第七章电子显微镜的进展_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
文档贡献者
评价文档：
喜欢此文档的还喜欢
第七章电子显微镜的进展
把文档贴到Blog、BBS或个人站等：
普通尺寸(450*500pix)
较大尺寸(630*500pix)
大小：684.00KB
登录百度文库，专享文档复制特权，财富值每天免费拿！
你可能喜欢细胞生物学
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
实验二 细胞的超微结构—透射电镜下的细胞器
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口细胞超微结构
23:37:41&&&来源：[]&&&评论：&&
[细胞超微结构]一. 实验目的 . 1．通过观察电镜照片、幻灯片及录像片掌握各种细胞器超微结构及其功能，增强对理论知识的理解和掌握。2．了解电子显微镜的基本结构和工作原理。3．了解电镜超薄切片技术。二. 实验原理 按照电子显微镜的工作方式，可以将电子显微镜分为两类：透射电子显微镜和扫描电子显微镜。 （一）透射电子显微镜（transmission electr…… [本文关键词:细胞 切片 核仁 超微结构 电子显微镜]…
一. 实验目的
. 1．通过观察电镜照片、幻灯片及录像片掌握各种细胞器超微结构及其功能，增强对理论知识的理解和掌握。
2．了解电子显微镜的基本结构和工作原理。
3．了解电镜超薄切片技术。
二. 实验原理
按照电子显微镜的工作方式，可以将电子显微镜分为两类：透射电子显微镜和扫描电子显微镜。
（一）透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）
1．透射电子显微镜的结构
透射电镜的基本结构由电子光学系统（简称镜筒）、真空系统、供电系统三部分组成（图1）。电子光学系统由照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成。透射电镜的镜筒是由电子枪、6～8级电磁透镜（electron magnetic lenses）及一些光路元件组成的密闭圆筒，可以控制电子束的形状和发射强度，是透射电镜的核心。电子枪发射电子波作为“光源”，而电磁透镜则能控制电子的轨道，因为电子是带电的，所以电磁透镜能够改变电子束的方向。在透射电镜中有五个电磁透镜，根据每个磁场的功能并沿用光镜的称谓习惯，自上而下依次称为：第一和第二聚光镜、物镜、中间镜（2～3级）和投影镜。样品置于末级聚光镜和物镜之间。观察室和照相室在投影镜下方。透射电镜有庞大的供电系统和真空系统，其中真空系统是用两种类型的真空泵串联起来，从而获得电镜镜筒中的真空，当电镜启动时，第一级旋转式真空泵获得低真空的二级采用油扩散播泵而获得高真空。
图1 透射电子显微镜外形结构图
2．透射电子显微镜的基本工作原理
一般生物样品的透射电镜图像，可以用“质量－厚度”（mass-thickness，ρt）反差成像原理作简单描述。电镜的镜筒内建立强加速场，生物样品常采用60～100kV的加速电压。电子枪阴极发射出的电子在加速场中获得速度和能量，足以透射过50～70nm厚的生物样品并使之成像。聚光镜使来自电子枪的电子束聚焦，并常以散焦的状态泛光式地照射在样品上。此时，入射电子束与样品原子之间相互作用发生一种物理现象—电子散射（electron scattering）。在电子散射过程中，大部分电子直接透过样品，称为直接透射电子（transmission electron，TE）；有一部分电子在穿透样品过程中不仅改变运动方向，而且可能还损失能量，这些TE称为弹性或非弹性散射电子（elastically scattered electrons，inelastically scattered electrons）。样品结构的“质量—厚度”（ρt）越高，元素的原子序数越大，电子散射越强，TE中的直接透射电子越少，而弹性或非弹性散射电子越多。样品下方设计了一个30～80μm
的小孔称“反差光阑”（contrast aperture），拦截（吸收）掉散射强的电子，而使直接TE及
部分弱散射电子通过。这样，能通过光阑进入成像系统的TE就带有样品上的微细结构信息
了。相对ρt高的结构区域，电子散射强，能通过“反差光阑”进入成像系统的TE少，反
之，则多。这些TE经过几级成像透镜的放大，由末级投影镜投射到观察室荧光屏上，激发
荧光屏发出可见光。TE多，荧屏亮，TE少，荧屏暗。屏点的亮暗程度一一对应着样品微细
结构ρt的高低。这样，生物样品的透射电子显微图就形成了，其图像分辨率（resolution）
比透射电镜的分辨本领（resolving power）差一个数量级。事实上，透射电镜成像机制比上
述复杂得多，尤其对原子尺度的透射电子显微成像，则必须用波的传输理论解释，相关理论
和技术属于高分辨率电子显微学的范畴。
．透射电子显微镜样品的制备
透射电镜的样品制备有较高要求，这是因为，第一，电镜具有极高的分辨率，因此样品在制备、固定过程中，必须保持超微结构的完整；第二，由于电镜内部环境为高度真空，样品需要完全脱水；第三，样品需要制成足够薄的切片，确保电子束可以有效穿过。常规电镜样品厚度不超过250nm；第四，由于生物组成元素基本为C、H、O、N等较轻元素，对电子束散射效应微弱，因此产生的图像反差较小，通常需用重金属盐对样品进行染色来增加反差。
用于电镜观察的标本，一般为 500 埃左右的超薄切片。标本的制作过程也要经过固定、脱水、包理、超薄切片及电子染色等步骤，但包理剂常用环氧树脂，用超薄切片机切成薄
片，然后用醋酸铀及枸橼酸铅等进行染色，以增强细胞结构间的反差。
（二）扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）
1．扫描电子显微镜的结构
在结构上SEM与TEM有某些相似之处。SEM由电子光学系统（镜筒）、扫描系统、信号检测及显示系统、供电系统、真空系统五部分组成。其中，镜筒是由电子枪和几级电磁透镜和样品室组成的。在SEM镜筒中所有电磁透镜均位于样品上方，主要起聚焦电子束的作用，而且一直工作在聚焦状态（TEM一般工作在散焦状态），形成的电子束比TEM细三个数量级，可达3～10nm或更细，所以，有“探针”之称。
2．扫描电子显微镜的基本工作原理
扫描电子显微镜的分辨本领虽然不如透射电子显微镜，但却具有很强的立体感，可以在亚细胞水平上生动地显现生物样品的三维结构，适合于观察样品的表面形貌，在生物学上，通常用于观察研究组织和细胞表面的三维立体显微及亚显微结构。
SEM与TEM相同的是都采用电子束作光源，电磁场作透镜。所不同的主要是电子束、电子束照射样品的方式和被利用来成像的信号电子不同。SEM主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即是使用逐点成像的方法获得放大像。
3．扫描电子显微镜样品的制备
由于扫描电子显微镜仅能观察样品表面，因此样品无需制成薄片，对样品的大小也没有
严格要求。另外，扫描电镜样品的制备因材料和目的不同可有各种方法，其基本过程通常包括固定、脱水、干燥和包被金属膜等步骤。常用的包被法有喷镀法和离子束溅射法等，喷镀金属薄膜可增加次生电子，以产生鲜明的影像。
三．实验物品
电子显微镜，各种细胞超微结构电镜照片、幻灯片，电镜超薄切片技术录像带等。
四. 实验步骤
（一）电子显微镜的使用（演示内容）
1．透射电镜的使用
其基本程序如下：
1） 启动稳压电源，接通冷却循环水。
2） 启动真空泵，对镜体抽真空。真空度达到要求后，启动高压获得照明。
3） 抽出样品支架，放入载有样品的铜网，将支架送入样品室。
4） 调节第二聚光镜获得合适的亮度，利用样品移动螺杆选择观察范围，并调节中间镜电流控制放大倍数。
5） 先在低倍放大下观察标本，再换高倍放大观察，并对结果进行拍照记录。
6） 使用完毕，先关闭机器，再关闭冷却水和总电源。
2．扫描电镜的使用
其基本程序如下：
1）开启电子交流稳压器，电压指示应为220V。开启冷却循环水装置电源开关。
2）开启样品室真空开关和控制柜电源开关。
3）20min后，往样品室液氮冷井中加入液氮。
4）样品放入样品室，后将样品室进气阀控制开关关闭抽真空，并开启镜筒真空隔阀。
5）选择适当的加速电压、观察区域、放大倍数、工作距离、图像聚焦及对结果拍照记录。
6）关主机电源开关和真空开关。20min后，关冷循环水和电子交流稳压器开关，最后关闭总电源。
（二）电子显微镜超薄切片的制备
1．透射电镜超薄切片的制备
1）取材：颈椎脱臼法处死小鼠，迅速解剖并暴露肝脏。剪取一小块肝脏组织，放在预冷的培养皿中并滴加几滴预冷的戊二醛预固定。再用锋利的刀片将组织块切成0.5～1mm3的小块，立即转入盛有预冷戊二醛的小瓶中，在0～4℃固定约4h。
2）固定：用0.1 mol/L PBS漂洗样品3次，每次10min，再用1%的锇酸固定1～2h。
3）脱水与浸透：用滤纸吸干样品上的液体，用0.1 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min；将样品依次放入50%、60%、70%、80%、90%乙醇、90%乙醇与90%丙酮混合液（1:1）、100%丙酮中处理，每级脱水15～20min。后用100% Epon812浸泡过夜或1～2d，使包埋剂完全浸入组织。
4）包埋和聚合：在洁净的包埋模具中滴加一滴包埋剂，将样品小心放入模具中央，再向模具中缓慢注满包埋剂。将包埋好的样品放入烤箱中，经过连续加热，使包埋剂固化成为包埋块。包埋块性质稳定，可长期保存。
5）包埋块的修整：为获得形状和大小合适的包埋块，可以用刀片对其进行修整。先用刀片削去包埋块顶端的包埋介质，使样品块暴露出来，再沿样品四周斜切去四个面的树脂，成为一四面锥体，再用刀片除去尖端，切成梯形。
6）玻璃刀的制备：常见超薄切片刀有钻石刀和玻璃刀。玻璃刀造价低廉，制作简便，利用制刀机可以方便地获得，因而经常使用。制好的玻璃刀呈三角形，刀口平直锐利，为了使切取的切片漂浮在水面上便于收集，可以用胶带在玻璃刀上粘制一个水槽。
7）支持膜的制备：透射电镜的样品是放置在直径3mm的小金属网上的，通常还需要衬以支持膜，防止切片掉落或者卷曲。常用的支持膜有Formvar膜、火棉胶膜和炭膜等。
8）超薄切片：操作步骤包括：①上样：用样品夹固定样品块，再将样品夹安装到切片机的样品臂上；②上刀：将玻璃刀安装在切片机的刀台上，注意使刀刃、样品头和标尺处于同一水平面上；③在光镜下对刀：调节切片机的粗调和细调旋钮，并在切片机附带的实体镜中注意观察，使刀接近样品；④向玻璃刀上的小水槽中加入蒸馏水，使水面达到刀刃位置，并调节照明灯的光斑集中在水面上；⑤自动切片，从切片呈现的干涉颜色可以判断切片的厚度，一般金黄色和银白色的切片厚度较为理想，既有足够的分辨率，又有较好的反差；⑥捞片：用镊子夹住附有支持膜的铜网，轻轻接触切片，切片就会由于液体表面张力粘在铜网上。后放入铺有滤纸的培养皿中晾干。
9）染色：为增大生物样品的反差，常用重金属盐对样品进行染色。在蜡盘上滴一滴醋酸铀染液，将载有样品的铜网扣在染液中，样品向下，加盖防尘，室温下染色30min后，用蒸馏水冲洗铜网和切片。在蜡盘上滴一滴醋酸铅染液，再将样品扣在其中染色10min。取出铜网，用蒸馏水冲净后放入样品盒中自然晾干。
2．扫描电镜样品的制备与观察
1）取材：与透射电镜样品取材方法基本相同。在载玻片上滴加少许戊二醛，将植物叶
片立即放入其中，并用锋利的刀片将叶片切割成3～5mm2的小块。
2）清洗：用牙签将叶片块轻轻拨入放有0.1 mol/L PBS的小瓶中，单向摇动小瓶漂洗1h，
其间更换PBS 3～4次。
3）固定：4℃下，用戊二醛固定1～3h，或用锇酸固定30～60min，用PBS漂洗1h，换液3～
4）脱水：吸除PBS，依次用30%、50%、70%、80%、90%、无水乙醇逐级梯度脱水，视
样品大小，每级处理时间15～30min，处理中防止样品在空气中干燥。
5）置换乙醇：吸除乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇的混合液（1:1），浸泡10～20min，
再吸除混合液，注入纯醋酸异戊酯，浸泡10～20min。
6）干燥：将样品保持在潮湿状态放入临界点干燥仪的样品篮中，充入液体CO2，使液
面高于样品篮，关闭进液阀。缓慢放出CO2气体，只留少量液体浸没样品。重复上述充液排气过程三次，使样品中的醋酸异戊酯被液态CO2完全取代。向样品室内重新充入70%左右的液体CO2，并打开放气阀缓慢释放CO2气体。待样品室温度降至室温，压力降至零，即取出样品。
7）粘贴样品：用抛光膏将样品台擦拭干净，再用丙酮擦去抛光膏，晾干。用牙签在样品
台上涂少许导电胶，用镊子轻轻将样品贴牢在胶上，观察面向上，待胶干透。
8）喷镀：抬起真空喷镀仪的钟罩，将样品水平放置在样品座上。先用挡板遮住样品，避免热辐射对样品破坏。逐步增大电流，使金属丝在钨丝上熔化。观察到金属开始蒸发时，移开挡板，稍增大电流，让金属喷射到样品上。可以在样品旁边预先放置一块白瓷片，通过瓷片上喷镀的金属的颜色来估计喷镀金属的厚度，一般以淡茶色或茶色为宜，此时喷镀厚度约20～30nm。喷镀完成后10min再放气取出样品，以免炽热的金属膜被空气氧化。
（三）观看各种细胞超微结构的电镜照片和幻灯片
准备一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片和幻灯片，以供观察和学习。
1．细胞膜(cell membrane)：细胞膜在电镜照片上呈3 层结构，内外两层为电子密度较高
的致密层（深色），两层之间为电子密度较小的疏松层（浅色），这3层结构称为单位膜（unit membrane）。单位膜是生物膜的基本结构。
2．线粒体(mitochondria)：电镜下的线粒体由内、外两层膜围成，外膜平滑、内膜向内折叠，形成许多板状或管状的嵴。内、外膜之间的腔隙称膜间腔(外腔)，内膜围成的内部空腔称内腔，内腔里充满了基质，基质中可有电子致密度很高的基质颗粒(matrix granule)。在内膜的基质面有许多有柄小球体，称为基粒。
图2 线粒体的电镜照片(箭头)
3．内质网(endoplasmic reticulum, ER)：根据内质网膜表面是否附有核糖核蛋白体，可将内质网分为二类。
1）粗面内质网(rough endoplasmic reticulum, rER)，是以互相连通的扁囊为主的膜性管道系统，少数是些游离囊泡，切面上呈管状或泡状，膜表面附有颗粒状的核糖核蛋白体。
图3 粗面内质网的电镜照片
2）滑面内质网(smooth endoplasmic reticulum, sER)，形态为分支小管或小泡，有的彼此相连成网，膜表面无核糖核蛋白体附着。
图4 光面内质网的电镜照片
4．高尔基复合体(Golgi complex)：电镜下可见高尔基复合体由膜性的扁平囊、大囊泡和小囊泡组成。
1）扁平囊（saccule）：一般3-8个扁平囊泡重叠在一起，平行排列，略弯曲成弓形，有凸、凹两个面，凸面又称形成面（forming face），面向细胞核和内质网，凹面又称成熟面（mature face），靠近细胞膜，产生许多分泌泡。扁平囊内含中等电子密度物质。
图5 高尔基复合体扁平囊的电镜照片(箭头)
2）大囊泡（vacuole）：多分布于成熟面，内含高电子密度物质，又称浓缩泡。
3）小囊泡（vesicle）：常见于形成面，数量较多，内含低电子密度物质，因此较透明。
5．核糖体(ribosome)：又称核糖核蛋白体。是由rRNA和蛋白质组成的非膜性细胞器，直径为15-25nm的不规则颗粒状结构小体。多聚核糖体系在同一条mRNA分子上，按先后顺序依次结合许多核糖体。
图6 多聚核糖体的电镜照片箭头所示)
6．溶酶体(lysosome)：是由一层单位膜围成的囊泡状结构，内含多种酸性水解酶，根据溶酶体是否含有作用底物可分为两大类。
1）初级溶酶体(primary lysosome)：是从内质网或高尔基复合体分离出来刚成的溶酶体。其中含有多种水解酶，尚未进行消化作用，电镜下可见内容物电子密度均匀。
2）次级溶酶体(secondary lysosome)：是正在进行消化作用的溶酶体，电镜下可见内容物电子密度不均匀。
7．过氧化物酶体(peroxisome)：也称微体(microbody)，在电镜下是由一层单位膜围成的圆形或椭圆形细胞器，一般比溶酶体小，常见于肝细胞和肾小管细胞中粗面内质网的周围。过氧化物酶体基质内含中等电子密度的颗粒物质，有些动物肝细胞、肾细胞的过氧化物酶体中含电子密度较高、排列规则的结晶状结构，称类核体(nucleoid)。它是尿酸氧化酶的结晶，可作为电镜下识别的主要特征。
图7 大白鼠肝细胞中的过氧化物酶体(P)
中间是类晶体
8．微管(microtubule)、微丝(microfilament)和中间丝(intermediate filament)：
1）微管：主要成分是微管蛋白，呈中空的纤维状结构，其外径为20-25nm，分散存在于细胞质中，也可构成纤毛、鞭毛、中心体等细胞器。
2）微丝：实心纤维状结构，直径5-6nm，分散存在或交织成网状，或紧密排列成束。
3）中间丝：又称中间纤维，是介于微管和微丝之间的纤维状结构，直径10-20nm，主要存在于上皮、神经和肌细胞中。
图8 细胞骨架的电镜照片
9．中心粒(centriole)：是由微管构成的细胞器，普遍存在于动物细胞和低等植物细胞中，是成对出现的细胞器。它主要参与细胞的分裂活动，为细胞的运动和染色体移动、分离提供能量。电镜下见到的中心粒是成对且互相垂直的圆筒状小体。圆筒壁由9组三联体微管组成，各组三联体微管之间斜向排列，呈风车状。
10．细胞核(nucleus)：多数位于细胞的中央，按其结构和功能不同可分下列几部分。
1）核被膜：电镜下可见由二层单位膜构成，二层核膜之间的间隙称为核周间隙 (perinuclear space)。内膜平滑，外膜上有核糖体附着，其形态与粗面内质网相似。核被膜上有许多均匀分布的小孔，称为核孔(nuclear pore)，其周围有环状结构组成核孔复合体。
电镜下的细胞核膜（箭头示核孔）
2）染色质(chromatin)和染色体（chromosome）：电镜下的间期细胞核内，染色质呈纤维状结构，它经固定染色后呈现着色深浅不同的两种区域。电子密度较高的着色深的区域为异染色质（heterochromatin），分布在周围为主；电子密度较低的着色较浅的区域为常染色质(euchromatin)，以分布在核中央为主。
3）核仁（nucleolus）：间期细胞核内可有1至数个球形核仁，电镜下核仁具有较高的电子密度，无被膜，呈海绵状结构。核仁内部结构可分为4个组成部分。①纤维部分：为紧密排列的纤维丝构成核仁的海绵状网架；②颗粒部分：分散于网架之间，或围绕着纤维丝的致密颗粒；③核仁相随染色质：即核仁组成中心的染色质部分，包括核仁周围染色质和核仁内染色质，它们在间期以染色质的形式与核仁保持联系；④核基质：为无定形的蛋白质性液体，电子密度低，充满于上述各部分的间隙。
图10 核仁的电镜照片（箭头）
五. 实验结果与记录
1．通过电镜照片、幻灯片等观察到真核细胞各种细胞器的超微结构，了解到电
子显微镜的使用和超薄切片制备的全过程。
2．通过本实验学习，比较电子显微镜（EM）和光学显微镜（LM）工作原理的异同。
3．总结细胞的超微结构和功能，写出真核细胞各种细胞器的名称及其结构特征。
4. 练习绘制各超微结构的线条简图。
六. 注意事项
1．电子显微镜属大型贵重，使用学习时需在专业人员指导下进行。
2．因时间问题，本实验内容需参观分组进行。
更新日期[]
将本文分享到下面的网站：
相关热词搜索：
[细胞超微结构]延伸阅读：
频道总排行
频道本月排行显微镜的种类及结构_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
文档贡献者
评价文档：
喜欢此文档的还喜欢
显微镜的种类及结构
潘​春​梅​ ​张​晓​静​ ​主​编
把文档贴到Blog、BBS或个人站等：
普通尺寸(450*500pix)
较大尺寸(630*500pix)
大小：1008.00KB
登录百度文库，专享文档复制特权，财富值每天免费拿！
你可能喜欢