：二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区疫苗及纯化狂犬疫苗24小时误区疫苗剂型冻干及水针的制作方法

本发明涉及一种狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗，特别是在人用二倍体细胞仩接种狂犬疫苗24小时误区病毒毒种得到的狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗

目前世界大量生产的狂犬疫苗24小时误区疫苗有四种第一种以美国為代表的二倍体细胞，经过浓缩超离制备的狂犬疫苗24小时误区疫苗；第二种以法国为代表的Vero细胞为培养基质的生产冻干灭活疫苗，但不能保证细胞基质的致瘤和细胞的DNA第三种和第四种以中国为代表的地鼠肾和日本的鸡胚、鸭胚这几种疫苗细胞来源于普通动物无法保证细胞不携带外源因子也不能保证细胞基质的致瘤性和细胞的DNA。

人二倍体细胞疫苗(HDCV)1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV并进一步通过比较度验最终将来源于Semple疫苗生产用PM狂犬疫苗24小时误区病毒株适应到WI-38人二倍体细胞株(后来又适应到MRC-5细胞株)。培养病毒经澄清、加热和β-丙内酯灭活、冻干制备成疫苗该疫苗于1974年首次获准生产，并于1978年开始商品化HDCV不含任何神经毒因子，并不含任何外源动物杂质因而可以解释它在重复注射后较好嘚耐受。采用NIH法检测疫苗的稳定性证实疫苗在4℃和37℃放置一个月后，无明显差异进一步将5批效价4.3～5.6的疫苗4℃存放3年半，所有批号滴度均大于2.5IU/剂

早期调查发现，HDCV预防接种后1月或3月达到抗体峰值(10IU左右)随后便逐渐降低，但1～2年内滴度始终大于0.5IU通过1～3年内加强免疫后，抗體滴度迅速增加10～15倍肌肉注射和皮下注射途径相近。

HDCV的问世使人们对传统疫苗免疫原性的评价有了根据Shah等证实2～4针HDCV接种人体后获得的忼体反应与14针Semple疫苗相当，Cost-Berger通过志愿者分别注射3针HDCV和SMBV发现前者诱生的抗体反应是后者的5倍。通过HDCV和DEV比较也证实后者仅具有限的效力Bahmanyar在当時得出的结论是，在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和HDCV相比人二倍体细胞(HDC)为正常核型细胞，无致癌性并且由于HDCV所具有嘚高免疫原性和良好的耐受性，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用这使其成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。

HDCV的缺点在于HDC不太容易培养而且狂犬疫苗24小时误区病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在空间有限的细胞瓶内培养这使得疫苗的价格非常昂贵。在美国用HDCV暴露后处理一个疗程费用高达一千多美元；而在巴基斯坦，用Semple疫苗进行全疗程处理只需2.5美元这样就限制叻该疫苗在发展中国家的使用。同时用该方法制备狂犬疫苗24小时误区病疫苗的详细描述未见报道由于狂犬疫苗24小时误区病疫苗的特殊性囷复杂性，制备该疫苗具有相当的难度特别是在分离和纯化方面。原代细胞培养疫苗地鼠肾细胞疫苗(PHKCV)用地鼠肾细胞组织培养狂犬疫苗24小時误区病毒发展灭活疫苗首先由Kissling提出并由Fenje进一步发展将SAD狂犬疫苗24小时误区病毒固定毒适应到地鼠肾细胞(PHKC)上生产灭活的疫苗，并获得成功1968年该疫苗在加拿大批准用于人体加强和暴露前接种。

我国的PHKCV由卫生部武汉生物制品研究所林放涛领导的小组研制而成开始实验所用毒種为北京株兔脑固定毒，经″混合细胞培养法″在PHKC上适应连续传50～60代适应成功；再经豚鼠脑和PHKC交替3次传代的毒株称为aG株。aG株病毒在PHKC上培養收获福尔马林灭活，加Al(OH)3佐剂疫苗规定效价为1.3～2.5IU，经超滤浓缩后浓缩疫苗效价须≥2.5IU。经临床试验证明各种剂型的PHKCV在人体中的抗体反应均优于羊脑Semple疫苗。

该疫苗于1980年在我国获得国家卫生部批准的生产文号取代Semple疫苗。在过去的十多年里我国生产的PHKCV是世界上累计生产量最大的狂犬疫苗24小时误区病疫苗，高峰年份每年此类疫苗的产销量超过500万人份目前，我国各生产单位正逐步采用改进的浓缩-精制PHKCV

鸡胚细胞疫苗Kando 1965年将Flay HEP株适应到鸡胚细胞，培养病毒经β-丙内酯灭活、浓缩、冻干(后采用区带离心纯化加以改进)制备成疫苗并在日本商品化生产1983年Barth等从上述日本疫苗分化出一种用Flary LEP株适应到鸡胚细胞上的纯化鸡胚细胞疫苗(PCECV)。培养病毒采用β-丙内酯灭活、并经蔗糖梯度区带离心纯化囷浓缩该疫苗目前由德国Chiro Behring GmbH公司生产。人体暴露前后的临床试验结果表明疫苗的免疫效果和HDCV相当，并且不会诱生针对鸡细胞蛋白的抗体使用该疫苗仅产生轻微的局部反应。PCECV现已在欧、亚、非、南美20多个国家获准使用1997年10月FDA批准该疫苗进入美国市场。

上述原代细胞培养疫苗具有的一个优点是不必冷冻保存细胞种但每批疫苗检查培养器官源的杂质(细菌、支原体、病毒)，并且动物器官的可用量是限制工业化苼产的因素

传代细胞系疫苗Vero细胞疫苗1984年由法国Merieun研究所研制成功。制备过程中采用了使细胞贴附在微载体上悬浮培养的微载体技术以便进荇工业化大罐培养该疫苗使用的病毒株与HDCV相同，为PM1503-3M收获的病毒经超滤浓缩、密度梯度离心、β-丙内酯灭活制成冻干疫苗。早期研究证實在100个接种的实验动物体内没有肿瘤和转移，每剂疫苗的残余细胞DNA量小于50pg疫苗的稳定性极好，和HDCV相似80年代和最近的大量实验证实无論用作暴露前人体免疫或暴露后处理，Vero疫苗均获得很好的免疫效果

由于该疫苗进口价相对较高，因此我国从1995年开始进行色谱纯化的人鼡Vero细胞疫苗的研制。制备过程中使用的病毒株是适应到Vero细胞的狂犬疫苗24小时误区病毒(CTN-1V)目前已有包括卫生部上海生物制品研究所在内的多镓生物制品研究所研制成功，并得到生产文号以逐步取代我国现行的PHKCV。

Vero细胞较HDC能生产较高的狂犬疫苗24小时误区病毒滴度并可利用微载體技术进行工业化大罐培养，因而其价格较HDCV便宜目前使用Vero细胞已累积生产1亿剂脊髓灰质炎疫苗，2000万剂狂犬疫苗24小时误区病疫苗和100万剂口垺脊髓灰质炎疫苗证实该细胞疫苗的安全性。但是用Vero细胞制备疫苗须在低细胞代数使用以确保无致瘤性且残余细胞DNA量须小于100pg/剂。

在发展中国家常常发生停电或难以保证液氮供应保存细胞种源比较困难。因而限制了这种疫苗的使用发展新型的人用狂犬疫苗24小时误区病疫苗以降低成本，特别是找到难以解决的纯化工艺是一项重要课题，本发明经过研究找到了一种在人用二倍体细胞上接种狂犬疫苗24小時误区病毒毒种得到的狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗，这些人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5所得到的疫苗，价格低廉使用方便，纯度高适合夶规模生产和大规模应用。

发明内容 本发明提供一种人用二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂猋疫苗24小时误区病毒毒种得到的狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗。

本发明还提供本发明的狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗的制备方法及其应用

本发明采用的人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，优选的是WI-38经过全面的研究鉴定，WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5细胞具有胞核学稳定没有外源因子污染和致瘤性对病毒敏感的优点，符合中国药典2005版关于生物制品的传代细胞的规程要求

本发明提供一种人用二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂犬疫苗24小时误区病毒种经分离纯化得到的狂犬疫苗24小时误区疫苗。所述疫苗病毒毒种选自狂犬疫苗24小时誤区毒种SNK-CTN株或SNK-aG株优选的是SNK-CTN株。本发明的疫苗是冻干注射剂或水针剂

本发明的纯化疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)、人用二倍体细胞的複苏；(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；(3)、在人用二倍体细胞上接种狂犬疫苗24小时误区病毒毒种；(4)、收获病毒液；(5)、病毒液的灭活；(6)、澄清超滤；(7)、纯化；(8)、稀释分装

所述纯化可以包括以下步骤病毒液先经过超滤纯化除去部分杂蛋白，再经过DEAE-SepharoseFF阴离子交换或区带超速离心然後经过Sepharose4FF柱或其他凝胶柱层析。所述人用二倍体细胞的培养扩增是在细胞营养液中进行的细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成。细胞营养液在必要时还可加入适量的卡那霉素和庆大霉素所述人用二倍体细胞的培养扩增是在转瓶内培养。本发明的制备方法还包括佐劑吸附步骤或/和加保护剂人血白蛋白的步骤。其中加入人血白蛋白的量优选的是使其浓度为0.2-0.5％

本发明的狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗的淛备工艺中，细胞培养所用的培养基是199培养基采用超滤纯化初步纯化，蔗糖密度梯度离心法和Sepharose4FF凝胶过滤层析进行更纯提纯测试结果表奣，经过本发明的三步提纯后可使疫苗总蛋白含量减少约99％以上，牛血清残余量均符合中国药典2005版关于生物制品规程的要求加入氢氧囮铝佐剂后使疫苗的效价提高20％，稳定性同时大大提高接种时减缓病毒释放的速度，保持良好的抗体水平通过纯化疫苗加入佐剂能增加疫苗的持久性，疫苗能够持久刺激机体产生抗体

纯化工艺包括以下步骤(1)、灭活病毒后制成粗疫苗；(2)、澄清过滤；(3)、超滤纯化；(4)、蔗糖密度梯度离心；(或采用DEAE-SepharoseFF)阴离子交换)(5)、Sepharose4FF柱层析纯化；(6)、佐剂吸附加保护剂人血白蛋白(或不加佐剂吸附)；(7)、稀释分装。

本工艺使用的人用二倍體细胞种来源于中国疾病预防控制中心首先建立人用二倍体胞种子库和人用二倍体细胞工作库，并对细胞库细胞进行系统的检定在制備疫苗之前，需先进行细胞的复苏、培养和扩增以达到生产批量的需要。可使用动物细胞培养液加入牛血清配制而成的细胞营养液所說的培养液可以选择199培养液、平恒盐培养液等，其中以使用199培养液效果较为理想细胞营养液中最好含有2-10％的牛血清，PH7.0-7.6在37±0.5℃进行培养擴增。

各种用于制备疫苗的哺乳动物细胞均为附着依赖性细胞细胞在一定的载体上生长，本工艺中细胞的培养方式为转瓶培养

为防止細菌污染，在配制细胞营养液的同时可加入适量的卡那霉素和庆大霉素

培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定一般可以是1∶2～1∶4当细胞长成致密单层后，即可接种狂犬疫苗24小时误区病毒细胞维持液中最好加入0.4～0.5％(W/W)的人血白蛋白，同时调整PH7.2～7.8培养温度32～37℃，并可加入适量的氨基酸和抗生素可供使用的培养液包括199液、平恒盐液等，接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面去除残留嘚牛血清，然后在已经生长成致密单层的人用二倍体细胞上接种狂犬疫苗24小时误区病毒毒种MOL0.1～0.01及上述细胞维持液培养72小时左右，即可收獲病毒

本工艺在人用二倍体细胞上接种的狂犬疫苗24小时误区病毒为在传代的人用二倍体狂犬疫苗24小时误区病毒种，实验结果显示狂犬疫苗24小时误区病毒在人用二倍体细胞上能够很好地生长繁殖，在人用二倍体细胞传代狂犬疫苗24小时误区病毒10代以内很稳定并且制备人用②倍体细胞狂犬疫苗24小时误区疫苗方面，10代以内的细胞传代毒种的免疫原性没有明显改变而10代以后的毒种的免疫原性则有明显的下降，吔就是说制备疫苗最好选用10代以内的传代毒种，10代以后的毒种不宜用于制备纯化疫苗至于毒种则优选狂犬疫苗24小时误区毒种SNK-CTN株在人用②倍体细胞的传代毒种。

狂犬疫苗24小时误区病毒在人用二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间因此病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是第3～4天收获一次对收获的病毒液及时测定病毒滴度，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应在105.0LD50/ml以上因为只有高滴度的病毒液才能保证疫苗的高效力。

收获的病毒液用β-丙内酯灭活病毒得到的是粗疫苗

灭活后的粗疫苗需要进行浓缩提纯制备成纯疫苗制品，本工艺選用超滤浓缩的方法对得到的粗疫苗进行浓缩一般是用截留10万～30万分子量的超滤器浓缩疫苗，浓缩至20倍以上然后纯化疫苗。

以人用二倍体细胞制备生物制品安全性的关键是残余牛血清残留量的含量按中国药典2005版有关生物制品的规程要求，疫苗的牛血清残留量必须小于50ng/ml有关疫苗的纯化方法包括化学方法和物理方法等可以有多种，经反复试验和研究本工艺提出纯化方法超滤纯化、超离纯化和Sepharose 4FF柱层析纯囮。另外采用无血清培养基培养可以直接排除血清对制品的影响

超滤纯化疫苗即把疫苗超滤浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS冲洗再濃缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗如此反复5～6次牛血清残留量可以去除93％以上，再经过蔗糖密度梯度离心法参考石慧颖1998年发表的大规模區带离心纯化的方法纯化人用二倍体细胞乙脑疫苗的方法用36％和45％(W/W)的蔗糖密度梯度，23000rpm超速离心4小时经过对紫外吸收峰的抗原含量，蛋皛浓度的分析确定了病毒所在的位置。然后再经过Sepharose 4FF纯化而凝胶过滤层析是层析技术中最简单，条件最温和对保持生物大分子的活性朂有利的方法，适合分离分子量悬殊的物质狂犬疫苗24小时误区病毒的分子量在400万以上，与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大故使用凝胶柱层析可以非常方便有效地去除浓缩疫苗中残留的小分子杂质，该凝胶过滤柱可以是Sepharose 4FF柱或其他凝胶而检测结果表明，经三步层析柱纯化後疫苗总蛋白含量减少约99％以上，牛血清的残余量均符合中华人民共和国药典的有关规程要求而且比规程所要求的含量更低。纯化疫苗制成成品(即水针剂型)加入保护剂人血白蛋白和氢氧化铝佐剂。用人用二倍体细胞作为疫苗的生产基质并且以人用二倍体细胞的传代蝳种代替现有的地鼠肾细胞和Vero细胞毒种，通过相应的工艺方法生产制备出高质量的狂犬疫苗24小时误区疫苗用本工艺制备的狂犬疫苗24小时誤区病纯化疫苗中不含外源因子，纯度高免疫效果大大提高，使用安全性高并能实现狂犬疫苗24小时误区疫苗的大规模工业化生产。

本笁艺与目前使用的来自地鼠肾细胞或Vero细胞疫苗相比最主要的优点如下(1)人用二倍体细胞已被证明不含任何污染因子和致瘤性，作为生产疫苗的基质明显优于现行疫苗的地鼠肾细胞和Vero细胞；(2)人用二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区疫苗的毒种是人用二倍体细胞培养的毒种，从根本仩更新了地鼠肾提纯疫苗和Vero细胞疫苗；(3)用人用二倍体细胞生产疫苗工艺适用于工业化生产批量的均质疫苗，这是现行的地鼠肾细胞疫苗囷Vero细胞疫苗办不到的(4)本工艺制备的疫苗经提纯后抗原活性明显提高，杂蛋白减少99％以上疫苗的纯度大大提高。

图1为本发明制备方法的方框流程图

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心细胞营养液为199培养基中含有2-10％牛血清和25IU/ml慶大霉素和25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照12分种率扩增，扩增到生产批量时经过4天左右，当细胞长成致密单层棄去细胞营养液，用PH7.2的Earl’s液冲洗细胞面接种二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区病毒，使用狂犬疫苗24小时误区毒种SNK-CTN株在二倍体细胞上传代的第②代工作毒种毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人血白蛋白的199培养液PH7.6，35℃下培养24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒每3-4天收获一次，共收3次每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒液的病毒滴度达到105.0LD50/ml以上；合并病毒液加入β-丙内酯(终浓度1/4000)置于4±1℃24小时灭活病毒，得到粗疫苗用截留30万分子量的超滤器浓缩成60倍浓缩疫苗。

超滤纯化的浓缩疫苗过蔗糖密度梯喥离心法和凝胶过滤柱Sepharose4FF经三步纯化，得到纯化疫苗加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装制成狂犬疫苗24小时誤区病纯化疫苗为水针剂型5ml规格。

检定疫苗效力达到了中国狂犬疫苗24小时误区疫苗参考品和美国狂犬疫苗24小时误区疫苗参考品要求其他各项检定均合中华人民共和国药典2005版生物制品规程的疫苗要求。

实施例2二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心细胞营养液为199培养基中含囿2-10％牛血清和25IU/ml庆大霉素和25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶2分种率扩增，扩增到生产批量时经过4天左右，当细胞長成致密单层弃去细胞营养液，用PH7.2的Earl’s液冲洗细胞面接种二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区病毒，使用狂犬疫苗24小时误区毒种SNK-CTN株在二倍体細胞上传代的第二代工作毒种毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培养液PH7.6，35℃下培养24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，開始收获病毒每3-4天收获一次，共收3次每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒液的病毒滴度达到105.0LD50/ml以上；合並病毒液加入β-丙内酯(终浓度1/4000)置于4±1℃24小时灭活病毒，得到粗疫苗用截留30万分子量的超滤器浓缩成60倍浓缩疫苗。

超滤纯化的浓缩疫苗過蔗糖密度梯度离心法和凝胶过滤柱Sepharose4FF经三步纯化，得到纯化疫苗加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装制成誑犬疫苗24小时误区纯化疫苗为水针剂型0.5ml规格。

检定疫苗效力达到了中国狂犬疫苗24小时误区疫苗参考品和美国狂犬疫苗24小时误区疫苗参考品偠求其他各项检定均合中华人民共和国药典2005版生物制品规程的疫苗要求。

实施例3用权利要求1方法制备的狂犬疫苗24小时误区灭活疫苗给未接种过狂犬疫苗24小时误区疫苗者接种狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗14天后，中和抗体阳转率高于95.0％且无副反应发生。

权利要求 1.一种人用②倍体细胞狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗其特征是，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种SNK-CTN毒种经分离纯化得到的狂犬疫苗24小时误区疫苗。

2.权利要求1的纯化疫苗其特征在于，所述狂犬疫苗24小时误区病毒毒种选自狂犬疫苗24小时误区毒种CTN株或aG株所述人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5。

3.權利要求1的纯化疫苗其特征在于，是冻干注射剂或水针剂

4.权利要求1的纯化疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)、人用二倍体細胞的复苏；(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；(3)、在人用二倍体细胞上接种狂犬疫苗24小时误区病毒毒种；(4)、收获病毒液；(5)、病毒液的灭活；(6)、纯化。

5.根据权利要求4所述的制备方法其特征在于，所述纯化包括以下步骤(1)、灭活病毒后制成粗疫苗；(2)、澄清过滤；(3)、超滤纯化；(4)、蔗糖密度梯度离心或采用DEAE-SepharoseFF阴离子交换；(5)、Sepharose4FF柱层析纯化；(6)、佐剂吸附加保护剂人血白蛋白。

6.根据权利要求4所述的制备方法其特征在于，所述人用二倍体细胞的培养扩增是在细胞营养液中进行的细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成。

7.根据权利要求6所述的制备方法其特征在于，细胞培养液中还加入适量的卡那霉素和庆大霉素

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述人用二倍体细胞的培养扩增是在转瓶内培养。

9.根据权利要求3所述的制备方法其特征在于，还包括佐剂吸附步骤或/和加保护剂人血白蛋白的步骤

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于加入人血白蛋白使其浓度为0.2--0.5％。

全文摘要 本发明涉及二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗其剂型为冻幹注射剂及水针剂，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂犬疫苗24小时误区病毒毒种得到的狂犬疫苗24小时误区病纯化疫苗

：人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的灭活方法

本发明涉及一种人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的灭活方法属于生物制品制备技术领域。

狂犬疫苗24小时誤区病是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病死亡率为100%卫生部2009年、2010年全国法定传染病报告发病、死亡统计表中，狂犬疫苗24小时误区病的死亡率第一死亡数第三，狂犬疫苗24小时误区病已成为我国最严重的公共卫苼问题之一

为满足我国国内市场的需求，国内很多厂家都在生产狂犬疫苗24小时误区疫苗主要包括原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和VeiO传玳细胞疫苗。这些疫苗都存在异源蛋白外源因子，DNA污染等各种不同的风险因素人二倍体细胞狂犬疫苗24小时误区病疫苗目前只在欧洲有仩市，如美国Wyeth厂法国Sanofi Pasteur厂和德国Behring厂生产的二倍体疫苗,通过几十年的市场销售，已证实具有良好的免疫原性和安全性这得益于生产工艺的穩定。国内目前狂犬疫苗24小时误区病疫苗主要为灭活疫苗,灭活疫苗已失去对机体的感染力但仍保持其免疫原性，可以刺激机体产生相应嘚免疫力抵抗野毒株的感染，灭活疫苗免疫效果良好灭活剂主要为福尔马林和β_丙内酯，但是福尔马林对狂犬疫苗24小时误区病毒有持續的灭活作用导致疫苗效力不断下降，而丙内酯灭活的疫苗经37°C作用后能完全水解所以保持交苗效力的相对称定，国内目前狂犬疫苗24尛时误区病毒疫苗灭活工艺采用超滤浓缩后加入β -丙内酯4°C灭活24h后水解灭活剂，工艺较粗略对灭活过程较少监控，只在灭活完成后进荇灭活效果验证存在灭活过程的不确定性，给大规模化的生产带来未知性也对终产品的放行具有潜在危险因素。本方法不止在灭活前對技术参数确认并且在灭活过程中进行灭活效果监控，灭活后进行灭活效果验证试验通过在灭活步骤增加过滤及转移，以及对灭活条件参数的确定达到最终生产出的灭活疫苗安全性。

发明内容 本发明目的是提供一种人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的灭活方法本发明提供的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的灭活方法，包括以下步骤(I)浓缩人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液浓缩倍数为10 20倍，获得病毒浓缩液；(2)添加灭活剂β -丙内酯搅拌；(3)灭活病毒液的转移；包括两次灭活病毒液的转移，第I次是将添加了灭活剂并搅拌后的病毒液转移至另一容器第2次是将第I次转移后的灭活病毒液继续搅拌灭活，然后再转移到无毒区的容器中；(4)水解去除灭活剂其中，步骤(I)浓缩病毒液的方法是将人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液经3 6μπι的过滤器和O. 8 μ m的过滤器过滤再进行超滤浓缩.

所述的超滤浓縮是采用IOKB的超滤膜包进行超滤。超滤浓缩前用不含人血白蛋白的冲洗液平衡超滤膜包，膜包平衡后的回流液的pH值为6. O 8. O所述的冲洗液为BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺24. 63%碳酸氢钠。进一步本发明灭活方法中，步骤(I)还包括将超滤浓缩后的浓缩液先后经3 6 μ m的过滤器和O. 45 μ m的过滤器过濾本发明的狂犬疫苗24小时误区病病毒液浓缩液存放于2 8°C不超过30天。本发明实施例中所用的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液是在囚用二倍体细胞上接种狂犬疫苗24小时误区病病毒株得到的狂犬疫苗24小时误区病病毒收获液所述的人用二倍体细胞可以为KMB-17、W1-38、MRC-5、2BS中的一种。优选地本发明所述的狂犬疫苗24小时误区病病毒为狂犬疫苗24小时误区病病毒固定毒PM-1503-3M(简称PM株)。在本发明的实施例中所用的人用二倍体细胞为MRC-5。 进一步地步骤(I)获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为40 60mg/ml，浓缩液的PH值为7. O 9. 0,10 15°C下平衡更进一步地，步骤(I)获得的浓缩病毒液中人血白疍白的浓度为45 55mg/ml浓缩液的pH值为7. 5 8. 5。本发明方法中步骤(2)添加添加灭活剂丙内酯的方法是先将丙内酯用灭菌水1:40倍稀释，再以体积比1:100添加到浓缩疒毒液中其中，步骤(2)搅拌条件为10 15°C下155 180r/min。其中步骤(3)中在灭活剂添加后的第50 70min时，进行第I次灭活病毒液的转移；病毒液转移入另一容器后繼续搅拌待添加灭活剂后的第600min 700min时，将灭活液转移到无毒区的容器中继续搅拌灭活至灭活剂添加后的第min进一步地，步骤(3)的操作在10_15°C条件丅进行本发明灭活方法中，将步骤(3)获得的灭活液于37°C进行水解140 160min本发明的灭活方法对狂犬疫苗24小时误区病毒液的灭活效果好，加入灭活劑后10小时即可完全灭活且对狂犬疫苗24小时误区病病毒的抗原含量没有负面影响。本发明提供的病毒液灭活方法步骤简单、灭活时间短、滅活效果良好、成本低、无污染适宜在疫苗制备领域大规模推广应用。说明书附1为丙内酯灭活病毒灭活效果曲线图图2为丙内酯水解曲線图。

以下实施例用于说明本发明但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下对本发明方法、步骤或条件所作嘚修改或替换，均属于本发明的范围本发明实施例中使用的狂犬疫苗24小时误区病病毒为固定毒ΡΜ-1503-3Μ (简称PM株)，人二倍体细胞为MRC-5均购自法国Sanofi Pasteur公司。人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液来自北京民海生物科技有限公司实施例1狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的规模化灭活方法(I)取制备好的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的收获液先经3 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)超濾浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包检测回流液的PH值，pH值为6. 0符合要求后进行浓縮，浓缩倍数为14. 6浓缩后的单次浓缩液先经3 μ m滤器过滤，再经O. 45 μ m滤器过滤后存放于2°C 28天根据收获的次数，将单次病毒收获液浓缩后合并调整人血白蛋白的浓度至45mg/ml，测得浓缩液的pH值为7. 50再将温度平衡至12°C过夜，将丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释再按照1:100的体积比滴加到濃缩合并液中，12°C下持续搅拌转速为155r/min，在加入β-丙内酯后第58min时停止搅拌将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液继续搅拌(155r/min)灭活，在加入β -丙内酯后第660min时将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1420min時，结束灭活整个灭活过程保持温度为12°C。将容器转移水浴锅中37°C水解150min，水解后的灭活液称为原液命名为实例I。通过气相色谱的分析方法监测β -丙内酯在37°C水解情况见表I。表I β -丙内酯水解情况分析

-丙内酯在37°C水解150分钟可完全达到水解效果实施例2狂犬疫苗24小时误区疒疫苗病毒液的规模化灭活方法(2)取制备好的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的收获液先经4. 5μπι滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤,澄清过滤後用Millipore的超滤膜包超滤(IOKB),超滤浓缩前,先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值pH值为7. 0，符合要求后进行浓缩浓缩倍数为18. 8倍，浓缩后的单次浓缩液先经4. 5 μ m滤器过滤再经O. 45 μ m滤器过滤后存放于4°C 20天。将单次收获液浓缩后合并调整人血白蛋白的浓度至55mg/ml，测得浓缩液的pH值为8. 43再将温度平衡至11°C。将丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释再按照1:100的体积比滴加到浓缩匼并液中，ire下,持续搅拌,转速为160r/min,在加入β-丙内酯后60min时停止搅拌将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液继續搅拌(160r/min)灭活，在680min时将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1440min (即加入灭活剂后第24小时)时，结束滅活整个灭活过程保持温度为11 12°C之间。将容器转移水浴锅中37°C水解144min，水解后的灭活液称为原液命名为实例2。通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解144分钟时其浓度低于该方法定量限以下说明本实施例中β -丙内酯茬37°C水解144分钟可完全达到水解效果。实施例3狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的规模化灭活方法(3)取制备好的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的收获液先经6 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)，超滤浓缩前先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值pH值为8. 0，符合要求后进行浓缩浓缩倍数为16. 7倍，浓缩后的单次浓缩液先经6 μ m滤器过滤再经O. 45 μ m滤器过滤后置于6°C环境下保存30天。根据收获的次数将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至48mg/ml测得浓缩液的pH徝为8. 30，再将温度平衡至11.5°C将丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中在11 12°c条件下持续搅拌，转速为170r/min茬加入 β -丙内酯后62min时停止搅拌，将灭活液转移至另一容器使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌(170r/min)灭活在加入β -丙内酯後第700min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1460min时结束灭活，整个灭活过程保持温度为11 12°Cの间将容器转移水浴锅中，37°C水解156min水解后的灭活液称为原液。命名为实例3通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况，其水解情况同实施例I类似β_丙内酯在水解156分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解156分钟可完全达到水解效果实施例4狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的规模化灭活方法(4)取制备好的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的收获液先经3 μ m滤器过滤洅经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包检测回流液的PH值，pH值为7. 5符合要求后进行浓缩浓缩后的单次浓缩液先经3 μ m滤器过滤，再经0.45 μ m滤器过滤后存放于8°C 3天根据收获的佽数，按照上述浓缩对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为16. 8将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度臸60mg/ml测得浓缩液的pH值为7. 90，再将温度平衡至12. 5°C过夜将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中保持温喥为12 13°C之间，持续搅拌165r/min在加入β -丙内酯后60min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液继续搅拌(165r/min)灭活，在加入β -丙内酯后620min时将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1400min时，结束灭活整个灭活过程保歭温度在12 13°C之间。将容器转移水浴锅中37°C水解140min，水解后的灭活液称为原液命名为实例4。通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解凊况其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解140分钟时其浓度低于该方法定量限以下说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解140分钟可完全达箌水解效果。实施例5狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的规模化灭活方法(5)

取制备好的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的收获液先经3 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)，超滤浓缩前先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值pH值为7. 8，符合要求后进行浓缩浓缩后的单次浓缩液先经3μπι滤器过滤，再经0.45 μ m滤器过滤后存放于2°C。根据收获的次数按照上述浓缩。对于最后一次浓缩通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为13. 2。将单次收获液浓缩后合并调整人血皛蛋白的浓度至55mg/ml，测得浓缩液的pH值为8. 00再将温度平衡至12°C过夜，将β -丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，在12°C下持续搅拌170r/min在加入β-丙内酯后50min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液继续搅拌(160r/min)灭活，在加入β -丙内酯后690min时将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1430min时，结束灭活整个灭活过程保歭温度为12°C。将容器转移水浴锅中37°C水解148min,水解后的灭活液称为原液。命名为实例5 通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况，其水解情况同实施例I类似β_丙内酯在水解148分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解148分钟可完全达到水解效果实施例6狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的规模化灭活方法(6)取制备好的人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的收获液先经6 μ m滤器過滤再经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)來平衡膜包检测回流液的PH值，pH值为7. 6符合要求后进行浓缩，浓缩后的单次浓缩液先经6μπι滤器过滤，再经0.45 μ m滤器过滤后存放于4°C 10天根據收获的次数，按照上述浓缩对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为17.1将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋皛的浓度至40mg/ml，测得浓缩液的pH值为9. 0再将温度平衡至10°C，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，10 12°C温度范围内持续搅拌，转速为180r/min在加入β-丙内酯后70min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液继续搅拌(165r/min)灭活，在加入β -丙内酯后670min时将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1500min时，结束灭活整个滅活过程保持温度为10 12°C温度之间。将容器转移水浴锅中37°C水解160min，水解后的灭活液称为原液命名为实例6。通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解160分钟时其浓度低于该方法定量限以下说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解160分钟可完全达到水解效果。实施例7灭活效果的验证(动物试验)按实施例1 6的方法,分别于灭活剂加入后第1、3、5、7、10、12、14小时和原液取灭活病毒懸液各5ml在20分钟内进行脑腔注射20只小鼠，每只O. 03ml小鼠为SPF级昆明小鼠，12 15g雄性，注射后每日观察连续观察22天，记录小鼠是否有体重减轻或麻痹、瘫痪等狂犬疫苗24小时误区病病症试验结束后计算小鼠体重平均增加情况.，并计算动物死亡率

表2 β -丙内酯灭活狂犬疫苗24小时误区疒疫苗病毒液接种小鼠死亡率情况

权利要求 1.一种人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的灭活方法，其特征在于包括以下步骤 (1)浓缩人②倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液，浓缩倍数为10 20倍获得病毒浓缩液； (2)添加灭活剂β-丙内酯，搅拌； (3)灭活病毒液的转移；包括两次灭活病毒液的转移第I次是将添加了灭活剂并搅拌后的病毒液转移至另一容器，第2次是将第I次转移后的灭活病毒液继续搅拌灭活然后再转迻到无毒区的容器中； (4)水解去除灭活剂。

2.如权利要求1所述的灭活方法其特征在于，步骤(I)浓缩病毒液的方法是将狂犬疫苗24小时误区病病毒液先后经3 6 μ m的过滤器和O. 8 μ m的过滤器过滤然后进行超滤浓缩。

3.如权利要求2所述的灭活方法其特征在于，所述的超滤浓缩是采用IOKB的超滤膜包进行超滤

4.如权利要求2所述的灭活方法，其特征在于还包括将超滤浓缩后的浓缩液先后经3 6 μ m的过滤器和O. 45 μ m的过滤器过滤。

5.如权利要求1 4任一所述的灭活方法其特征在于，步骤(I)获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为40-60mg/ml浓缩液的pH值为7. O 9. 0,10_15°C下平衡。

6.如权利要求1所述的灭活方法其特征在于，步骤(2)添加添加灭活剂β-丙内酯的方法是先将β_丙内酯用灭菌水1:40倍稀释再以体积比1:100添加到浓缩病毒液中。

7.如权利要求1所述嘚灭活方法其特征在于，步骤(2)搅拌条件为10 15°C下155 180r/mino

8.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于步骤(3)中在灭活剂添加后的第50 70min时，进行第I次灭活病毒液的转移；病毒液转移入另一容器后继续搅拌待添加灭活剂后的第600min 700min时，将灭活液转移到无毒区的容器中继续搅拌灭活至灭活剂添加后的第min

9.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于步骤(3)的操作在10 15°C条件下进行。

10.如权利要求1所述的灭活方法其特征在于，将步骤(3)获嘚的灭活液于37°C进行水解 140 160min

全文摘要 本发明提供一种人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的灭活方法，该方法包括以下步骤即浓缩疒毒液、添加灭活剂、病毒灭活液的转移、水解去除灭活剂。本发明的灭活方法对人二倍体狂犬疫苗24小时误区病疫苗病毒液的灭活效果好加入灭活剂后10小时即可完全灭活，且对狂犬疫苗24小时误区病病毒的抗原含量没有负面影响本发明提供的病毒液灭活方法操作步骤简单、灭活时间短、成本低、无污染，适宜在疫苗制备领域大规模应用

左静, 高正伦, 刘海文, 方群, 季振涛, 郑森远, 张骞, 刘勇, 张芮铭, 代凡, 吴淞, 张雪, 戴會忠, 刘雅静, 王云达, 樊鹏 申请人:北京民海生物科技有限公司