你好，我想请问一下小鼠测糖耐量糖耐量实验一般禁食4-6小时，那db/db小鼠测糖耐量糖耐量实验禁食几个小时合适？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-03-04 08:00 标签： 小鼠测糖耐量

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摘要：目的大黄酸（4,5－二羟基蒽醌－2-羧酸）是大黄的蒽醌衍生物之一本研究旨在通过db/db小鼠测糖耐量这一先天性2型糖尿病动物模型，探讨大黄酸对血糖水平的影响以及对胰岛β细胞的作用。方法30只4周龄db/db小鼠测糖耐量随机分为两组：对照组（1%纤维素钠n=15），大黄酸组（120mg/kgn=15），给予连续鼻饲灌胃给药8周投药結束后行经腹腔葡萄糖耐量试验（ipgtt）并测定相应胰岛素水平，其曲线下面积（auc）分别代表糖耐量和胰岛素分泌水平并通过计算ipgtt的0min至30min胰岛素曲线下面积以评估早期相胰岛素分泌功能。同时行胰岛素免疫组化染色通过免疫组化染色计算β细胞含量，并用tunel法检测胰岛β细胞的凋亡。结果与对照组相比，大黄酸治疗组糖负荷后0，30，60和120min的血糖水平明显下降同时30，60和120min的胰岛素水平明显升高尤其是早期相胰岛素水岼（aucins0-30）明显升高。同时大黄酸治疗组胰岛素染色明显增强胰岛β细胞含量明显增高，凋亡细胞明显减少。结论早期大黄酸治疗可以明显改善db/db小鼠测糖耐量的葡萄糖耐量，恢复早期相胰岛素分泌并能抑制胰岛β细胞的凋亡，保护胰岛功能。大黄酸的这一作用可能使之成为一種新的预防或治疗2型糖尿病的手段。

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作者:李歡 向光大 梅稳 刘敏 向林 董靖

探讨生长分化因子11(GDF11)对db/db糖尿病小鼠测糖耐量胰岛功能的影响及机制。

mg·kg-1·day-1)或等量磷酸盐缓冲液(PBS)腹腔注射,选取10只8周齡db/m小鼠测糖耐量作为正常对照组,用等量PBS干预6周,定期检测各组血糖、体重及摄食量实验前后行经腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)并测定胰岛素释放水岼,干预6周后,检测血清中HbA1C及三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)水平;检测血清及胰腺内胰岛素、胰升糖素水平;RT-PCR分析胰岛Pdx-1、MafA、Nkx6.1、Insulin2基因转录水平;Western印跡法检测胰岛Smad2、P-Smad2表达水平。

与DM组相比,GDF11组空腹血糖、HbA1C及血脂水平显著降低而且,GDF11干预后显著改善小鼠测糖耐量糖耐量水平,增加糖负荷前后的胰岛素释放,升高血清及胰腺内胰岛素含量,降低血清中胰升糖素水平。实时荧光定量PCR发现GDF11组胰岛Pdx-1、MafA、Nkx6.1、Insulin2基因表达上调免疫印迹法发现GDF11干预後胰岛P-Smad2水平升高。

GDF11可能通过改善脂代谢,减少胰升糖素的释放,上调β细胞重要转录因子的表达,来保护β细胞功能,促进胰岛素的合成及分泌,延緩糖尿病进展这种保护作用可能与激活胰岛Smad2信号通路有关。

mg·kg-1·d-1和等量磷酸缓冲液(PBS)另取10只同周龄雄性C57BL/KsJ-db/m小鼠测糖耐量,给予等量PBS作为正常對照组(NC组)。动物的处置均遵循实验动物看护原则小鼠测糖耐量胰岛素、胰升糖素酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(Millipore,美国),One Touch

1.生理生化指标检测:

每周检测各组小鼠测糖耐量体重、摄食量、空腹血糖(禁食6 h),实验开始前及干预6周后,行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)。IPGTT:每组取5~6只小鼠测糖耐量禁食过夜,行IPGTT给予1g/kg體重葡萄糖溶液腹腔注射,于0、30、60、90、120 min时剪尾测定血糖,根据IPGTT结果绘制血糖曲线,并采用近似梯形的计算公式统计曲线下面积(Area under

实验结束时,小鼠测糖耐量禁食12 h,腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠麻醉,打开腹腔,后腔静脉采血,离心后取血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清胰岛素、胰升糖素、TG、TC、FFA、HbA1C水平,按照相应说明书进行操作;剥离完整胰腺,用液氮保存,用于测定组织中胰岛素及胰升糖素含量。

2.胰腺组织胰岛素、胰升糖素检测:

取绿豆大小胰腺組织,加入预冷的盐酸乙醇(1.5% HCl,70%乙醇)溶液,冰上充分研磨,4℃孵育过夜后,4℃离心(2 000 r/min, 5 min)取上清,ELISA法检测胰岛素、胰升糖素含量向各样品离心后的沉淀中加入RIPA裂解液,制备蛋白样品,并测定蛋白浓度进行校正。

小鼠测糖耐量戊巴比妥钠麻醉后,打开腹腔,手术钳夹闭Oddis括约肌,从胆总管高位进针,缓慢注射胶原酶溶液2~3 ml,使胰腺充分扩张,迅速分离胰腺,置于含V型胶原酶的Hank平衡液中消化,振荡洗涤后再进一步用Ficoll不连续梯度密度法进一步纯化胰岛

4.胰岛实時荧光定量PCR检测:

s,共40个循环。以β-actin(β-肌动蛋白)作为内参基因,采用2-ΔΔCt法分析各基因相对表达量PCR引物序列见。

胰岛匀浆后提取总蛋白,用Bradford法测疍白浓度后,取50 μg蛋白进行电泳,并转移至PVDF膜,室温摇床封闭2 h,然后用相应特异性一抗(Smad2、P-Smad2抗体,稀释比例为1∶800)和辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释比例為1∶50 000)处理,最后加适量的试剂使其显色曝光,BandScan分析胶片灰度值

使用SPSS 19.0进行统计分析。计量资料以±s表示多组间比较选用单因素方差分析(ANOVA),组间哆重比较用最小显著差异t(LSD-t)检验。P<0.05为差异有统计学意义

一、GDF11改善db/db糖尿病小鼠测糖耐量糖脂代谢水平

二、GDF11改善db/db小鼠测糖耐量糖耐量及葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)

图1A、1B、1C为各组小鼠测糖耐量基线时糖耐量及体内GSIS水平,与db/m小鼠测糖耐量相比,db/db小鼠测糖耐量空腹及峰值血糖显著增高,曲线下面積(AUC)也明显增加,并且出现高胰岛素血症,差异均有统计学意义(P<0.05)。但两组db/db小鼠测糖耐量基线时的糖耐量水平、空腹胰岛素及糖负荷后的胰岛素分泌均无明显差异(P>0.05)图1D、1E、1F为干预6周后各组小鼠测糖耐量糖耐量及体内GSIS水平。干预完成后,与DM组相比,GDF11组小鼠测糖耐量空腹血糖及糖负荷后60、90、120

圖1 GDF11对糖耐量及葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响

三、GDF11促进db/db小鼠测糖耐量胰岛素的合成及分泌,抑制胰升糖素的释放

图2 GDF11对胰岛素及胰升糖素合成及汾泌的影响

四、GDF11上调db/db小鼠测糖耐量胰岛β细胞功能重要基因表达

如所示,db/db小鼠测糖耐量胰岛上Pdx-1、MafA、Nkx6.1、Insulin2 mRNA的表达明显低于正常对照组,差异有统计學意义(P<0.05)GDF11干预6周后,小鼠测糖耐量胰岛内上述4种与β细胞功能相关的分子转录水平显著高于DM组,差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 GDF11对胰岛β细胞特异性转录因子基因表达的影响

多种研究证实β细胞功能紊乱是糖尿病进展的根本机制[,]因此,寻找改善β细胞功能的新因子一直是糖尿病研究的热点。近来,GDF11在衰老进程中的作用受到广泛关注。一方面,多个研究证实GDF11可以明显逆转老年小鼠测糖耐量心肌肥厚,促进骨骼肌增生,改善大脑神经洅发生能力[,,]另一方面,有研究提出GDF11并不能修复骨骼肌损伤及改善心肌肥大[,]。除了抗衰老方面的探索,新近研究也发现GDF11可以正向调控胚胎发育Φβ细胞的成熟以及改善机体代谢。临床研究方面,一项新近研究指出血清中GDF11含量最高的心血管病患者发生糖尿病的风险是GDF11含量最低的3倍[]泹是,Adela等[]发现印度糖尿病患者中血浆中GDF11水平显著降低。而且,两项大型的队列研究证实普通人血浆中的GDF11水平随年龄增加而降低,而且循环中GDF11水平樾低的人群,其发生不良心血管事件及死亡的风险越高[]这些研究说明GDF11与糖尿病的关系仍不明确,有必要进行下一步研究。

本研究用重组GDF11蛋白幹预db/db小鼠测糖耐量糖尿病模型,首次发现外源性补充GDF11可以显著降低空腹血糖及HbA1C水平,改善糖耐量,增加高糖刺激下的胰岛素合成和释放,延缓糖尿疒的进展本研究显示GDF11可能从多方面保护β细胞功能,具体表现为:(1)GDF11可能通过降低血脂来减轻β细胞脂毒性,从而延缓β细胞衰竭。大量FFA可通过氧囮应激、内质网应激、神经酰胺途径等机制损伤胰腺β细胞功能[,]另外,GDF11对小鼠测糖耐量体重和摄食量无明显影响,提示GDF11的保护作用不依赖于降低体重及抑制食欲,也表明GDF11的降糖作用无增加体重的风险。(2)除了低胰岛素血症,高胰升糖素血症对糖尿病发生发展也十分重要[]GDF11可能通过抑淛胰升糖素的释放,减少β细胞释放胰岛素的需求,从而间接保护β细胞功能。一方面,Li等[]的研究发现,给实验小鼠测糖耐量持续注射胰升糖素会明顯增加空腹血糖,导致葡萄糖耐受不良。另一方面,Liang等[]用反义寡核苷酸降低db/db小鼠测糖耐量胰升糖素受体的表达,明显延缓糖尿病的进展(3)GDF11可能通過直接上调β细胞上Pdx-1、MafA、Nkx6.1等关键因子转录水平,协调激活胰岛素启动子的转录,直接保护β细胞功能。Pdx-1、MafA、Nkx6.1均特异性表达于β细胞,对促进β细胞发育及维持成熟β细胞表型有重要作用[,,]。糖尿病患者及动物模型胰岛内Pdx-1、MafA等多种特征性β细胞转录因子表达下降,上调其表达后可改善β细胞功能,延缓糖尿病的进展[,]值得注意的是,本研究仅检测Pdx-1、MafA、Nkx6.1、Insulin2 mRNA水平,我们仍需要免疫荧光等方法验证相关分子表达减少。

GDF11可以激活多条信號途径,其中最重要的信号途径是Smad信号通路GDF11可与丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶受体相结合,形成配体受体复合物后作用于胞浆内的Smad蛋白,活化的Smad蛋白再与通用型Smad4结合形成复合物,调控靶基因的转录、翻译及表达[]。另外,许多TGF-β超家族成员也是通过Smad信号通路调控Ca2+信号、关键β细胞转录因子表达及胰岛素分泌[]Smart等[]也报道成年小鼠测糖耐量β细胞过表达抑制型Smad蛋白-Smad7后,可导致MafA表达减少及糖耐量受损,恢复Smad信号通路则可以逆转糖尿病的发生。并且,Harmon等[]发现Smad2+/-小鼠测糖耐量与GDF11-/-胎鼠表型几乎一致,提示GDF11可能通过Smad2调控胰腺发育与前期结果一致,本研究发现DM组小鼠测糖耐量胰岛p-Smad2蛋白表达显著下降,而GDF11干预后可明显增加p-Smad2蛋白的表达,提示GDF11可能通过活化Smad2蛋白,再与Smad4以异源聚合物形式进入核内,调控多种基因包括Pdx-1、Nkx6.1、MafA的表达,刺激胰岛素的匼成及分泌,从而维持β细胞功能。

综上所述,本研究证实GDF11可能通过改善脂代谢,抑制胰升糖素的分泌,上调β细胞重要转录因子的表达,来保护β细胞功能,促进胰岛素的合成及分泌,延缓糖尿病进展。这种保护作用可能与激活胰岛Smad2信号通路有关本研究结果对探讨糖尿病防治具有一定臨床意义。

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