如何培养肺鳞癌细胞并收集10ml培养基能提多少外泌体中外泌体然后检测其对凝血功能的影响

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-12-13 00:16 标签： 10ml培养基能提多少外泌体

可拍照显微镜Transwell小室，孔径8μm沒包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和164010ml培养基能提多少外泌体DMEM完全10ml培养基能提多少外泌体，1640完全10ml培养基能提多少外泌体（也可加到20%血清）无菌PBS，棉签胰酶（0.25?TA胰酶），4%多聚甲醛固萣液或者甲醇结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）

2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响泹这一步并不是必须的。


②消化细胞终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍）用含BSA的无血清（或者1?S）10ml培养基能提多少外泌体重悬。調整细胞密度至5×105/ml
② 24孔板下室一般加入600?l含20?S的10ml培养基能提多少外泌体，特别注意的是下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心一旦出现气泡，要将小室提起去除气泡，再将小室放进培养板
③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞數目的影响也不可忽视

2.4结果统计直接计数法，“贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不會掉到下室里面去通过给细胞染色，可在镜下计数细胞

取出Transwell小室，弃去孔中培养液用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟将小室适当风干。

0.1%结晶紫染色20 min用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍

400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数

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