无毒苗是否在整个生命过程中都不会感染病毒_百度拇指医生
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?无毒苗是否在整个生命过程中都不会感染病毒
植物组织培养的应用中，脱毒及脱毒苗的再繁育。无病毒植株在其生命过程中是不是不会再感染病毒？
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果树苗木无毒苗的培育
果树苗木无毒苗的培育果树苗木病毒病多由嫁接传染，一旦病毒侵入树体后，在自然条件下永远保存在树体中，无法消除。根据果树苗木
果树苗木无毒苗的培育
果树苗木病毒病多由嫁接传染，一旦病毒侵入树体后，在自&然条件下永远保存在树体中，无法消除。根据果树苗木病毒病及&其类病毒病害的侵染、传播和发病特点，国内外总的防治策&略是使用无病毒或抗病毒繁殖材料，严格植物检疫，清除和&限制侵染源，防治和控制传毒虫媒。果树繁殖时，如果&母本树带有病毒，就必然把病毒传染给新繁殖的苗木。目&前，在的果树苗木中，有些品种已全部受病毒侵染，患有病&毒病。为了避免病毒病的危害，就必须清除病树中的病毒，&使之无病毒化，这是果树苗木病毒病防治对策的第一步。
获得无病毒母本树的方法主要有3种。第一种方法是从&果园中选择品种纯正、多年间树势健壮、品质产量都好的单&株，经病毒检验，确认无病毒后即可获得母本树；第二种方&法是人工培育无病毒母本树，包括通常采用热处理与茎尖培&养相结合和茎尖生长点培养2种方法；第三种方法是引进国&外无病毒品种。
果树苗木热处理脱毒，是生产上应用最早、最广泛的一种脱&毒手段。在果树苗木生产上，这种技术已经很成熟，已培育出许&多无病毒果树苗木单株。而茎尖组织培养需要精细的技术，与热&处理相比，难度大得多。但是对于用热处理不能或难于清除&的病毒，用茎尖培养或热处理同组织培养相结合的方法，则&可以获得无病毒的个体。此外，最近开发出的微体嫁接技&术，已应用于获得无病毒个体并引起了人们的广泛关注，其主要原理是在无菌条件下培养的砧木实生苗上，嫁接茎尖分&生组织，进而获得无病毒苗。
一、热处理脱毒
早在100多年前，苏格兰的工作者就开始利用热力&治疗植物病害。1923年，采用温汤处理而脱去甘蔗的一种&病毒，成为了在病毒病害中最早脱毒成功的例子。在果树苗木方&面，于1936〜1941年间，对桃丛生病、桃黄化病、伪桃病&等，先后用热处理，主要是温汤浸渍法获得脱毒成功。其中&对桃丛生病毒，不仅用温汤而且用高温空气处理也获得成&功。同时设计出一种处理装置，探索出了热空气处理法。即&把空气温度调节在30~40^0之间，处理一定时间，以达到&脱毒的目的。自1950年对马铃薯卷叶病毒用热处理脱毒取&得成功以来，到目前为止，除黄化型病毒以外，其他多种病&毒的脱毒也相继取得成功。常绿果树苗木病毒病用热处理法脱毒&并取得成功的实例主要有柑橘速衰病毒、柑橘裂皮类病毒、&柑橘脉突病毒、柑橘碎叶病毒等。
热处理方法有2种，一是温汤浸渍和高温蒸汽处理，另&一是高温空气处理。
(一）温汤浸溃和高温蒸汽处理
通常应用的有50〜551处理10~501!^、5^：处理1〜5}1&或35cC处理30〜40h等多种温时组合。特别是热不稳定的&病毒类，有些病例在40〜45^：处理5〜301丨11或30^：处理34&即可脱毒。即树体的一部分。由于温汤处理对植物体的损害&较大，有时会导致植物组织窒息或是呈水渍状，所以在对果&树进行热处理时，通常只处理接穗；而高温蒸汽处理，则对&-42&-&植物组织损害较少，因此，现在多用高温蒸汽处理。在进行&热处理时，最重要的是要严格控制温度和处理时间。
(二）高温空气处理
处理的植物体，通常多用盆栽被病毒侵染的整株苗木，&因为热处理所用的病株，其染病组织越小脱毒效果越高。但&刚移栽的苗木根系耐热性差，一般用移栽后3个月，最好用&盆栽1年左右的苗木进行处理。泥制花盆具有良好的耐热&性，热处理中根部温度将比热处理温度下降数度，因此推荐&用泥制花盆。所以柑橘、苹果的热处理，用无病毒的实生砧&芽接带毒的病穗，芽接1周后开始进行热处理，脱毒效果良&好。目前，热处理装置有多种，小的只有11^，大的人可以&进入内部操作，可供大量试材热处理用。为调节湿度，还应&安装加湿器。尽管高温空气处理不像温汤处理那样，要求病&毒钝化温度与植物体能忍受温度之间相吻合，但温度及有关&条件也必须力求精密。
热处理温度因病毒种类而异。有的病毒在33〜34尤条&件下即可脱毒，另一些病毒必须在39〜42的条件下，才&能脱毒。生产实践中，一般多用35〜381恒温，尤以381&恒温的实例较多。如苹果在37尤土1尤恒温下热处理28〜&30d,对褪绿叶斑病毒、茎痘病毒和茎沟病毒的平均脱毒率&为&26.&5%。
许多病例证明，变温热处理较恒温热处理的脱毒效果&好。近年来，为了减少高温对植物体的损伤，有些病例改为&白天用40〜45^：处理12〜16h,夜间30〜35^：处理8&~&12ho
生产实践中以白天如^处理^匕，夜间30(^处理8匕的实例&居多。但也不能一概而论。如柑橘速衰病毒幼苗黄化株系，&在381恒温条件下处理8周不能脱毒，必须处理12周才能&脱毒；反之，在白天40，夜间30(^的变温条件下，处理&8周即能脱毒。柑橘碎叶病毒，38^处理16周不能脱毒，&但白天401、夜间301处理6周和白天441、夜间301处&理2周却脱毒成功。
在进行热处理脱毒时，还应控制好相对湿度和光照。通&常相对湿度应保持在70^〜80*之间。在过分干燥的条件&下，热处理的新梢生长不良。光以自然光最好，但秋冬期&间，适当补充人工光照，对新梢伸长有良好作用。而有的病&例用荧光灯和白色灯照明161即可脱毒。
为了提高植物的耐热性，延长植物在热处理中的生存时&间，热处理前往往要进行预处理。例如，在用38^：热处理&前，先在27〜351下处理1〜2周。在植物耐热性允许的范&围内，热处理的温度越高脱毒效果越好，因此，前处理的温&度也以逐渐由低到高为好。
植物体的耐热性与植物体各部分组织中的碳水化合物的&含量成正相关，因此，应在植物组织成熟的季节进行&热处理。
用热处理脱毒法培育无病毒个体时，通常是剪取苗木在&热处理中伸长出的新梢顶端嫩枝，将其嫁接到无病毒实生砧&木上。若是用新梢停止生长的苗进行热处理时，可剪取已硬&化的枝条，直接嫁接到砧木上。对于葡萄，剪取热处理中伸&长新梢或副梢的顶端部分，长约1〜5。1，扦插在珍珠岩等&适宜的保湿扦插床中，不久即发根，一个月后即可移植。如&果用此法不能获得无病毒个体时，就必须剪取新梢顶端更短的部分。
二、茎尖培养脱毒
病毒侵入植物体后，一般具有系统侵染性，也即具有全&身扩展的特性，但不同的组织和部位，病毒的分布和浓度有&很大差异，甚至有的组织或部位尚无病毒。植物感染病毒后&不含有病毒的部位，对病毒的防治具有重要的意义。例如，&大多数植物的种子不带病毒，因此可以自然获得无病毒后&代。除种子之外生长点附近，即茎尖和根尖的分生组织也多&不含有病毒。但不含有病毒的部分是极小的，不超过0.&1〜
0.5mn^这样小的无病毒组织，以往无法繁殖利用。自组织&培养技术发展以来，可以切取这种微小的无病毒组织，用组&织培养技术也可培养成完整的植株。如1934年White用感&染烟草花叶病毒的番茄根和1949年Limasset等用感染烟草&花叶病毒的烟草茎分别进行的研究结果表明，病毒浓度呈梯&度变化，病毒粒子随着植物组织的成熟而增加，顶端组织不&带病毒。Morel等于1952年从感染花叶病毒和斑萎病毒的植&株上，切取茎尖组织进行培养，成功地获得无病毒的大丽&花。目前，茎尖培养在草本植物上应用较多，而在木本植物&上应用甚少。这项技术在番木瓜、草莓、柑橘和葡萄的脱毒&方面，已获成功并取得初步应用效果。
茎尖培养脱毒程序，一般有以下6个步骤：第一步，材&料处理和接种；第二步，诱导芽分化和小植株的增殖；第三&步，诱导生根；第四步，生根植株的移栽；第五步，移入苗&:第六步，病毒检测。其中分化、增殖、生根3个步骤，
均需要特殊的培养基。在果树苗木茎尖培养中最常使用的是河-
培养基，但各步骤中所需要的植物生长调节剂种类、用量及&配合比例各不相同，并依培养的果树苗木种类而异。脱毒成功机&率与茎尖大小直接相关。对不同的植物，采用大小相同的茎&尖进行培养，脱毒效果主要取决于病毒类型而不是植物种&类。正常茎尖培养时切取的茎尖越小，脱毒率就越高。草莓&切取茎尖为0.2〜0.311^时，脱毒率为100*;切取茎尖为&1.011^时，脱毒率仅为50*。但茎尖过小培养成活率低，&而且操作难度也大。因此，脱毒时要兼顾脱毒率和成活率，&茎尖切取的大小要适中，一般切取长度为0.2~0.50^，带&有1〜2个叶原基的茎尖作为培养材料。苹果切取0.&1〜
0.211^茎尖培养，脱毒株率为35.0^。其中，苹果褪绿叶&斑病毒的脱毒株率为80.0^，苹果茎痘病毒的为65.0^,&苹果茎沟病毒的为50.0^。在未脱除的病毒中，苹果褪绿&叶斑病毒占19.19^，苹果茎痘病毒占33.3*，苹果茎沟病&毒占47.&%。
(二）茎尖培养脱毒机制
应用电子显微镜和荧光抗体技术可以明显地看出，在每&一个&植物-病毒&组合中，都存在一*个特殊的顶端免疫&区。这个顶端免疫区决定了无毒茎尖的大小^如果仅最顶端&一个细胞不带病毒，则无毒签尖大小为0.1〜0.3^^;如果&免疫区比较大，则无毒莲尖大小为0.5〜3111^然而，即使&在分生组织细胞中有病毒粒子，培育无病毒苗也是可能的。&对此已提出多种解释，如：正常的或病毒的核蛋白合成之间&的营养竞争、酚胺抑制剂的存在和因切取茎尖时细胞受伤而&引起的代谢破坏。虽然这些假设中没有一种令人十分信服的&解释，然而，这些假设却很好地说明了较小的茎尖对于脱毒是最重要的。
茎尖培养获得的小幼株，可离体培养得到分生单系。要&尽可能快地对每一个分生单系的2株或3株小幼株进行鉴&定，确定是否还带病毒。在确定分生单系是否不带病毒之&前，需多次重复这些实验。在有条件的单位，可用酶联免疫&吸附检测法代替指示植物进行这种鉴定。由此而获得的无病&毒分生单系，通过腋生分枝快速繁殖，可在短期内给生产单&位提供无病毒试管苗。
通常情况下，无病毒苗是保存在黑暗、低温的条件下，&在此条件下，无病毒苗可在试管中保存很长时间。如木本果&树的试验结果是，切除在繁殖培养基上伸长生长茎的所有叶&片，再把茎浸渍在基本培养基中，然后把试管放在冰箱中，&结果5年后，这些枝条在新鲜培养基上仍能增殖。
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植物种苗脱毒技术
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专利名称同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物的制作方法
技术领域本发明涉及一种同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。
背景技术樱桃是经济价值很高的果品之一，但是容易受病毒的为害。至今已发现68种侵染楼桃的病毒，其中苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)和李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)危害较为严重。近年来，由于不断从国外大量引进樱桃种子和苗木新品系以及国内不同地区苗木和种子的频繁调运，加快了病毒的传播。李春敏等(1997)利用PAS-ELISA检测出昌黎地区甜樱桃ACLSV的感染率为47. 1%。牛建新等(2003)用RT-PCR检测出了库尔勒香梨上的ACLSV。李青等(1996)利用ELISA法对北京地区的桃、樱桃携带PNRSV的情况进行了检测；阮小凤等()对陕西省甜樱桃、桃上的病毒病的发生情况进行了 ELISA检测，发现在这两种果树上，PNRSV、PDV,ACLSV的发生率较高，之后用改良RT-PCR对樱桃PDV和PNRSV进行了检测。侯义龙等()应用RT-PCR检测桃和樱桃及起组培苗上的PNRSV，调查大连市甜樱桃品种‘红灯’的田间植株时发现被检植株PNRSV的感染率达100%。
本发明的目的是提供一种辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。本发明所提供的用于 检测植物病毒的引物，为引物对甲和引物对乙；所述引物对甲为检测苹果褪绿叶斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.1所示，另一条引物序列如SEQ ID No. 2所示；所述引物对乙为检测李属坏死环斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No. 3所示，另一条引物序列如SEQ IDNo. 4所示。所述植物病毒可为所述苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒。本发明所提供的辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测樱桃的叶片的反转录cDNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为同时感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为632bp的条带，则待测樱桃候选为感染苹果褪绿叶斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为455bp的条带，则待测樱桃候选为感染李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物中无大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为没有感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒。上述方法中，所述用引物对进行PCR扩增的方法为先用引物对甲进行PCR扩增，10个循环后，再加入引物对乙继续进行PCR扩增，直至扩增结束。上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中每条引物的浓度为O. 5μΜ ;所述PCR扩增的退火温度为57°C。含有上述引物的用于检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒中的应用也属于本发明的保护范围。本发明中所建立的多重RT-PCR可以同时检测出生产中樱桃ACLSV和PNRSV病毒复合侵染现象，比单一 RT-PCR节省时间；操作上也更为简单；此外，也减少了试验中所消耗的药品，更为经济。当反转录体系中的带病植株的总RNA量为10_4yg时，经过PCR扩增后，仍可以同时检测到两种病毒。
图1为CTAB法提取樱桃叶片RNA电泳。1-4
‘红灯’、考特、Chelan、F8。图2为ACLSV、PNRSV病毒引物AF1/AR1和PF/PR ‘红灯’叶片的PCR预扩增。A ACLSV ；B PNRSV ；M D2000DNA 分子标准量。图3为ACLSV、PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在不同退火温度下PCR扩增‘红灯’樱桃叶片电泳。A =ACLSV ；B =PNRSV0 M:2000bp DNA分子标准量;1-6分别为45°C、48°C、51°C、55°C、57°C和 60°C ;A:引物 AF2/AR2 ;B:引物 PF/PR。图4为ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在复合侵染的‘红灯’叶片的多重PCR预扩增电泳。M:D2000DNA分子标准量；1 :只加入AF2/AR2 ；2 :只加入PF/PR ；3 :同时加入 AF2/AR2 和 PF/PR。图5为ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在复合侵染的‘红灯’叶片的多重 PCR 扩增电泳。M:D2000DNA 分子标准量；1 =ACLSV ;2，3 ACLSV+PNRSV ；4 =PNRSV ；5 :健康叶片；6 :空白对照。图6为ACLSV和PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在复合侵染‘红灯’叶片的多重RT-PCR灵敏度检测。M :D2000DNA分子标准量；1-7 :以RNA总量分别为10'10'10'10'10_5、10_6、10_7μ g反转录后进行PCR反应；8 :健康叶片；9 :空白对照。图7为引进的无毒苗ACLSV和PNRSV病毒mRT-PCR检测电泳图。M D2000marker ；1-8
Chelan λ Cristalina、Skeana、Sonata、Black republican、Sonet、Selah Λ BlackYork + :阳性对照。 图8为147份樱桃资源ACLSV和PNRSV病毒mRT-PCR检测电泳图。1-147品种(种)名见表3-1 ；M
D2000marker ； + :阳性对照；—:健康植物。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本申请说明书中ACLSV均指苹果褪绿叶斑病毒，PNRSV均指李属坏死环斑病毒。材料采自北京市农林科学院林业果树研究所樱桃资源圃的147份待检测樱桃资源叶片，具有ACLSV和PNRSV病毒感病特征的樱桃‘红灯’叶片作为阳性对照。感病的‘红灯’叶片症状为叶片细长，叶面不平展；主叶脉皱缩；叶片褪绿，甚至叶片全为黄色，部分有穿孔。检测方法( I)樱桃叶片总RNA的提取CTAB 裂解液10mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)25mM EDTA (ρΗ8· O), 2. OmM NaCl，O. 5g/L 亚精胺(spermide),1-巯基乙醇(用前加)；I)、叶片材料lg，加入少许PVP-40，液氮研磨充分后，迅速加入预热好CTAB裂解液，涡旋振荡30-60s，65°C水浴lOmin，期间振荡摇匀1_2次；2)、迅速置冰上，冰浴3min，加入等体积积氯仿/异戊醇(体积比24:1)，振荡摇匀，冰浴 lOmin,4°C 13000rpm 离心 IOmin ； 3)、重复步骤2 —次；4)、取上清液，加入I / 4体积的IOMLiCl混匀，(TC沉淀4h ；5)、4°C 13000rpm离心20min,弃上清，加入O. 5ml0. 5M SDS溶解沉淀，加入等体积氯仿/异戍醇(体积比24:1)抽提一次,冰浴5min ；6)、4°C 13000rpm离心lOmin，取上清，加入2. 5倍体积无水乙醇，_80°C沉淀30min ；7)、4°C 13000r pm 离心 20min,弃上清；8)、用75%的乙醇沉淀洗漆，4°C 5000rpm离心3重复一次；9)、瞬时离心30s，吸出残余的酒精，常温凉干沉淀3用适量无RNase水溶解沉淀，-80°C保存。(2)引物的设计
引物名称i 列5· -3'·度Usp)大小(bp)
1.一种用于检测植物病毒的引物，为引物对甲和引物对乙；
所述引物对甲为检测苹果褪绿叶斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.1所示，另一条引物序列如SEQ ID No. 2所示；
所述引物对乙为检测李属坏死环斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No. 3所示，另一条引物序列如SEQ ID No. 4所示。
2.一种辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测樱桃的叶片的反转录cDNA为模板，用权利要求1中所述引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为同时感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为632bp的条带，则待测樱桃候选为感染苹果褪绿叶斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为455bp的条带，则待测樱桃候选为感染李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物中无大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为没有感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述用权利要求1中所述引物对进行PCR扩增的方法为先用所述引物对甲进行PCR扩增，10个循环后，再加入所述引物对乙继续进行PCR扩增，直至扩增结束。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系中每条引物的浓度为0. 5 μ M ;所述PCR扩增的退火温度为57°C。
5.含有权利要求1所述引物的用于检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒的试剂或试剂盒。
6.权利要求1所述引物或权利要求5所述的试剂或试剂盒在检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒中的应用。
本发明公开了一种同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。该用于检测植物病毒的引物，为引物对甲和引物对乙；所述引物对甲为检测苹果褪绿叶斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.1所示，另一条引物序列如SEQ ID No.2所示；所述引物对乙为检测李属坏死环斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.3所示，另一条引物序列如SEQ ID No.4所示。本发明中所建立的多重RT-PCR可以同时检测出生产中樱桃ACLSV和PNRSV病毒复合侵染现象，比单一RT-PCR节省时间；操作上也更为简单；此外，也减少了试验中所消耗的药品，更为经济。当反转录体系中的带病植株的总RNA量为10-4μg时，经过PCR扩增后，仍可以同时检测到两种病毒。
文档编号C12Q1/70GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者李天忠, 马国玲, 张开春 申请人:中国农业大学