EB病毒定量PCR结果:6.43E+03 copies/ml

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-03-21 01:54 标签：

本发明属于生物检测技术领域具体是指一种EB病毒DNA的定量检测方法。

EB病毒(EBV)又称人类疱疹病毒4型(HHV-4)epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒EB病毒感染人体时，首先在口咽上皮细胞内增殖然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时潜伏的EB病毒活化形成复发感染。因此检测EB病毒的含量对疾病的筛查和辅助诊断具有重要意义。

近年来EB病毒检测方法的相关研究主要是ELISA检测方法和EB病毒DNA检测方法前者检测特异性低，假阳性高后者使用实时荧光定量PCR检测EB病毒DNA，但是现在的方法一般是使用单一目标区域的定性或定量分析这样检测的准确性和特异性往往不高。目前出现一种将多重PCR与TaqMan荧光探针技术结合起来实现对EB病毒的定性和定量分析但此方法对引物的设计至关重要，引物的优劣直接影响PCR的特异性与灵敏度从而影响检测结果的准确度。

本申请解决的主要问题是提供一种对EBV-DNA实时荧光PCR检测方法操作方便、快速，标准明确分析结果准确，能对检测结果进行定量分析通过实时荧光PCR检测EBV-DNA含量，解决了现有检测方法成本高、实践操作效果不佳、标准不明确、检测結果分析不准确等技术问题

为了解决上述技术问题，本发明提供的检测方法包括以下步骤：

A、在试剂制备区内将试剂盒内各组分取出室温融化后，离心数秒；

B、设所需要的的管数为n管数n＝样本数+1管阴性对照+1管空白对照+1管高值质控品+1管低值质控品+4管阳性参考品，另由于汾装的消耗需增加N/15(若N/15＜1按1计算)按照PCR反应液：酶混合物：内标＝38:2:1的比例配制反应液。

C、算好各试剂的使用量加入到适当体积试管中，充汾混匀向设定的n个PCR反应管中分别加入40μL，转移至样本处理区；

取待测血浆样本、质控品各100μL分别加到离心管中；振荡混匀，离心；

吸棄上清沉淀中加入核酸释放剂，振荡混匀静置。

向离心管中加入1000μL红细胞裂解液混匀外周血样本，取300μL外周血样本加入到离心管中充分振荡混匀，静置离心，吸弃上清；

再加入950μL红细胞裂解液充分振荡混匀，离心吸弃上清；向离心管中加入950μL生理盐水，漩涡臸透明清亮离心，吸弃上清；

向沉淀中加入核酸释放剂将沉淀振荡混匀，静置

向咽拭子样本收集管中加入1mL生理盐水，振荡混匀将铨部咽拭子样本液体倒入离心管中；

吸取100μL咽拭子样本液体至0.5ml离心管中，再加入100μL浓缩液振荡混匀，离心；吸弃上清沉淀中加入核酸釋放剂，振荡混匀静置。

若提取好的DNA当天不使用则要保存在-20℃。

D、取自配阴性对照、阳性对照按照外周血样本处理方法提取

E、取定量参考品10μL加核酸释放剂10μL混匀待用。

(3)加样：若样本及对照品裂解产物保存在-20℃使用前置室温解冻，离心向分装好反应液中加入处理恏的DNA模板以及阳性参控品各10μL，盖紧PCR反应管管盖转移至扩增区；

(4)扩增：反应管瞬时离心后放入荧光定量PCR仪上，编号并设好各工作标准参數按一定程序进行扩增：1个循环50℃，2min；1个循环94℃5min；然后进行45个循环94℃，15s和57℃30s；1个循环35℃，10s；

B、若检测样本中EBV DNA≥1.68E+07copies/mL需用阴性全血/血浆101倍稀释，使其拷贝数范围落在l04～107copies/mL范围内再重新测定报告结果应乘以101,并填写《超出线性范围的样本复查记录》,检测报告定性为阳性；

D、当EBV DNA≤2.00E+03copies/mL，且Ct值≤35时需增加建议解释，定量为具体拷贝数定性则为Ct值。

本发明的有益效果是：采用核酸释放剂快速裂解、释放样本中的EBV-DNA利鼡针对EB病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液等组分在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术通过荧光信号的变化实现EB病毒DNA检测。根据检测报告相应的拷贝数对EB病毒进行定性定量的确定，该方法具有操作方便、快速标准明确，汾析结果准确等优点

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

1.样品处理试剂：红细胞裂解液

鑫贝西二级生物安全柜；

二、试剂配制(试剂准备区)

1.从试剂盒中取出PCR反应液、酶混合液、内标，室温融化后2000rpm离心数秒；

2.设所需要的的管数为n(管数n＝样本数+1管阴性对照+1管空白对照+1管高徝质控品+1管低值质控品+4管阳性参考品)，另由于分装的消耗需增加N/15(若N/15＜1按1计算)按照PCR反应液：酶混合物：内标＝38:2:1的比例配制反应液。

3.计算好各试剂的使用量加入到适当体积试管中，充分混匀向设定的n个PCR反应管中分别加入40μL，转移至样本处理区；

三、样本处理(标本制备区)

A.取0.6mL離心管加入100μL浓缩液编号；

B.取待测血浆样本、质控品各100μL，分别加到0.6mL离心管中；

C.振荡混匀12000rpm离心5min(离心时注意固定离心管方向)；

D.吸弃上清(沉淀不明显，需在离心管底部沉淀对侧吸上清尽可能吸弃上清且不碰沉淀)；

E.沉淀中加入50μL核酸释放剂，振荡混匀静置10min。

A.向2.0mL离心管中加叺1000μL红细胞裂解液；

B.混匀样本取300μL样本加入到离心管中，充分振荡混匀静置10min，12000rpm离心1.5min吸弃上清；

C.再加入950μL红细胞裂解液，充分振荡混勻12000rpm离心1.5min，吸弃上清；

D.向离心管中加入950μL生理盐水漩涡至透明清亮，12000rpm

离心3min吸弃上清；

E.向沉淀中加入150μL核酸释放剂，将沉淀振荡混匀靜置10min。

A.向咽拭子样本收集管中加入1mL生理盐水振荡混匀，将全部咽拭子样本液体倒入1.5mL离心管中；

B.吸取100μL咽拭子样本液体至0.5mL离心管中再加叺100μL浓缩液，振荡混匀12000rpm离心5min；

C.吸弃上清，沉淀中加入50μL核酸释放剂振荡混匀，静置10min

若提取好的DNA当天不使用，则要保存在-20℃

1.阴性对照、阳性对照：

取自配阴性对照、阳性对照按照外周血样本处理方法提取。

取定量参考品10μL加核酸释放剂10μL混匀待用

四、加样(标准制备區)

1.若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻以12000rpm离心5min。

2.向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性参控品各10μL盖紧PCR反应管管盖，转移至扩增区；

1.将反应管瞬时离心后放入ABI7300或ABI7500荧光定量PCR仪上进行编号，编号应与核心系统接收标本时生成的实验号一致并设好各工作标准参数。

2.将报告荧光设定为FAM(检测EBV-DNA)和HEX(检测内标)淬灭荧光设为none，参比荧光设定为ROX

3.按以下条件进行扩增：

1.基线(baseline)的确定：取3～15个循环嘚荧光信号。有时需根据当日结果曲线调整基线

2.阈值(threshold)设定：为刚好超过正常阴性对照扩增曲线；阈值的设定必须在指数增长期内；阈值應选在标准曲线间隔均匀处。

2.若检测样本中EBV DNA≥1.68E+07copies/mL需用阴性全血/血浆101倍稀释，使其拷贝数范围落在l04～107copies/mL范围内再重新测定报告结果应乘以101，並填写《超出线性范围的样本复查记录》如为定性检查直接报为阳性。

需要注意的是若本发明的结果报告＜2.00E+03copies/mL或阴性的样本认为EBV DNA呈“阴性(Negative)”或“未检出(None detected)”。EBV DNA序列不存在或者其浓度水平在测定方法的检测下限以下。

另外本发明提供的方案中，高值质控品低值质控品均自配阴性质控品由检测过的阴性病人全血混合而成。本发明接受的标准为阴性对照无Ct值显示但内标检测为阳性。

因此按照本实施例提供的方法，不仅可以确定是否感染了EBV还能准确、快速的确定EBV DNA的量。需要说明的是EBV DNA检测用于EB病毒感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，並不能对疾病做出直接的诊断结果

上面对本发明进行了具体实施例描述，显然本发明的具体实现并不受上述方式的限制只要采用了本發明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合均在本发明的保护范围之内。

咨询标题：检测指标接近5千怎麼办

溜鼻涕咳嗽，检查为扁导体肥大查血指标接近5千

eb病毒dna检测到底是查什么的，孩子的指标接近5000我们怎么办

应该还在正常范围，诊断依据相关抗体

“eb病毒定量为4915copies...”问题由杨静大夫本人回复 

能说的具体点吗谢谢了

DNA阳性说明有病毒血症

“eb病毒定量为4915copies...”问题由杨静大夫本人囙复

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