[摘要]该文结合新药申报中多糖测定方法中存在的问题，对多糖测定方法的适应范围、对照品的选择、各成分之间的干扰情况、方法" />
免费阅读期刊
论文发表、论文指导
周一至周五
9：00&22：00
中药新药研究中多糖含量测定方法探讨
&&&&&&本期共收录文章20篇
　　[摘要]该文结合新药申报中多糖测定方法中存在的问题，对多糖测定方法的适应范围、对照品的选择、各成分之间的干扰情况、方法研究进展等方面进行了介绍。作者建议：应根据所含多糖的结构及性质选择合适的检测方法，并进行方法学验证，考查所用显色试剂的稳定性、用量、显色时间、最大检测波长等因素，以增加方法的准确性。在多糖的含量测定中应排除单糖及其他水溶性成分的影响；注意对照品的选择；测定波长的选择；关注中性糖和酸性糖测定时的相互干扰，必要时可加入糖抑制剂排除干扰。对于由不同糖残基构成的杂多糖的测定，由于不同单糖的标准曲线的斜率不同，在选择对照品时建议通过研究搞清组成多糖的单糖种类及比例，按此比例配制成混合对照品制作标准曲线，进行测定。 中国论文网 /1/view-6200738.htm　　[关键词]中药新药；多糖；含量测定 　　尽管糖类物质的研究有百年的历史，但长期以来，人们仅把它作为一种能源及细胞结构的支撑物，过于低估了它生命过程中的贡献。随着人类对生命科学深入研究，人们已逐步意识到糖类物质在阐明多细胞生物高层次生命现象中的重要性和必要性，从而揭开了生物化学的一个重大前沿――糖生物学时代，糖类物质的研究已成为学者们关注的焦点。糖的定量、定性测定是糖研究的一个重要基础工作。根据糖的理化性质，如折射率、比重、旋光性、显色反应等设计糖的测定方法，可在一定范围达到所要求的测定目的。下面就现阶段常用的方法中存在的问题进行讨论，以期找到应用于新药研究中测定方法的结合点，更好的控制产品质量。 　　1 研究状况 　　糖类物质是含多羟基的醛类或酮类化合物，以其水解的情况分为单糖、寡糖和多糖。单糖是糖类的组成单元，单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线形或分枝连接成寡糖和多糖。多糖是由10个以上单糖基通过糖苷键连接而成。2～9个单糖基通过糖苷键连接而成的称作寡糖。由1种单糖组成的多糖称作均多糖，由2种以上单糖组成的多糖称作杂多糖。按其性质又分为中性多糖、酸性多糖、还原糖。 　　早在20世纪40―50年代，对糖含量测定方法已进行了众多的研究，常用的有比色法、滴定法、高效液相色谱法、气相色谱法、薄层扫描法、高效毛细管电泳法等，其中高效液相色谱法、气相色谱法、薄层扫描法、高效毛细管电泳法对研究多糖组成应用较多，进行含量测定还需进一步研究完善。现阶段主要还是采用比色法及滴定法较多。但都不是测定多糖的专属性方法。多糖的含量测定是多糖类药物质量控制中考察产品内在质量的项目，也是考察药品稳定性的依据，也是目前研究中的一个难点。经典化学分析法中的蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、碘量法、二硝基水杨酸法、氨基己糖测定法和己糖醛酸测定法等，以及各种色谱法都是通过水解单糖的含量来反映多糖的含量，实际测定的是总糖的含量。由于缺乏对照品， 目前还不能使用HPLC和LPCE直接测定多糖含量。另外，毛细管电泳技术近年来得到迅速发展开始用于多糖的分析。Marsha首次报道用毛细管电泳的激光诱导荧光检测技术，直接测定大相对分子质量多糖，成功地分离了相对分子质量近200万的葡聚糖、褐藻胶等，但还有待进一步研究探讨[1-2]。 　　2 现阶段常用比色法方法中存在问题分析 　　2.1 方法的适应性 现阶段申报的资料中常用方法为蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、碘量法、二硝基水杨酸法、硫酸卡唑法、间羟基联苯法等，其中硫酸卡唑法、间羟基联苯法常用于测定酸性多糖。有一部分资料仅以葡萄糖为对照，直接用苯酚硫酸法测定多糖含量，实际测得的是总糖的含量，存在着方法专属性、准确性问题。由于目前多糖制品多为未经纯化的粗多糖制剂，其成分复杂，如含有蛋白质、生物碱、多糖的不同组分及其他水溶性成分，因此在测定时，应进行前处理，排除干扰。有文献报道[3]前处理时采用乙醇先进行醇沉提取多糖，排除小分子物质、单糖、寡糖的干扰，再进行除蛋白步骤，以纯化和排除蛋白的干扰，再进行测定。尤其对于复方制剂中多糖的含量测定更应增加前处理步骤，同时增加多糖对照品的薄层鉴别方法，规定在检查时不得检出单糖。 　　2.2 对照品的选择 苯酚-硫酸法测总糖含量是目前被广泛使用的一种经典方法，它适用于对单糖、寡糖以及均多糖的含量测定。但对于均多糖，可直接以其组成糖作标准曲线。对于由不同糖残基构成的杂多糖，情况则较为复杂， 实验发现， 因为不同单糖的标准曲线的斜率不同，对于杂多糖采用此法在不同的条件下，其测得的结果均有差异。因此对照品的选择在比色法测定多糖含量中就显得比较重要。 　　林颍等[4]采用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法分别测定了组成多糖的单糖的标准曲线及按单糖组成比例配置的标准溶液的标准曲线，分别进行计算，进行含量比较，结果认为，相同浓度的葡萄糖、果糖、半乳糖溶液所作出的标准曲线是不重合的，即同一样品用不同的标准溶液测定的含量值均不同。硫酸蒽酮法中标准曲线间的偏差小于苯酚硫酸法。由于是以某种单糖为标准，对杂多糖而言，测定值与真实值有差别，但对未知确切多糖比例的样品，可用主要组成单糖为标准，再用2种方法分别作样品组成单糖的标准曲线，根据其斜率偏差，选取小者作为测定方法，可得近似结果。对于均多糖2种方法测得的结果相近。对于杂多糖建议按其实际的单糖组成比例配制成标准溶液进行测定。 　　杨勇杰等[5]采用苯酚硫酸法测定了银耳杂多糖的含量。先采用气相色谱法对组成多糖的单糖的组成进行分析，主要为岩藻糖、木糖、甘露糖及葡萄糖。在测定时如果选用显色最强的葡萄糖作标准曲线，则测定结果偏低；如果选用显色最弱的岩藻糖作标准曲线，测定结果远超出实际值。采取GC结合校正因子也可以计算出总糖含量，但是这种方法烦琐，实验过程复杂。若样品较多则每测量一次都要把所有样品都经过衍生、气相测定，内标换算含量等步骤，不适合实际操作。本文实验尝试按照各单糖的组成百分比制作混合标准曲线， 为改良的苯酚硫酸法，该法只需要在方法确立的时候使用GC确定混合标准曲线中各标准单糖的比例，在以后的实验中就无须用GC了，这大大缩短了实验时间，而且也使结果比原来的苯酚硫酸法相对准确得多。同时还考察了样品水解前后测定结果的影响，结果表明，水解后样品测定结果高于未水解样品10多个百分点，原因可能是由于多糖中的糖残基以结合形式存在，和单糖有所不同，在浓硫酸的作用下不能百分之百形成糠醛，影响了测定结果。有人提出用多糖校正因子来修正，但这更适合于均多糖，比如葡萄糖聚糖，而对于杂多糖并不适用。
　　另外影响多糖含量测定的因素还有：苯酚、蒽酮的稳定性、显色剂的浓度、用量，硫酸的浓度、用量，反应温度、反应时间、不同对照品测定波长的选择等均应进行研究确定和严格控制，测定的结果才会准确。 　　综上，因为不同单糖的标准曲线的斜率不同，对于杂多糖采用此法在不同的条件下，其测得的结果均有差异。对于均多糖，可直接以其组成糖作标准曲线。但对于由不同糖残基构成的杂多糖，情况则较为复杂，建议在多糖的研究中尽量提纯，通过研究搞清组成多糖的单糖组成种类及比例，测定多糖含量时以组成比例配置对照品溶液，进行测定。但对于有多个多糖组成的粗多糖，情况比较复杂，尤其是复方制剂中多糖的分布情况更加复杂多样，有待进一步研究。现阶段尽量搞清其多糖组成，采用单一或混合单糖作对照品，进行测定。 　　2.3 酸性多糖和中性多糖在含量测定中的相互干扰 目前使用苯酚硫酸法测定样品中多糖的含量普遍存在以下问题：一是没有选用适当的标准而直接以葡萄糖或葡萄糖醛酸作标准进行测定；二是未分析样品情况，直接用490 nm作为测定波长。对于含糖醛酸的酸性多糖，以苯酚硫酸法进行多糖组分研究时，由于没有考虑糖醛酸的影响产生下列现象：一是直接以多糖的吸收值计算总糖含量，认为总含量减去糖醛酸含量后即为中性糖含量；二是直接以多糖的吸收值计算中性糖的含量，再加上糖醛酸的含量得出总糖含量。所得结果前者偏低，后者偏高，均不能反应真实值。 　　何进[6]等针对以上问题分别测定了7种糖：木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖（Glc）、半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）的最大吸收波长、最大吸收值，说明不同的单糖最大吸收波长不同。戊糖、6-脱氧己糖、糖醛酸显色反应的最大吸收波长在480 nm附近，而己糖显色反应的最大吸收波长在490 nm附近。因此测定应根据测定对象选择合适的最大吸收波长进行测定。通过测定糖醛酸的含量及对样品进行纯化，排除单糖及糖醛酸的干扰使结果可靠性增强。 　　天然植物中提取的多糖以酸性杂多糖的形式存在较多，通常对其中糖醛酸的测定方法多采用硫酸咔唑法和间羟基联苯法。实际工作中发现，采用以上2种方法测定酸性杂多糖中糖醛酸的含量时，中性多糖对测定结果有很大的干扰，使酸性杂多糖的组分分析结果无法解释。文献报道氨基磺酸可抑制中性糖的干扰。姜瑞之等[7]比较了不同剂量氨基磺酸对2种方法的抑制作用，结果说明中性糖的存在对测定结果的干扰是随酸性糖含量的降低而误差增大，氨基磺酸的加入对每种中性糖均有不同程度的抑制作用，咔唑法中氨基磺酸对中性糖的平均抑制率为77%，间羟基联苯法的抑制率为66%，均达不到完全抑制。氨基磺酸加入量对中性糖的抑制作用在一定范围内成正比，超出范围，呈恒定趋势，且2种方法对糖醛酸也有10%的抑制作用，所以对糖醛酸含量的酸性杂多糖加氨基磺酸测定糖醛酸是不合适的。本试验通过配置成低质量浓度，采用间羟基联苯法，可使样品中中性糖的干扰降至最低，所得结果更接近实际值。 　　郭欣等[8]对酸性多糖中的葡萄糖醛酸与中性多糖的含量进行了测定。将葡萄糖和葡萄糖醛酸配制成一系列混合糖，比较硫酸咔唑法和间羟基联苯法测定葡萄糖醛酸的准确性；分别建立葡萄糖和葡萄糖醛酸的标准曲线以扣除葡萄糖醛酸对中性糖的干扰。结果表明葡萄糖的存在对硫酸咔唑法测定葡萄糖醛酸有干扰，而用间羟基联苯法测定无干扰；另外葡萄糖醛酸的存在对硫酸蒽酮法测定中性糖有一定干扰。 　　另外，林颍等[9]用硫酸咔唑法测定天然多糖化合物中糖醛酸（葡萄糖醛酸GlcA、半乳糖醛酸GalA）的含量时，发现中性糖对测定结果有影响。用硫酸咔唑法测定了7种中性糖（木糖Xyl、 甘露糖Man、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、阿拉伯糖Ara、鼠李糖Rha、果糖Fru）的线性范围，并考察了7种中性糖对糖醛酸测定的影响，结果表明中性糖的存在对咔唑法测定糖醛酸的结果有干扰，并发现糖醛酸和各单糖在其各自的线性范围内取样，样品的吸收值与中性糖吸收值之差与不含中性糖的糖醛酸实际测定的吸收值基本一致。 　　总之，中性糖的测定方法一般采用苯酚硫酸法或硫酸-蒽酮法以葡萄糖或以组成多糖的单糖中含量较高的单糖为对照进行测定；而酸性多糖一般采用硫酸咔唑法或联苯硫酸法以葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸为对照进行测定。中性多糖和酸性多糖往往在多糖提取过程中一并提出，文献报道酸性多糖对中性多糖的含量测定有干扰，而中性多糖对酸性多糖的测定亦有干扰，在确定总多糖含量时，除应减去单糖或寡糖的含量外，还应考虑酸性多糖和中性多糖2种方法之间的相互干扰，并应考察干扰程度，分析是否可以忽略不计，以说明测定方法的可行性。 　　3 小结 　　在多糖的含量测定中应排除单糖及其他水溶性成分的影响，还应在测定时注意对照品的选择、测定波长的选择，关注中性糖和酸性糖测定的相互干扰，必要时可加入糖抑制剂排除干扰。 　　建议在多糖的研究中尽量提纯，通过研究搞清组成多糖的单糖组成种类及比例，测定多糖含量时以组成比例配置对照品溶液，进行测定。 　　苯酚-硫酸法测总糖含量是目前被广泛使用的一种经典方法，它适用于对单糖、寡糖以及均多糖的含量测定。对于均多糖，可直接以其组成糖作标准曲线。但对于由不同糖残基构成的杂多糖，情况则较为复杂，不同单糖的标准曲线的斜率不同，所以建议采用与杂多糖组成相同的混合单糖制作标准曲线。在选择对照品时建议通过研究搞清组成多糖的单糖种类及比例，按此比例配制成混合对照品制作标准曲线，进行测定。但对于有多个多糖组成的粗多糖，情况比较复杂，尤其是复方制剂中多糖的分布情况更加复杂多样，有待进一步研究。现阶段尽量搞清其多糖组成，采用单一或混合单糖作对照品，进行测定。 　　应对不同显色剂进行比较研究，确定测定方法。考查所用显色试剂的稳定、用量、显色时间、最大检测波长等因素，以增加方法的准确性。
　　随着科学技术及分析手段的进步、对照品的深入研究，使用HPLC和LPCE直接测定多糖含量亦将成为可能。 　　[参考文献] 　　[1] 孙玉书，毕力夫，苏秀兰.多糖及多糖类药物研究概况[J]. 内蒙古医学院学报， ）：75. 　　[2] 黄瑞松.中草药多糖含量测定方法概述[J]. 中国药师， ）：68. 　　[3] 李毅，赵淑芝，周淑芳，等.天年合剂总多糖的含量测定及薄层色谱鉴别[J]. 中国药业， ）：35. 　　[4] 林颍，吴毓敏，吴雯，等.天然产物中糖含量测定方法正确性研究[J].天然产物研究与开发， ）：5. 　　[5] 杨勇杰，姜瑞芝，陈英红，等.苯酚硫酸法测定杂多糖含量的研究[J]. 中成药， ）：706. 　　[6] 何进，梁运祥，阎淳泰.枸杞多糖中中性糖的含量测定[J]. 中草药， ）：84. 　　[7] 郭欣，高向东，杨小兵.酸性多糖中的葡萄糖醛酸与中性糖的含量测定[J]. 中国生化药物杂志， ）：100. 　　[8] 姜瑞之，陈英红，杨勇杰，等.银耳多糖中糖醛酸含量的测定[J]. 中草药 ，）：991. 　　[9] 林颍，黄琳娟，田庚元.一种改良的糖醛酸含量测定方法[J]. 中草药， ）：817. 　　Discussion on polysaccharide determination methods in new Chinese drug research 　　LI Ji-ping 　　（Drug Evaluation Centre， China Food and Drug Administration， Beijing 100038， China） 　　[Abstract]According to existing problems in polysaccharide determination methods in new Chinese drug applications， the method suitability， chemical reference selection， components interference and method research were introduced. The author suggests that suitable determination method should be selected according to the structure and property of the polysaccharide， and validated. Some influent factors should be examined to assure the accuracy of the method， such as the stability and using amount of the visualizing reagent， visualizing time， maximum detection wavelength etc. Monosaccharide and other water soluble components should be removed from polysaccharide sample， and suitable reference substance and detection wavelength should be selected. It should pay attention to mutual interference of neutral and acidic saccharide， and use inhibitor to eliminate the interference. Because the slopes of the standard curves are different for different monosaccharide， it is proposed that the types and ratios of the monosaccharide in heteroglycan should be understood， and mixed reference substance solution in the ratio is prepared for determination. 　　[Key words]new Chinese drug； polysaccharides； assay 　　doi：10.4268/cjcmm
转载请注明来源。原文地址：
【xzbu】郑重声明：本网站资源、信息来源于网络，完全免费共享，仅供学习和研究使用，版权和著作权归原作者所有，如有不愿意被转载的情况，请通知我们删除已转载的信息。
xzbu发布此信息目的在于传播更多信息，与本网站立场无关。xzbu不保证该信息（包括但不限于文字、数据及图表）准确性、真实性、完整性等。粗多糖测定方法的研究 - 药学 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
&& 查看话题
粗多糖测定方法的研究
粗多糖测定方法的研究
摘要:应用硫酸-苯酚比色法测食品中的粗多糖的含量而且分别用葡萄糖做标准品和用葡聚糖做标准品。结果表明前者测的结果稍偏高,大约高于4.8﹪。此方法简便快捷,准确度高,重现性好,可适用于各种粗多糖的测定。
关健词:枸杞多糖；灵芝多糖；分光光度法；
由十个以上单糖通过糖苷键连接而成的碳水化合物称为“多糖”。它一般都是天然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纤维两大类。活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和壳聚糖等。这些多糖具有复杂的、多方面的生理活性和功能，如：免疫调节功能；抗肿瘤作用；延缓衰老作用；降血脂、抗血栓作用等功能，因而越来越引起人们的关注。
多糖的测定方法目前还没有国家规定的方法,文献报道的方法基本上是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，在作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品，而不是用葡聚糖（MW500，000），因为葡聚糖标准品在国内难于获得且价格昂贵。但是根据国内外大量研究资料表明：香菇、金针菇、云芝、冬草、夏草、灵芝、茯苓、猪苓中所含的具有增强免疫、抑制肿瘤、镇静、强心、消炎等生理活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷键连接葡聚糖构成主链和支链，有的甚至就是β-葡聚糖，那么用葡萄糖作标准品和用葡聚糖作标准品去测食品中的多糖含量时是否有差别且差别为多少，本文以枸杞多糖和灵芝多糖来进行上述实验。
1.材料与方法
1.1供试材料
枸杞多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测)；
灵芝多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测)；
葡聚糖（MW500，000） sigma公司；
（1）铜储备液：
称取0.3gCuSO45H2O,3g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至100ml，混匀，备用。
（2）铜试剂溶液：
取铜储备液50ml，加水50ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。
（3）洗涤剂：
取水50ml,加入10ml铜试剂溶液，10ml氢氧化钠溶液，混匀。
（4）乙醇溶液(80﹪)：20ml水中加入无水乙醇80ml，混匀。
（5）氢氧化钠溶液(10﹪)：
称取lOg氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml，加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。
（6）硫酸溶液：
取10ml浓硫酸加入到80ml左右水中，混匀，冷却后稀释至100ml。
（7）苯酚溶液（5﹪）：
取苯酚100g，油浴蒸馏，收集180℃-182℃馏分。称取精制苯酚5.0g，加入溶解并稀释至100ml，混匀，溶液置冰箱中可保存一个月。
（8）葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液：
精密称取在1050C于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖标准品1.0080g，加水溶解，并定容至100ml，混匀，置冰箱中保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。
（9）葡萄糖/葡聚糖标准使用溶液：
吸取葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液2.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。
752C紫外分光光度计
旋转混匀器
1.4实验方法
1.4.1 葡萄糖标准曲线制备
精密吸取葡萄糖标准使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相当于葡萄糖0，0.064，0.128，0.2016mg）分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表1。
表1 葡萄糖标准与浓度的关系
__________________________________________________________________
标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882
___________________________________________________________________
以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线（图1）。
图1 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.7,相关系数r=0.9996。
1.4.2 葡聚糖标准曲线制备
精密吸取葡聚糖标准使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相当于葡聚糖0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mg）分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表2。
表2 葡聚糖标准与浓度的关系
______________________________________________________________________
标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
吸光度(A) 0 0.083 0.171 0.256 0.352 0.456
__________________________________________________________________
以葡聚糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。
图2 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.635X-0.0145,相关系数r=0.9983。
1.5样品的测定
1.5.1样品提取
称取混合均匀的含粗多糖样品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中,加水80ml左右,于沸水浴上加热2h,冷却至室温后补加水至刻度,混匀,过滤,滤液供沉淀多糖。
1.5.2沉淀粗多糖
精密取1.5.1项下滤液4.0ml(V2)(作四组平行实验)或液体样品(V2)4.0ml(即被测多糖就是液体而不是固体样品)置于50ml离心管中,加入无水乙醇16ml,混匀后,以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用乙醇溶液数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3-4次操作。接下来沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混匀后,供沉淀葡聚糖。
1.5.3沉淀葡聚糖
精密取1.5.2项溶液2ml(V4)置于20ml离心管中,加入NaOH溶液2.0ml,铜试剂溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷却后以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用洗涤剂数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3次操作后,沉淀用硫酸溶液2.0ml溶解并转移至50ml(V5)容量瓶中，加水稀薄至刻度，混匀。此溶液为样品测定液。
1.5.4 测定
精密取1.5.3项的样品测定液2.0ml(V6)置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混合器上混匀后,小心加入浓硫酸10.0ml后于旋转混合器上混匀后,置于水浴中煮沸10min,冷却至室温用分光光度计在490nm波长处,以试剂空白为参比,1cm比色皿测定吸光度值，同时做样品空白实验。从葡萄糖/葡聚糖标准曲线上查出葡萄糖/葡聚糖质量,再计算样品中粗多糖含量(见表3)。
表3.以葡萄糖计和以葡聚糖计来确定粗多糖含量
_________________________________________________________________________________
编号 吸光度 样品中枸杞多糖含量(mg/g) 样品中灵芝多糖含量(mg/g)
______________ ________________________ _____________________
枸杞多糖 灵芝多糖 以葡萄糖计 以葡聚糖计 以葡萄糖计 以葡聚糖计
1 0.150 0.146 0.453 0.431 0.423 0.403
2 0.145 0.148 0.440 0.417 0.429 0.408
3 0.139 0.142 0.423 0.402 0.413 0.394
4 0.150 0.151 0.453 0.431 0.437 0.416
___________________________________________________________________________________
2.计算公式
X=(W1-W2)×V1×W3×W5/M×V2×V4×V6
式中: X-----样品中粗多糖含量(以葡萄糖/葡聚糖计),mg/g
W1----样品测定液中葡萄糖/葡聚糖质量,mg
W2--- 样品空白液中葡萄糖/葡聚糖质量,mg
M----样品质量，g
V1----样品提取液总体积,ml
V2---沉淀粗多糖所用样品提取液体积,ml
V3----粗多糖溶液体积,ml
V4---沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积,ml
V5---样品测定液总体积,ml
V6---测定用样品测定溶液体积，ml
3.稳定性试验
样品显色后,每隔一定时间测定吸光度,结果见表4。
表4 吸光度稳定性试验
________________________________________________________________________________
时间 10min 20min 30min 1h 1.5h 2h
A 0.150 0.151 0.148 0.151 0.150 0.147
____________________________________________________________________________________
结果表明，该显色反应稳定。
4．回收率测定（采用加样回收法）
吸取多糖样品溶液0.5ml，分别加入标准葡萄糖溶液0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml，分别置于25ml试管中，各加水1ml,加入苯酚溶液2ml，缓缓加浓硫酸10ml于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。结果显示回收率是93.15-99.7﹪。
(1)由表3可知,用葡萄糖来做标准品和用葡聚糖做标准品测食品中的粗多糖含量时,前者测的结果稍偏高,大约高4.8﹪,但葡聚糖标准品的价格昂贵且在国内难于买到,故可以用葡萄糖来代替葡聚糖做标准品。
(2)食品中分子量>10000的高分子物质在80﹪乙醇溶液中沉淀，与水溶性单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性的从其它高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，粗多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定样品在粗多糖含量。
(3)此方法可很好的用于食品中粗多糖含量的测定，因为不需要对多糖进行纯化和脱色处理。
(4)洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其它糖分和碳水化合物用80％乙醇洗净，否则结果会受影响。
参考文献：
方积年，多糖的研究现状，药学学报，）：944-949
刘美琴，灵芝多糖的研究进展，微生物学通报，）：173
:mad::cool: 正好最近有灵芝多糖的检品,跟你的体会一样,用葡萄糖做标准品会使含量测定的结果变高
var cpro_id = 'u1216994';
欢迎监督和反馈：本帖内容由
提供，小木虫为个人免费站点，仅提供交流平台，不对该内容负责。欢迎协助我们监督管理，共同维护互联网健康，如果您对该内容有异议，请立即发邮件到
联系通知管理员，也可以通过QQ周知，我们的QQ号为：8835100
我们保证在1个工作日内给予处理和答复，谢谢您的监督。
小木虫，学术科研第一站，为中国学术科研研究提供免费动力
欢迎监督，发现不妥请立即
E-mail： & QQ：8835100