有关人外周血淋巴细胞的分离分离，提取RNA，高手请指教

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2012-03-05 00:52 标签： 外周血淋巴细胞
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如何从外周血淋巴细胞中提取RNA
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本站由提供技术支持关于从血中提取RNA(血中,非抗凝血,RT-PCR,抗凝血)
23:01:17&&&来源：&&&评论：&&
[关于从血中提取RNA(血中,非抗凝血,RT-PCR,抗凝血)] 近日想从全血中提取RNA，做RT-PCR用。但是因为客观原因，存在如下问题：１．能不能从非抗凝血中提取？２．如果抗凝血只有１ｍｌ，能不能提取？或者可以细胞培养之后再提取？３．不用淋巴细胞分离液，而是离心后吸取白细胞层，可以吗？想请高手帮忙解答一下，谢谢！ 关键词:[血中 抗凝血 非抗凝血 RT-PCR 淋巴细胞分离液 细胞培养 白细胞]…
近日想从全血中提取RNA，做RT-PCR用。但是因为客观原因，存在如下问题：１．能不能从非抗凝血中提取？２．如果抗凝血只有１ｍｌ，能不能提取？或者可以细胞培养之后再提取？３．不用淋巴细胞分离液，而是离心后吸取白细胞层，可以吗？想请高手帮忙解答一下，谢谢！
回复第三点应该是可以的，要注意细胞裂解后核酸酶释出，RNA容易降解。1ml 血足够了，我们经常从100ul甚至更少的血清/血浆中提取RNA都没有问题的。是否使用抗凝血可能与你的样本操作程序有关，抗凝剂只是延长有血液凝集的时间而已，当然某些抗凝剂可能会影响到后续的PCR试验性能，如肝素。回复淋巴细胞分离液的作用是把白细胞层和红细胞层以分离液隔开，这样有利于吸取白细胞层而不会受到红细胞层的污染。1ml血已经足够作PCR了，如果提得好，1ml能提出几十微克的RNA。建议还是使用抗凝血，因为凝血后就不能再用了。回复谢谢两位的指导！回复我最近也做过从全血中抽提RNA的实验,也许能回答你的问题:1.可以从非抗凝血中提,加的是triol,但效果不如从抗凝血中加triol-BD的.2.抗凝血只要有200-300ul即可，我抽提的效果都还好。3.我不知道你做的mRNA是否只在淋巴细胞中表达，如不是，则不需要用淋巴细胞分离液。回复我最近也做过从全血中抽提RNA的实验,也许能回答你的问题:1.可以从非抗凝血中提,加的是triol,但效果不如从抗凝血中加triol-BD的.2.抗凝血只要有200-300ul即可，我抽提的效果都还好。3.我不知道你做的mRNA是否只在淋巴细胞中表达，如不是，则不需要用淋巴细胞分离液。回复也在做相同的实验，试着回应一下：1、没有抗凝的血样好像很难作出来，因为很快就会凝固，而且TRIZOL都吹不散，影响后面的试验（我们试过，最后只好把血凝块给扔了，估计淋巴细胞也丢了不少，反正电泳没结果。）2、1ML血足够3、不加淋巴细胞分层液的话容易把红细胞吸起来，我们也试过，看着脏兮兮的，很不爽。
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人外周血淋巴细胞RNA的提取方法(正文)
人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
    
人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
一、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。取1.5ml无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ul PBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。1500rpm,15min,20摄氏度。
1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室 温时，摇匀后使用； 整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存， 本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与 泛影酸葡甲胺。适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、转数为1500rpm，时间范围为15分钟，温度为室温20摄氏度。推荐两步离心法：首先用1500rpm/min离心15min，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用1500rpm /min离心15min。
三、离心后，分四层。淋巴细胞位于第二层（从上到下），呈白蒙蒙的一薄层。用移液器（200ul档）吸取分离液层中的淋巴细胞，这里技巧性比较强，需要多 次练习才能比较熟练的把淋巴细胞吸的比较完全，大约可得到400ul的液体。把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中。加入1mlPBS缓冲液到离心管中，1500r,15min，20摄氏度。把离心后的上层液体倒掉，重复离心步骤至液体无明显红色（即红细胞数量很少），淋巴细胞位于离心管底的一小点白色的物质，一般会混有少量红细胞，尽量避免。
1、洗涤后离心的条件，通常用1500rpm就足够了，太高了容易把细胞离死。时间为15min，温度还是室温20摄氏度。
2、离心后，看到淋巴细胞中混有少量红细胞，在这个实验中问题不大。
3、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。一般洗涤液PBS用3ml即可。
四、用Trizol reagent裂解淋巴细胞，提取RNA。在离心管中加入1ml Trizol试剂，可以裂解除RNA以外的其他大分子物质，细胞膜，细胞器等。这个东西有致癌、致畸性，要带口罩，小心操作。用加液枪吹打离心管底部的淋 巴细胞团块，把其打散。一般至少吹打30-60次，主要目的是把其打散，让Trizol试剂充分裂解淋巴细胞。把吹打之后的液体转移到冻存管中，标记，浸泡进液氮（这一步的目的是快速冻存mRNA），一到两小时以后，转存在-80摄氏度冰箱中。
1、TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
2、在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器 皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 MNaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当TRIZOL用量少于2-ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
3、最后用于装裂解细胞的冻存管请购买无菌无酶的冻存管。
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编辑：王阳
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