎：在棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养 基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸，然后贴上 标签，注上培养基名称、日期及组别后进行灭菌。 2.灭菌（高压蒸汽灭菌锅的操作过程） （1）使用前先在灭菌锅内加入适量的水，然后把要灭菌的物品放入锅内， 盖上锅盖，对称的拧紧螺栓，以防漏气。 （2）在灭菌锅底部加热，同时打开排气阀，待自排气阀冒热气 3-5min 后关 闭。 至压力表所示压力升至所需压力时开始计时。通过调整热源而维持一定的压 力。达到灭菌时间后停止加热。 （3）待锅内蒸汽全部排完后，方可打开排气阀打开锅盖，取出灭菌物。如 需制成斜面，则最好待试管内培养基降至 50-60℃时再摆。摆得过早会产生过多 的冷凝水（见图 13-2） 。 特别应注意的是，如不待压力降至零点，便打开排气阀或锅盖，轻则会使容 器内的培养基因突然减压而剧烈沸腾，沾污棉塞，重则会造成严重的人身伤亡事 故。 （4）使用完毕后，应及时将锅内的水放出，以防生锈。 高压蒸汽灭菌锅种类和规格很多， 以上操作步骤适用于手提式高压蒸汽灭菌 锅。其他种类的灭菌锅在使用时应严格按操作说明书操作。 附录： 恒温干燥箱灭菌的操作过程： （1）把要灭菌的物品放在箱内，堆积时要留有空隙，勿使接触器壁、铁壳， 关闭箱门。 （2）接通电源，把位于箱顶的通气口适当打开，使箱内湿空气能溢出，至 箱内温度达到 100℃时关闭。 （3）调节温度控制器旋钮，直至箱内温度达到所需要的温度为止。观察温 度是否恒定。若不稳定，再行调节，稳定后不可再拨动调节旋钮和通气孔，保持 140-160℃，2-3h。 （4）灭菌结束后切断电源，待箱内温度降至 60℃时，才能打开箱门，取出 灭菌物品，同时应将温度调节旋钮调到零点，并打开通气孔。实验十四、微生物的纯培养技术 一、目的要求 掌握无菌操作的基本环节及各种分离、接种方法。 二、材料 根据实验需要确定 三、基本原理 分离微生物最常用的有三种方法：平板划线法、涂布平板法和倾注平板法。 在划线过程中随着接种环在琼脂表面往返划动， 微生物细胞从接种环上转移到平 板上， 可使每个细胞在培养基表面形成一个菌落。平板划线法是目前使用最广泛 的一种分离技术。而平板涂布技术和倾注平板法则都是先将样品进行稀释，而后 用固体培养基使合适稀释液中的菌体定位。 在微生物的研究工作中， 为了使微生物不断延续其生命，需一次次的将其接 种到新培养基上。 接种操作决不允许不需要的微生物进入培养基而造成污染。将 污染降到最低限度的接种技术称为无菌操作技术。 它是微生物工作中的一种最重 要而又最基本的操作。 四、方法和步骤 1.接种的操作方法 （1）斜面接种： A．操作前，先用 75%酒精擦手，待酒精挥发后，才能点燃酒精灯。 B． 用斜面接种时， 将菌种管和培养基管握在左手的大拇指和其他四指之间， 使斜面向上，并处于水平位置。 C．先将两支试管的棉塞旋转一下，以便于接种时拔出，并把棉塞握住，不 得任意放在台子上，或与其他物品相接触，再以火焰烧管口。 D．将上述在火焰上灭过菌的接种环伸入菌种管内，接种环先在试管内壁上 或未长菌苔的培养基表面接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种。然后用 接种环在菌苔上轻轻接触，刮出少许培养物，将接种环自菌种管中抽出，抽出时 勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。 E．迅速的将沾有菌种的接种环伸入培养基试管口，在斜面上划线（波浪或 直线） ，使菌体粘附在培养基上。划线时勿用力，否则会划破培养基表面。 F．将接种环抽出，灼烧管口，塞上棉塞。 G．接种环放回原处前，要经火焰灼烧灭菌，同时需将棉塞进一步塞紧，以 免脱落。 以上操作过程参见图 14-1。 （2）液体接种： A．由斜面菌种接入液体培养基：基本操作方法与前相同，但使试管口略高一些， 以免培养基流出。 接入菌体后， 使接种环与管口壁轻轻地研磨使菌体擦下。 接好种后，塞上棉塞。将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。 B．由液体菌种接入培养基平板 菌种为液体时，接种除用接种环外，还可用无菌吸管或滴管。只需在火焰旁 拔去棉塞，将试管口通过火焰灭菌，用无菌吸管吸取菌液 0.1-0.2ml，注入平板 后，用无菌的玻璃棒在平板表面均匀涂布（图 14-2） 。 （3）穿刺接种： 穿刺接种系把菌种用穿刺的方法接种到固体深层培养基中， 此法用于厌氧性 细菌接种，或为鉴定细菌时观察生理性能用。 A．操作方法与上相同，但使用的接种针要挺直。 B．将沾有菌种的接种针自培养基中心刺入，直至接近管底，但勿穿透，然 后按原穿刺线慢慢拔出（图 14-3） 。 2.分离的操作方法 （1）平板划线分离： A．倒制平板：将融化的琼脂培养基冷却到 45℃左右，在酒精灯火焰旁以右 手的无名指与小手指夹持棉塞， 左手打开打开无菌培养皿的盖的一边，右手持三 角瓶向皿里注 10-15ml 培养基。将培养皿稍加旋转摇动后，置于水平位置待凝。 B．划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其冷却后，以无菌操作取一 环待分离的菌液。 划线时，琼脂平板可放在台子上，也可持在手中（图 14-4） 。左手握琼脂平 板，在火焰附近稍抬起皿盖，右手持接种环伸入皿内，在平板上第一区域“之” 字形来回划线。划线时，使接种环与平板表面成 30-40 度角轻轻接触，以腕力使 接种环在琼脂表面作轻快地滑动，勿划破表面。 灼烧接种环，待其冷却后，将手中培养皿旋转 70°角，用接种环在划过线 的第一区域接触一下， 然后在第二区域进行划线，并依次对第三和第四区域进行 划线（图 14-5） 。 划线完毕后，在皿底用记号笔注明样品名称、日期、姓名（或学号） ，将整 个培养皿倒置放入 28-30℃恒温培养箱中培养。 48-72 小时后，观察并记录单菌落的生长和分布情况。 （2）倾注平板法： A．编号：取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管排列于试管架上，依次标上 10-1， 10-2，10-3，10-4，10-5，10-6 字样。 B． 稀释:以 1ml 无菌吸管按无菌操作从样品管中吸取 0.5ml 菌液于 10-1 试管 中，然后用另一吸管在 10-1 试管中来回吹吸三次，使其混合均匀，制成 10-1 稀释 液。 再用此吸管从 10-1 管中吸取 0.5ml 稀释液注入 10-2 管中， 依次制成 10-2， -3， 1010-4，10-5，10-6 稀释液。 C．加样：用 1ml 无菌吸管分别吸取 10-4，10-5，10-6 稀释液 1ml 注入已编好 号的 10-4，10-5，10-6 号无菌培养皿中（图 14-6） 。 D．倾注平板：将融化后冷至 45℃左右（以手持三角瓶，不觉烫手为宜）的 琼脂培养基，向加有稀释液的各培养皿中分别倒入 10-15ml，迅速旋转培养皿， 使培养基与稀释液充分混合，水平放置，待其凝固后，倒置于 28-30℃恒温箱中 培养。 48-72 小时后，观察并记录各平板上菌落生长和分布情况。哪个稀释度最合 适？ （3）涂布平板法： A．平板制备：制备三套无菌平板，并分别写上 10-4，10-5，10-6。 B．稀释：同倾注平板法。 C．加样：用无菌吸管分别吸取 10-4，10-5，10-6 稀释液 0.2ml 对号注入编好 号的琼脂平板中。 D．涂布：用无菌涂棒在各平板表面进行均匀涂布。待涂布的菌液干后，将 培养皿倒置于 28-30℃恒温箱中培养。 E．48-72 小时后，观察并记录菌落生长和分布情况。 五、思考题 1.为什么要把培养皿倒置培养？ 2.接种前和接种后为什么要灼烧接种环？ 3.为什么要待接种环冷却后才能用其与菌种接触?是否可以将接种环放在台 子上待其冷却？你怎样才能知道它是否已经冷却？ 附一、无菌操作环节 （1）接种室应保持清洁，用煤酚皂液擦洗台面和墙壁，定期用乳酸或甲醛 熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。 （2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、 工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用，不准穿到其他地 方去，并要定期更换、消毒。 （3）接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。 移入接种室内的所有物品，均须在缓冲间用 70%酒精擦拭干净。 （4）接种前，双手用 70%酒精或新洁尔灭消毒，操作过程不离开酒精灯火 焰，棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。 （5）培养箱应经常清洁消毒。 附二、接种室的消毒方法1.紫外线灭菌 接种室使用前打开紫外灯照射约 30min，就能使空气和室壁表面基本上无 菌。为了加强灭菌效果，在开灯以前可以在接种室内喷洒石炭酸溶液，使空气中 附有微生物的尘埃降落，并杀死一些微生物。接种室的台面等，可以用 2-3%的 来苏尔擦洗。 紫外线对人体皮肤，尤其对眼睛具有杀伤力，因此不要直视开着的紫外灯， 也不能在开着灯的情况下工作。 2.喷洒石炭酸 将石炭酸水浴，稍热，使之溶解。用吸耳球通过吸管吸取该溶液，配成 5% 溶液。对于小房间，可用喷雾器由上至下、由里到外顺序进行喷雾，关门，稍等 片刻即可使用。石炭酸对皮肤有较强的毒害作用，使用时不要接触皮肤。 3.福尔马林熏蒸 （1）用量：市售福尔马林是 37-40%的甲醛水溶液。常用量按每立方米空间 2-6ml 计算。 （2）熏蒸方法：用福尔马林熏蒸有两种方法： A．加热熏蒸：按熏蒸空间计算，量取甲醛溶液，放在酒精灯上方的小铁桶 或烧杯中，点燃酒精灯，关闭室门。酒精灯最好在甲醛蒸发完后即自行熄灭。 B．氧化熏蒸：在一瓷杯里铺一张报纸，放入高锰酸钾（其用量为 1/2 甲醛 量） ，再取定量的甲醛溶液，倒在盛有高锰酸钾的容器里，立即关门。几秒后， 由高锰酸钾氧化甲醛反应所产生的热将其余的甲醛蒸为气体。 由于甲醛对人眼、 鼻有强烈的刺激作用，熏蒸后相当长时间内不能进入室内 工作。因此，接种室至少在使用前 24h 进行熏蒸，房间应密闭，保持 12h。之后 可取与甲醛等量的氨水，倒在以瓷碗中，放入熏蒸过的接种室内，以减少甲醛对 人的刺激作用。用氨水中和，至少应在工作前 2h 进行。 4.过滤除菌 近几年来， 多采用一种称之为超净工作台的接种室，其原理是借助于一鼓风 机将普通空气鼓入，通过粗滤、超滤纤维过滤后，进入工作台内的空气即为无菌 空气。整个工作室内要求清洁无尘，这样可延长超净工作台的使用寿命。 新的超净工作台使用前，要进行无菌试验，确定合格方可使用。接种前，应 先将工作台开启 5-6 分钟。 附三、接种室无菌程度检查 取无菌的营养琼脂平板，在接种室内台上和台下各放一套。把皿盖打开 15min，然后盖好，倒置 37℃恒温培养 24-28h，如果每个皿内菌落不超过 4 个， 则可以认为无菌程度良好，若菌落很多，则应对接种室进一步灭菌。实验十五、空气中微生物的测定和计数 一、目的要求 1.通过实验了解一定环境空气中微生物的分布情况。 2.学习并掌握检定和计数空气中微生物的基本方法。 二、仪器和材料 盛 50ml 无菌水的三角瓶，蒸馏水瓶，肉汤蛋白胨培养基，查氏培养基，高 择氏培养基，平皿，吸管等。 三、操作步骤 1.滤过法：检查一定体积的空气中所含细菌的数量。 （1）先将仪器按图 15-1 装置。 （2）将下面的瓶装满水。 （3）开放塞子，使水缓缓流出，这时外界的空气被吸入，经喇叭口进入盛 有 50ml 无菌水的三角瓶中，至 4 公升水流完后，则 4 公升体积空气中的微生物 被滤过在 50ml 水中。 （4）自三角瓶中吸取 1ml 水于无菌培养皿中（重复三皿） ，然后加入已融化 而冷却至 45℃的肉汤蛋白胨琼脂培养基、摇匀、凝固后置 28℃培养。 （5）培养 48h 后，按平皿上菌落数计算出每公升空气中细菌的数目。 菌数/公升空气=（1ml 水中培养所得菌数?50）/4 2.沉降法 （1）将肉汤蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高泽氏琼脂培养基融化 后，各倒四个平板。 （2） 将上述三种培养皿各取 2 个， 在室外打开皿盖， 分别暴露于空气中 5min， 10min，另两个培养皿在实验室空气中分别暴露 5min，10min。 （3）置 28℃温箱中培养 48h 后计算其菌落数，观察菌落形态、颜色。 四、结果与计算 1.记录空气中微生物种类和数量 菌落数 环境 室外 室内 5min 10min 5min 10min 细菌 霉菌 放线菌2.计算每公升空气中微生物数目。实验十六、样品中菌落总数的检验 一、目的要求 学习掌握样品中菌落总数（平板菌落计数）的原理和方法。 二、实验材料 1.样品：市售鲜啤酒 2.培养基：营养琼脂培养基 3.设备仪器：10ml 无菌吸管 1 支、1ml 无菌吸管 4 支、无菌带塞空试管 3 支、无菌空培养皿 9 套、酒精灯、试管架、无菌生理盐水、玻璃珠、温箱 36℃ ±1℃、天平等。 三、基本原理 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得 1g 或 1ml 检 样中所含细菌菌落的总数。 菌落总数主要作为制定食品被污染程度的标志， 也可以应用这一方法观察细 菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 每种细菌都有它一定的生物特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理 条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求，才能分别将各种细 菌都培养出来。 但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作细菌菌落总数 的测定。 所得结果， 只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总 数。 四、检验程序 菌落总数的检验程序如下 检样→做成几个适当倍数的稀释度→选择 2-3 个稀释度各以 1ml 的量加入灭 菌平皿内→每皿内加入适量营养琼脂培养基→计数菌落（36℃±1℃，24±2h） →报告 五、操作步骤 1.检样稀释及培养 （1）以无菌操作，将检样 25g（或 25ml）剪碎放于含有 225ml 灭菌生理盐 水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内放置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内， 经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后， 最好置灭菌均质器中以 r/min 的速度 处理 1min，做成 1：10 的均匀稀释液。 （2）用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭 菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液） ，振摇 试管混合均匀，做成 1：100 的稀释液。 （3）另取 1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序，作 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择 2-3 个适宜稀 释度，分别在作 10 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移 1ml 稀释液 于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 （5） 稀释液移入平皿后， 应及时将凉至 46℃营养琼脂培养基 （可放置于 46℃ ±1℃的水浴中保温）注入平皿约 20-25ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营 养琼脂培养基倾入加有 1ml 稀释液（不含样品）的灭菌皿内作空白对照。 （6）待琼脂凝固后，翻转平板，置 36℃±1℃恒温箱内培养 24±2h（肉、 水产、乳和蛋品为 48±2h）取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得 每克（或毫升）样品所含菌落总数。 2.菌落计数方法 作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记 下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。 3.菌落计数的报告 （1）平板菌落数的选择 选取菌落数在 30-300 之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用 两个平板，应采用两个平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采 用， 而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板 的一半， 而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2 以代表全 皿菌落数。 （2）稀释度的选择 A．应选择平均菌落数在 30-300 之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表 例 1）稀释度选择及菌落数报告方式例 稀释液及菌落数 次 10-1 1 2 3 4 5 6 7 多不可计 多不可计 多不可计 多不可计 27 0 多不可计 10-2 164 295 271
305 10-3 20 46 60 313 5 0 12两稀释 液之比 ―― 1.6 2.2 ―― ―― ―― ――菌落总数 个/g(ml)
270 &1?10 30500报告方式 个/g(ml) 16000 或 1.6?104 38000 或 3.8?104 27000 或 2.7?104 310000 或 3.1?105 270 或 2.7?102 &10 31000 或 3.1?104B．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30-300 之间，则视二者之比如何 来决定， 若其比值小于 2， 应报告其平均数； 若大于 2 则报告其中较小的数字 （见表例 2 及例 3） 。 C．若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落 数乘以稀释倍数报告之（见表例 4） 。 D．若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之（见表例 5） 。 E．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告之（见 表例 6） 。 F．若所有稀释度的平均菌落数均不在 30-300 之间，其中一部分大于 300 或小于 30 时， 则以最接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例 7） 。 （3）菌落数的报告 菌落数在 100 以内时，按其实有数报告；大于 100 时，采用二位有效数字， 在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数， 也可用 10 的指数来表示（见表“报告方式”栏） 。实验十七、样品中大肠菌群的检验 一、目的要求 学习大肠菌群菌数的检测原理和方法。 二、实验材料 1.仪器：恒温箱 36℃±1℃、天平、显微镜、平皿、水浴 44℃±0.5℃、试 管、吸管、载玻片。 2.培养基及试剂：乳糖胆盐发酵管（单料及双料） 、伊红美兰琼脂培养基 （EMB） 、乳糖发酵管、革兰氏染色液、芽孢染色液。 三、基本原理 大肠菌群系指一群在 37℃，24 小时能发酵乳糖、产气需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评 价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 食品中大肠菌群数系以每 100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。 四、检验程序 大肠菌群检验程序如图 17-1： 五、操作步骤 1.检样稀释 （1）以无菌操作，将检样 25g（或 25ml）剪碎放于含有 225ml 灭菌生理盐 水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内放置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内， 经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置 灭菌均质器中以 r/min 的速度处理 1min，做成 1：10 的均匀稀释液。 （2）用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭 菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，做成 1：100 的稀释液。 （3）另取 1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序，作 10 倍递增稀释液，如此每递 增稀释一次，即换用一支 1ml 灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度， 每个稀释度接种三管。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在 1ml 以上者，用双料乳糖胆 盐发酵管；1ml 及以下者，用单料乳糖发酵管。每一稀释度接种三管，置 36℃± 1℃温箱内，培养 24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌 群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 3.分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置 36℃±1℃温箱内，培 养 18-24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和芽孢染色以及证实试 验。4.证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1-2 个，进行革兰氏染色，同时接种 乳糖发酵管，置 36℃±1℃温箱内培养 24±2h。观察产气情况。凡乳糖发酵管产 气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 5.报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN 检索表，报告每 100ml（g）大肠 菌群的最可能数。 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 1ml（g）?3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.1 ml（g）?3 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.01 ml（g）?3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 30 60 90 30 60 90 120 30 60 90 120 30 60 90 120 60 90 120 160 90 120 160 190 &30 MPN 100ml（g）1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 30 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 00 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 240 70 110 150 70 110 150 190 110 150 200 240 160 200 240 290 90 140 200 260 150 200 270 340 210 280 350 420 290 360 440 530 230 390 6403 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 33 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3950 430 750 0 00 00 &24000注：①本表采用三个稀释度[1ml(g)、0.1ml（g）和 0.01ml（g）]每稀释度三管。 ②表内所列检样量如改用 10ml（g） ，1ml（g） ，0.1ml（g）时，表内数字应相应降低 10 倍；如改用 0.1ml（g） ，0.01ml（g） ，0.001ml（g）时，则表内数字应相应增加 10 倍，其 余可类推。 ③10ml 以上用双倍乳糖胆盐发酵管，50ml 以上用三倍乳糖胆盐发酵管。 ④可疑菌落 a：紫红色具有金属光泽的菌落。 b：深红色，不带或略带金属光泽的菌落。 c：淡红色，中心色较深的菌落。实验十八、酵母菌对糖类的发酵和对氮源的利用 一、目的要求学习测定酵母菌对糖类的发酵和对氮源的利用的方法 二、实验材料 1 菌种：啤酒酵母 2：培养基豆芽汁或无氮基础培养基，无氮基础培养基，葡萄糖，半乳糖，麦芽 糖，蔗糖，乳糖，棉子糖，硫酸铵，硝酸钾，尿素等。 三、基本原理 酵母菌对各种糖类的发酵能力差别很大，这是酵母菌分类鉴定的重要依据， 也是酿造工业中鉴别培养酵母和野生酵母的一种方法。 由于酵母菌发酵糖类能产 生乙醇和 CO2，因此可以在加糖的培养基中培养酵母菌，通过观察有无气体生产 来判断酵母菌能否发酵该糖。不同的酵母菌，由于其体内的酶系不同，对不同氮 源物质的利用能力也不同。 了解酵母菌对氮源物质的要求，不但有助于对酵母菌 进行分类鉴定， 而且对发酵培养基的设计也可提供依据。在无氮的基础培养基中 添加一种氮源物质作唯一氮源， 并接种酵母菌进行培养。根据酵母菌能否生长及 生长的程度如何可以判断酵母菌对该氮源物质能否利用及利用能力如何。 四、方法和步骤 1.酵母菌对糖类的发酵 （1） 取杜氏发酵管 7 支。每支加豆芽汁或无碳基础培养基 5ML 加被测糖 2％棉 子糖 4％，对照管不加糖，分别标明糖类的名称，加塞，在 6，8610 的压 力下，灭菌 20 分钟。 （2） 接种各管，置于 25 度下培养 5～7 天。 （3） 观察结果。若有气泡形成，说明能发酵该糖;反之，说明不能发酵该糖。 记录实验结果。 2.酵母菌对氮源的利用 （1） 取试管 5 支，每支加固体无氮基础培养基 5 毫升，加被测氮源 0。5％分 别标明添加的氮源的名称，对照管不加氮源，加塞。在 6.86 的压力下灭 菌 20 分钟后摆成斜面。 （2） 接种各管。接种时不要将原培养基带入，以免影响结果。必要时可将菌体 进行离心洗涤，制成菌悬液后再接入。 （3） 将上述各管置于 25 度恒温培养 5~7 天。 （4） 观察结果。 生长状况与对照管一样的， 说明酵母菌不能利用该种氮源物质。 五、实验内容 1.测定啤酒酵母对葡萄糖，半乳糖，蔗糖，麦芽糖蜜二糖，棉子糖的发酵情况。 2.测定啤酒酵母对硫酸铵，硝酸钾，尿素的利用情况。 六、实验作业记录实验结果，你实验所得结果能否与理论上的解释统一起来。实验十九、厌氧微生物的培养 一、目的要求 学习几种厌氧微生物的培养方法。 二、实验材料 菌种：丁酸菌丙酮丁醇梭菌巴氏芽孢梭菌巴氏固氮梭状芽孢杆菌 培养基：丁酸菌培养基 TYA 培养基焦性没食子酸即邻苯三酚 10％NAOH 溶液，0， 5%美兰，6％葡萄糖水溶液，钯粒 A 型。 带塞或塑料帽玻璃管（直径 18～20mm,长 180～200mm） ，100ml 和 250ml 血浆瓶，20ml 和 50ml 针筒，250 三角瓶，试管，厌氧罐，培养皿，真空泵，带 活塞干燥器，氮气钢瓶。 三、操作步骤 （一）真空干燥器厌氧培养法 此法不适用于培养需要 CO2 的微生物。该法是在干燥器内使焦性没食子酸与 氢氧化钠溶液发生反应而吸氧，形成无氧的小环境而使厌氧菌生长。 1. 培养基准备与接种 将装有液体培养基的大试管放在水浴中煮沸 10min, 以赶出其中溶解的氧气，迅速冷却后（切勿摇动）接种， （同时做好好氧 菌对照实验） 。 2. 干燥器准备与抽气 在带活塞的干燥器内底部，预先放入焦性没食子酸 粉末 20g 和斜放盛有 200ml10％NAOH 溶液的烧杯。将接有厌氧菌的培养 基和对照管放入干燥器内。在干燥器口上涂抹凡士林，密封后接通真空 泵，抽气 3～5 分钟，关闭活塞，轻轻摇动干燥器促使烧杯中的 NAOH 溶 液倒入焦性没食子酸中，两种物质混合发生吸氧反应，使干燥器中形成 无氧小环境。 3. 观察结果 将干燥器置于 37 度恒温箱中培养约 7 天，取出培养管，分别 制片观察菌体特征。 （二）深层穿刺厌氧培养法 此法操作简单， 适用于一般厌氧微生物的活化和分离培养，但不能用于扩大 培养。 1. 接种培养 将玻璃管一头塞上橡胶管，装入培养基的高度为管长的 2/3， 套上塑料猫或橡皮赛，灭菌并凝固后将实验菌恋情接种针穿刺接种，置 37 恒温箱中培养 6～7 天。 2. 观察结果 观察菌落形态特征并制片于显微镜下观察菌体的细胞形态， 并记录结果。 （三）针筒厌氧培养法 此法适用于活化厌氧菌和小体积的扩大培养。1. 培养基准备 将灭菌的装有培养基的血浆瓶放在沸水浴中加热 10min，在瓶口 胶塞上插上 2 枚医用针头排气，以赶出残留在培养基中的氧气，随后将血浆 瓶从沸水浴中取出， 在用氮气瓶中的 高纯氮气通过胶塞上的一枚针头引入血 浆瓶中，使血浆瓶中充满氮气，平内培养基在令却过程中保持无氮状态。 2. 针筒装灌培养基 将灭菌的 针筒接上胶塞刺入血浆瓶中，先用平内氮气的压 力将针筒的推杆慢慢推开， 待吸入一定的氮气后取下针筒，排尽针筒内气体， 按此重复操作 3 次， 以排尽针筒内的 残留空气而维持无氧状态。使血浆瓶口 朝下倾斜，利用瓶内压力将培养基缓慢灌入针筒瓶内然后取下针筒，用灭菌 的带孔橡皮塞迅速把针筒头部塞住。 。 3. 接种培养，采用无菌操作以菌种液针筒将菌穿刺接入培养液针筒中，置 37 恒温度恒温培养。 用于菌种活化可培养 16～18h， 用于菌体生长可培养 6～7h。 4. 观察结果 取菌制片观察 （四）厌氧罐培养法 此法利用透明的硬质塑料制成的一种小型罐状密封容器， 采用抽气换气法冲 入氢气， 利用钯作催化剂于罐内氧气发生作用以达到去除氧气的目的，同时充入 10％（v/v）的 CO2 以促进幕些革兰氏阴性厌厌氧菌的生长。 其操作过程如下： 1. 制 备 厌 氧 度 指 示 剂 取 30ml0.5% 美 兰 溶 液 用 蒸 馏 水 稀 释 至 mol/LnaOH 溶液用蒸馏水稀释至 100ml，6g 葡萄糖加蒸馏水至 100ml。将上述 3 种溶液等体积混合，并用针筒注入 1ml 安管内，沸水浴加 热至无色，立即封口制成，取一根直径 1cm 长 8cm 的 无毒透明塑料软管，将 装有美兰指示剂的安瓶置于软管中，制成美兰厌氧度指示管。 2. 培养基准备与接种 将制成无菌无氧的 培养基平板，在无菌操作中迅速划线 接种，并立即将平皿倒置放入已准备好的厌氧罐中，同时放入已准备好的厌 氧罐中，同时放入一支美兰厌氧指示剂管。 3. 抽气换气 将真空泵接通厌氧罐抽气接口（图 14-4） ，抽真空至表指针 0.09~0.093Mpa 时，关闭抽气口活塞，用止血钳夹住抽气橡皮管。打开氮气 钢瓶气阀向厌氧罐内充入氮气，当真空表指针返回到零位终止充氮。再按上 述步骤抽气和充入氮气，如此重复 2～3 次，使罐中氧的含量达最度。最后 充入的氮气使真空表指针达 0.02mpa 时停止充氮气。再开启 CO2，钢瓶阀门， 向罐内充入 CO2 直至真空表指针达到 0.011mpa 时停止。 为除尽罐内残留的氧， 以氢气袋气管连接向厌氧罐内充入氢气直至真空表指针回到零位为止。充气 完毕，封闭厌氧罐。 4．恒温培养 将厌氧罐置于 37 恒温箱中培养 6d，注意罐中厌氧指示剂的颜色变 化。5.观察结果和镜检 从罐内取出平皿，观察菌落特征。并挑取菌落作涂片，用结 晶紫染液染色，镜检，比较不同菌的菌体细胞形态特征，并作记录。 四、作业 菌种 名称 菌落形态特征 菌体形态特征 菌落大小、形状颜色、 菌体形态、有无芽孢、 光滑度、透明度、气味 芽孢形状、革兰氏染色 液体培 养特征五、思考题 请设计一个实验方案，如何从土壤中分离，纯化和培养出厌氧菌。实验二十、微生物的生理生化特性试验 一、目的： 掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应及其原理 二、材料： 1. 菌种：大肠杆菌 ；枯草杆菌 ；变形杆菌；产气杆菌。 2. 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基；柠檬酸盐培养基；硫化氢试验用培养 基；蛋白胨水培养基；淀粉培养基；明胶培养基；硝酸盐培养基。 3. 试剂：吲哚试剂；格里斯氏试剂 A,B；碘液；二苯胺试剂。 三、基本原理： 由于各种微生物的新陈代谢类型不同， 因此对各种物质利用后所产生的代谢 产物也不同， 我们可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这种反应称之为生 理生化反应。 生理生化反应常用来鉴别再形态或其他方面不易区分的微生物，例 如肠道细菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上不易区分，但前者能发酵乳 糖，后者不能。因此可以从他们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生理生 化反应是微生物分类鉴定的重要依据之一。 四、方法和步骤： 1. 淀粉水解试验 莫些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外 酶） ，使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后， 遇碘不再变蓝色。其步骤如下： （1） 淀粉培养基在水浴中融化后，冷至 50，以无菌操作制成平板。用接种环 取少量枯草杆菌在平板的一边“＋”字形接种，另取少量试验菌在平板的 另一边接种。置 37 温箱中培养 16～20 小时。 （2） 观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘 液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。 透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。 2. 产硫化氢试验： 某些菌能发酵含硫的有机物或无机物产生的硫化氢，H2s 遇重金属盐类，如 铅盐。铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物。从而可以断定的产生与 否。其测定方法有两种，一种是用柠檬酸铁胺的培养基穿刺培养，看是否有黑色 沉淀； 一种是在盛有液体培养基的试管中接种菌以后，在试管的棉塞下吊一片醋 酸铅溶液，经培养后看醋酸铅试纸是否变黑。 （醋酸铅试纸的制法：将普通滤纸 在 1％醋酸铅溶液中，取出晾干，加压灭菌后，105 烘干备用） 。其步骤如下： （1） 取 H2S 试验用培养二支（内含有柠檬酸铁铵） ，分别用穿刺法接种大 肠杆菌和变形杆菌，试管上注明菌名，置 37 培养 24 小时。 （2） 培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生。附：穿刺接种法：将已挑有菌的接种针（针必须很挺直）,自培养基的中心 垂直地刺入培养基中，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上棉塞，将接种针上残留的 菌在火焰上烧掉。穿刺接种法见图 20-2。 3.吲哚试验 某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚（靛基质） ，吲 哚与对二甲基氨基苯甲醛作用后可产生红色的玫瑰吲哚。其反应式如下： 其步骤如下： （1） 取蛋白胨水培养基试管两支，分别接种大肠杆菌、产气杆菌，并在上注明 菌名，置 37 培养 48 小时。 （2） 在培养中先加入乙醚约 1 毫升（使呈明显的乙醚层） ，充分振荡，使吲哚 溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养的上面，这时再沿管壁慢慢加 入吲哚试剂 5～10 滴， 观察有无红色出现。 注意， 加入试剂后不可再摇动， 否则被混合，红色不明显。 4、甲基红试验 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产生大量