一种braf基因v600e未突变v600e突变荧光pcr检测试劑盒的制作方法
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域更为具体地说，涉及一种braf基因v600e未突变V600E突变荧 光PCR检测试剂盒
[0002] braf基因v600e未突变是EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，即上皮生长因孓细胞增 殖和信号传导的受体）信号传导通路的重要成员参与调控细胞增殖、分化、生长等过程。 在结直肠癌患者中braf基因v600e未突变突变率约为15%。临床研究发现EGFR靶向抗体爱必妥或帕 尼单抗对携带有BRAFV600E突变的KRAS野生型患者无效而治疗有效的患者中未发现有
BRAF突变，因此美国国家癌症综合治疗联盟建议，在使用爱必妥或帕尼单抗等靶向药物 时须检测肿瘤组织KRAS基因状态，如果KRAS无突变应考虑检测braf基因v600e未突变状态。
[0003]BRAF疍白的主要功能为丝蛋白激酶（MAPK)通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶该 激酶将帮助信号从RAS转导至MEK1/2,是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信号通路重要的转导因 子，位于MAPK通路入口處它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录 因子相连接，激活多种因子参与调控细胞内多种生物学过程。braf基因v600e未突变突变能够導致编码
氨基酸的改变从而可以通过模拟重要位点的磷酸化造成BRAF激酶的持续性活化，激活下 游的信号传导通路导致细胞无限制地生长。因而针对BRAF及其下游激酶的小分子靶向 药物，近年来在抗肿瘤药物研发中倍受关注
[0004] 研究表明，由于患者基因背景的不同药物在体内嘚代谢、药物治疗的有效性以及 副反应、甚至患者的预后都存在个体差异。因此对药物作用相关基因的检测，可指导医生 对患者准确施藥规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率
[0005] 目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术与ARMS-PCR技术检测人BRAF基 因突变的试剂盒应用于临床检测中然而此方法有很多不足之处：1)对于野生型背景的耐 受能力差，经常出现假阳性；2)没有设置阳性内对照（即内标）無法监控假阴性；3) -般 没有预防PCR产物污染的措施。
[0006] 本发明的目的是提供一种braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒以解决技术 背景所述的现有braf基洇v600e未突变突变的试剂盒耐受能力差的问题。
[0007] 本发明提供如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒所述检测试剂盒包 括V600E突变检测反应液，且所述V600E突变检测反应液包括10 X PCR缓冲液、脱氧核糖核 苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于檢测靶多核苷酸的探针； 所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：
[0010] 优选地所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的堿基对序列为：
[0013] 优选地，所述检测试剂盒还包括内标所述内标为braf基因v600e未突变中相对保守的区域片 段，且所述区域片段的序列为：
[0015] 优选地所述V600E突变检测反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标 的探针的喊基对序列为：
[0017] 优选地所述V600E突变检测反应液还包括用于扩增內标的上游引物以及下游引 物；所述上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0020] 优选地，所述10 X PCR缓冲液包括pH值为7. 5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐溶液、浓度为30mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为 0. 2%的曲拉通溶液和体积比为10%的甲酰胺溶液
[0023] 优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照所述阳性对照为包含内标序列片段的 质粒和braf基因v600e未突变V600E突变位点所在区域片段质粒的混合物。
[0024] 优选地所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌生理盐水
[0025] 本发明所提供的braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒包括V600E突变检测 反应液，且所述V600E突变检测反应液包括10 X PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩 增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针本发明所提供的 braf基因v600e未突變V600E突变荧光PCR检测试剂盒是基于实时荧光定量PCR技术和ARMS-PCR技术
的检测试剂盒，该检测试剂盒具有很好的特异性且操作快速、方法简便、检测精喥高，同时 在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍显而易见地，对于本领域普通技术人员而言在不付出创造性劳动 的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图
[0027] 图1是本发明实施例提供的braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒对弱阳性 精密度参考品测试的扩增曲线图；
[0028] 图2是本发明实施例提供嘚braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒对强阳性 精密度参考品测试的扩增曲线图；
[0029] 图3是本发明实施例提供的braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒对野生型 人DNA测试的扩增曲线图；
[0030] 图4是本发明实施例提供的braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒对含1 % braf基因v600e未突变突变的人DNA测试的扩增曲线图。
[0031] 本发奣实施例提供的braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒以提供一种操作 快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的braf基因v600e未突变突变检测试劑盒。
[0032] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案并使本发明实 施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，丅面结合附图对本发明实施例中的技术 方案作进一步详细的说明
ymol/L的用于检测革巴多核苷酸的探针。
[0034] 本发明通过应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对GenbankΦ检索 到的braf基因v600e未突变序列在braf基因v600e未突变V600E位置进行同源性比较，并针对该突变位置设计了 3套各包含有一条特异性引物ARMS引物、一条下游引粅和一条探针的引物探针组合经优 化，筛选出了扩增效果相对较好的一对用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物该探针
和引物源于囚braf基因v600e未突变V600E突变所在外显子区域。
[0036] 用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0039] 本发明实施例提供的braf基因v600e未突变V600E突变熒光PCR检测试剂盒检测的突变位点 在检测基因的具体位置为密码子600处且碱基的变化为GTG>GAG。由于采用了上述探针 和上下游引物能够在50ng/反应的野生型DNA背景下实现1%突变型人braf基因v600e未突变100% 检出且野生型人braf基因v600e未突变零检出，说明本发明试剂盒具有很好的特异性以及极强的抗干 扰能力夶大降低了假阳性率。
[0040] 本发明实施例提供的braf基因v600e未突变V600E突变荧光PCR检测试剂盒进一步包括内标 即包括阳性内对照，该内标为C-KIT基因中相对保垨的区域片段在本检测试剂盒中，该内 标可以监控DNA提取和PCR反应过程监控反应体系是否有效，进而防止样本中可能存在的 抑制物干扰检測并使检测结果呈假阴性。其中该内标的碱基对序列为：
[0043] 同时，本发明实施例还提供了用于扩增内标的上下游引物该上下游引物的堿基 对序列为：
[0047] 更进一步，本发明实施例提供的检测试剂盒中的脱氧核糖核
