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方剂配伍规律研究成果
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&&&&&& 方剂配伍规律研究开拓了以中药有效组分组方研制现代中药的模式和设计方法，搭建了有效组分提取分离和活性筛选技术平台，建立了组分配伍优化设计及评价方法，诠释了中药配伍和作用模式的现代科学内涵。组建了天津市组分中药技术工程中心，建立了中药组分库。向有关部门提出名优中成药二次开发战略，承担科技部和天津市30个中药大品种二次开发研究，应用先进技术解决制约中药品种做大做强的共性技术问题，取得突出进展。
&&&&&& 报告全文由如下七个部分构成：一、项目概况；二、项目假说及解决的关键科学问题；三、项目研究目标、研究内容、研究思路及技术路线；四、项目主要成果；五、项目成果的创新点与先进性；六、项目实施效果；七、项目管理经验。本文主要介绍的是报告的第四部分项目主要成果。若想下载报告全文，请注册后下载。
&&&&& （一）组分药性理论创新研究
本项目在继承中医药传统理论的基础上，充分利用数据挖掘的方法和技术，将中药饮片药性、功效、药理信息的内在关系及饮片配伍的组方原则，用现代语言表达，建立组分药性、组分功效的预测方法，探讨中药组分药性与饮片药性的关系，研究中药组分的药性表征方式，预测组分药性及活性；揭示组分配伍与饮片配伍的内在联系，探索构建组分配伍理论的方法学基础。
1．药性与功效相关性研究
通过对《中华人民共和国药典》2000年版一部（以下简称《药典》）所收载中药的功效术语进行采集，并对相似功效术语进行归类和统计，力求详细、全面地了解中药功效术语表述的客观事实。在此基础上，对中药功效术语进行基本的归纳、分析，根据其内涵对中药功效术语进行合并、拆分、归类，得出中药功效术语词汇的数据库词表。以所拟定的功效数据库词表和药性为字段，构建中药药性与功效数据库。利用决策树的方法建立了四气、五味、归经与功效的关系模型。四气预测模型分类正确率为60.7%，修正分类正确率为72.8%。《中华本草》所载8980味中药中，缺失性味描述的约7%，缺失归经描述的约75%。此研究有利于对缺失的药性进行完善和补遗，有助于发展和完善中医药性理论。
2．基于药理的中药药性预测
中药药性与药理作用皆是以机体为研究对象，表达药物与机体间的相互作用与作用规律的科学数据，二者之间存在一定的关系。本研究在收集、整理大量中药药理研究文献的基础上，运用贝叶斯网络学习算法构建了药性与药理作用的相关关系模型，包括寒性、凉性、温性等10种药性模型，这些模型能较好地反映药性与药理指标间的关系。例如对寒性模型的分析结果表明：抗菌与抗真菌同属抗病原微生物，二者呈正向相关性；催眠与解热同属抑制中枢神经，二者呈正向相关性；血凝血瘀则血液循环不畅，可能导致缺氧，因此抗凝血与抗缺氧呈正向相关性；血瘀，缺氧可能导致疲劳，因此抗凝血与抗疲劳，抗缺氧与抗疲劳呈正向相关性；抗疲劳与益智呈正向相关性。结果显示，贝叶斯网络拓扑图反映的知识与中医理论基本一致。
3．基于药理的中药功效预测
利用已建立的相关性模型，对活血化瘀药中药主要组分的药理作用与功效进行了数据挖掘研究，分别计算出了黄芩苷、苦参碱、姜黄素、甲基莲心碱、芍药苷等活血化瘀中药有效成分的活血化瘀功效进行了预测，结果表明其具有活血化瘀功效的概率较大，与药理研究相符合，证明了该方法的准确性。组分功效预测对确定组分的中医药属性具有重大意义，这对于继承和体现传统中医药理论，更好地阐释组分配伍的中医理论依据，进而在组分层面上进行组方设计和配伍优化具有指导意义。
4．中药有效组分的药性预测与评价
本研究利用所建的四性、五味贝叶斯网络分类模型，对部分中药有效组分的性味进行了预测。结果证明，贝叶斯网络学习算法可用于预测中药有效组分的药性。预测结果在一定程度上体现了组分药性与饮片药性之间的关系。饮片的性气是对组分性气的复杂加和，组分性气与饮片性气之间既有继承性又有涌现性。中药药性是其所含化学物质协同作用的集中体现，是由其所含化学物质决定的。中药化学成分具有分子多样性的特点，这决定了中药药性本质上的多样性。一味中药的药性，是对其所含有效组分药性的复杂叠加，组分药性与饮片药性相比，既有继承性又有涌现性。&
&(二)中药有效组分的发现与制备
本项目建立了植化分离鉴定与活性筛选相结合、分析与活性评价相结合、生产工艺与药效相结合等一系列中药有效组分发现与制备方法，主要研究内容包括：在综合应用多种现代分离技术的基础上，进行有机集成，形成完善的中药标准组分系统分离制备技术，并制定一系列的标准规范，达到提取和分离制备过程的标准可控，实现了中药组分的批量获取；建立了一系列中药有效组分发现方法，从多个方剂中筛选发现了有效组分；发展了多种中药分析策略和联用技术，可全景、高通量得获取中药成分的多维化学表征；强化数字化技术渗透，建立了中药组分数据库的软硬件系统，通过数字化信息管理系统管理、挖掘、整合、共享来源、类型复杂的组分信息，实现了药材－部位－组分－化合物关联信息的智能检索，建立并完善了规模化的中药标准组分库。
1．中药组分制备技术
借鉴先进的天然产物化学成分库构建、分析和管理方法，发展了经济、高效、系统的中药标准组分制备技术。原则上，中药标准组分的制备主要考虑以下因素：1）保证活性物质的含量足以显示活性；2）尽量减少毒性成分和其他杂质对后续筛选的干扰；3）尽量减少不同组分中相同成分的重叠，以避免重复筛选；4）基本保证通过2轮筛选即能确定活性物质；5）满足经济性要求，一次制备即能满足多次筛选的要求；6）具有不同药材及方剂均具有较强的适用性。根据上述研究思路，本项目采用制备液相、二维液相色谱等现代仪器设备建立了适用于大规模筛选的中药组分高效制备新方法，实现了中药组分的标准化、可重复制备。
2．中药有效组分发现方法
中药有效组分发现方法示意图
本项目提出了一系列中药有效组分发现方法，主要分为三类：①基于活性评价的有效组分筛选技术；②基于计算机模拟的有效组分预测评价技术；③实验与计算辨析相结合的有效组分发现技术，如下图所示。运用上述方法成功筛选出复方丹参方、茵陈蒿汤、双丹方、参麦方等多个方剂的有效组分，形成了一套高效、准确的有效组分发现技术体系，为大规模开展中药有效组分筛选提供了技术支持。
(1)基于活性评价的有效组分筛选技术
构建了从分子、细胞、器官到整体动物多个层面的中药组分筛选与活性评价技术体系，包括缺氧/复氧损伤内皮细胞模型、平滑肌细胞增殖模型、小胶质细胞炎性评价模型、肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分泌模型、雌激素受体模型、血脑屏障体外模型等细胞模型以及基于化学发光的抗氧化活性组分高通量筛选平台等。在此基础上，开展了黄芪、香加皮、杜仲、补骨脂、黄连、续断、丹参、三七、人参、枳壳等药材及复方丹参方、茵陈蒿汤、双丹方等方剂的组效关系研究，发现了降脂、抗心肌缺血、肝脏保护剂、神经保护剂、雌激素受体调节剂等有效组分和有效成分50余个。
(2)基于计算机模拟的有效组分预测评价技术
基于计算机模拟的中药有效组分预测评价是通过分析药物与生物大分子发生相互作用的关键位点，通过利用三维药效团、活性位点分析等技术，模拟靶点或活性化合物的作用特征，并以此为中药有效成分族群辨识模型，利用三维药效团、分子对接、反向对接、三维数据库搜索等技术，对中药或方剂化学成分数据库所含中药有效成分进行辨识，以发现作用于同一靶点、具有相同受体活性的中药有效成分。此技术主要包括基于三维药效团和基于分子对接两种技术，前者是针对中药有效成分活性结构特征进行辨识模型的构建，后者是通过分析受体活性位点结构特征而进行辨识模型的构建。本项目运用数据挖掘、分子模拟的方法和技术，基于化学药物的分子描述符和三维结构特征，搭建了较为成熟的药效团模型构建技术平台，系统、全面地建立目前所有已证实靶点的识别模型，共计100余个组分活性预测模型，并预测了9000余个中药成分的活性，从而实现了在中药的活性数据及作用机理研究不清楚的情况下，基于化学结构就可以推测出可能的靶点，从而为中药组分配伍奠定基础。
小分子化学药物研发过程中，计算机辅助类药性评价技术已成为新药研发的重要内容。对候选化合物进行类药性评价有利于降低药物开发的风险，提高活性筛选的效能。化学药物常用的类药性判断原则是Lipinski提出的类药性规则，其要点是：候选化合物分子量& 500，计算得到的辛烷/水分配系数(ClogP)&5，氢键供体基团(OH和 NH)数目& 5，氢键受体基团(N和O)&10。项目组采用ClogP计算软件（Daylight Information Systems, ）对方剂组分的类药属性进行了评价。发现方剂有效组分中约70％的化合物符合Lipinski规则，其分子量分布在100～500之间。
(3)实验与计算辨析相结合的有效组分发现技术
本项目将中药分离分析、药效评价实验与因果关系发现技术相结合，通过对中药化学组成与活性评价数据相关性分析，进一步发展了中药有效组分智能辨识方法。其研究思路是选择一批化学组成相近但各组分含量不同的样本，根据每个样本中组分含量数据及药效活性评价数据，找出对全方药效活性有较大贡献的有效组分。从计算角度上看，该方法的基本假设是中药化学物质体系中有效组分含量与药效活性在一定范围内存在线性关系，而无效组分含量与药效活性无关，则可用线性回归方程建立简单的计算模型。再运用逐步回归、因果关系发现、Markov Blanket发现等算法辨识中药有效组分，即在考虑混合物中其他组分对药效活性的影响下，判断某个组分与药效活性是否直接相关。通过这种方法，能够针对不同的药效活性指标计算发现有效组分，将有可能在不进行化学分离的情况下辨识出中药有效组分。本项目已运用这种方法从双丹方中找出具有心肌保护作用的活性组分。验证试验表明，辨析出的活性组分确实具有较好的活性。与常规的活性跟踪筛选方法相比，这种方法能减少分离和筛选的实验工作量，为从方剂中筛选发现有效组分提供了一条新的研究思路。
此外，本项目提出了“组分剔除法”用于中药有效组分筛选。“组分剔除法”可通过设计各组分的有序配伍，采用方差分析等方法判定缺失某一组分对全方药效的影响，逐步淘汰与原方药效不相关或相关性较低的组分，最终筛选得到能代表原方药效的有效组分配伍。组分剔除法充分考虑了方剂组分配伍的有效性，保证了筛选得到的组分配伍仍具有较强的药效。运用该方法研究研究参麦方不同组分配伍对环磷酰胺（CTX）化疗S180荷瘤小鼠的增效作用，从中发现人参二醇是参麦方对CTX化疗S180荷瘤小鼠起增效作用的有效组分。
3．中药有效组分鉴定方法
(1)方剂化学组成的快速鉴定技术
研究建立了基于超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）、液相色谱－质谱联用（LC-MS）等技术的方剂化学组成快速鉴定方法。这类方法充分利用了质谱分析数据，能快速推断方剂中主要化合物结构，实现了方剂化学信息的快速获取，具有分析速度快、灵敏度高、分辨率高等特点，适用于方剂复杂化学物质体系的全面分析。
本项目运用该方法对茵陈蒿汤的体内及体外成分进行定性分析，共鉴定出该方香豆素、黄酮、色原酮、有机酸等33个化合物的结构，并发现了21个血中移行成分。在明晰茵陈蒿汤体外化学信息的基础上，通过体内外化学成分比较分析，初步确定茵陈蒿汤入血成分的来源、性质和种类，以为后续茵陈蒿汤体内直接作用物质的确定和药效相关性研究提供基本信息数据。此外，运用该技术对温脾汤化学成分开展研究，在17分钟内分离鉴定出该方4味药材中的64种成分，而采用传统的HPLC系统进行分析这一复杂样本，要获得和UPLC类似的分离效果则需要60min左右。
(2)方剂成分的系统分析方法
液相色谱－质谱联用技术适合快速分析鉴定中药方剂化学成分。但是，对于方剂组分库分析的要求来说，一维液相色谱分离还不能提供足够的分辨率。本项目采用正相制备液相色谱作为第一维分离的手段，第二维仍采液相色谱－质谱联用进行分离分析。除了获得成分化学信息外，液相色谱－质谱联用对中压制备洗脱物的分析还可用于评价分离的效果，避免相邻洗脱物所含物质重叠过多。在研究过程中，半制备高效液相色谱所采用的色谱条件与液相色谱－质谱联用S分析条件基本一致，这样做的好处是减少了分析方法开发的时间，而且有利于保障方剂组分库与成分分析结果的对应性。为了最大限度地获得准确的谱峰化学信息，满足检测各类化合物的需要，液相色谱－质谱联用分析采用了100min的缓慢线性梯度洗脱程序，而且每份样品在正离子模式和负离子模式下分别做一次分析，这也有利于提高方法检测各类化合物的通用性。实验表明，二维色谱方法提供了非常理想的分离效果。采用该方法对精制血府逐瘀汤中压制备得到的6个组分进行分析，检出的谱峰达到176个（质谱检测器能检出并能够判断分子量）。其中同时拥有明显紫外吸收特征的谱峰为113个，远多于一维液相色谱－质谱联用检出的数目（23个谱峰）。
(3)分析数据自动处理方法
当采用统一的液相色谱－质谱联用方法对大量样品进行全局分析时，会产生巨大的数据量，仅采用人工方式进行数据分析耗时耗力，因此有必要发展计算机辅助的色谱数据处理方法是必要的。本项目采用Matlab软件开发了应用程序WiseProcessor，能够自动提取质谱数据，并判断分子量。程序报告的谱峰分子量计算结果综合了正离子模式和负离子模式下获得的数据，提高了分子量判断的准确性，弥补了单一离子化模式检测的不足。采用这一方法，90％以上的谱峰能够确定主要成分的分子量。对于方剂成分鉴定来说，确定物质的饮片来源是必要的步骤。通过比较方剂色谱峰与各饮片色谱峰在保留时间和分子量上的异同，通常能够确定物质的饮片归属，WiseProcessor能够自动完成这一工作。为了克服色谱峰漂移带来的困难，采用移动搜索窗口的方法，对邻近时间范围内所有的候选峰进行比对。利用色谱保留时间、分子量、紫外光谱等信息对所有检出成分进行化学表征。虽然多数物质的化学结构并未直接得到鉴定，但依靠上述化学特征信息，在绝大多数情况下能够通过文献查询、数据库比对等方式推断出该化合物的结构。
(4)数字化中药组分库构建技术
构建中药组分库的目的是将方剂复杂化学物质体系的所有成分进行系统分离分析和精确表征，进而实现活性成分的鉴定，为进一步的中药组效关系研究服务。因此，本项目重点解决了四方面问题：1）如何实现标准化、系统化的分离，制备满足高通量活性筛选要求的方剂组分样品；2）用何种分析手段获得高分辨率的成分化学数据；3）如何处理和管理相关的化学数据，并对检出化学成分进行表征；4）如何高效率地发现活性化合物。
本项目构建了标准化的中药组分分离技术，发展了植化分离鉴定与活性筛选相结合的方剂有效物质制备技术，并建立了涵盖了20余首方剂的中药组分库，为有效组分的配伍优化提供了源泉。该组分库由三部分构成：一是中药化学组分库，这是通过标准化分离制备获得的一个中药化学物质实体库；二是中药化学信息库，获得中药组分的化学表征信息；三是中药药效信息库，获取中药组分生物活性信息。
本项目还建立了数字化中药信息管理系统用于整合、管理和利用中药组分库。该信息管理系统主要包括以下几个模块：1）以中药制剂、饮片、组分、化合物四个层面为主线，建立中药化学谱图信息的通用储存格式，构建了基于语义对象模型的、便于修改和扩展的关系型数据库；2）制订了数据质量评判、修正和备份方案，建立了数据安全管理规范，开发了个性化单机和网络服务模式，为数据共享提供了合理的检索接口和结果发布方式；3）建立信息整合分析模块，包括色谱/质谱数据滤噪与解析、光谱多元校正等化学信息整合方法等。信息管理系统采用Client/ Server体系结构。C/S结构具有很强的联机事物处理能力，还有分布查询、多点更新、两阶段提交合远程调用等功能。它将与事物逻辑有关的数据完整性、安全性及事物逻辑管理放在服务器段，从而提高了系统的完整性、一致性和安全性。除化学数据管理、数据检索的功能外，本项目还开发了中药药效物质资源发掘模块，具有高级的数据分析功能，可运用数据挖掘方法对中药数据进行分析，找出隐含的规律和知识，指导和帮助中药研发。其方法流程如下：首先，通过数据库可检索出能够治疗某一疾病的所有中药，然后依次检索出与中药相关的所有饮片以及中药成分；第二步，通过频率分析，统计各饮片和成分出现的次数；第三步，对在第一步中检索出的所有中药成分按其结构类型进行聚类分析；第四步，综合考察评价聚类分析和频率分析的结果，挑选出与疾病最相关的饮片以及中药成分。
(三)中药有效组分配伍优化研究
中药具有多靶点、多途径整合调节的作用特点，其有效组分配伍常在多个药效指标上同时表现出较好的活性。如何遵循"突出主效应、兼顾次效应、降低副效应"的配伍原则，针对多个药效指标开展有效组分配伍优化，是以组分配伍创制现代中药的关键。本项目提出了基于定量组效关系（Quantitative composition-activity relationship, QCAR）的中药有效组分配伍优化方法并创建了技术实现方法。该方法的核心研究思路是根据各组分的化学分析数据与药效评价数据建立定量组效关系模型(QCAR)，定量描述中药组分配伍变化对药效的影响，在此模型上用优化搜索算法对所有的组分配伍方案进行排序寻优，优化设计有效组分配伍。研究成果发表在国际相关研究领域著名学术刊物《Chemical Biology & Drug Design》上，QCAR已被SCI收录作为关键词。根据QCAR思路，提出了通过均匀设计、单形格子设计、单纯形中心设计等实验设计方法合理安排方剂有效组分的配伍实验，进而通过多元线性回归、神经网络、支持向量机等计算方法建立定量组效关系模型，最后通过优化搜索算法对所有的组分配伍方案进行排序寻优，设计得到中药有效组分的优化配伍。　
1．中药有效组分配伍优化策略
有效组分配伍优化是通过所建立模型的仿真计算找出有效组分的最佳配伍，这一优化过程实质上是一类多维空间上的智能搜索问题，而解决这类搜索问题的关键是搜索算法的选择。常用的搜索方式可分为贪婪搜索和启发式搜索两大类，贪婪搜索方法是指在搜索过程中，除了能够分别目标状态和非目 标状态外，没有其他任何信息，而启发式搜索则是在搜索过程中，可以知道当前状态距离初始状态多远，同时通过启发式函数来估计当前状态与目标状态的距离，从而提高搜索效率。通过合理地设计启发函数，启发式搜索可以节省大量搜索时间，遗传算法就是其中的一种。本项目建立了多指标综合方法，通过对多个药效指标的融合，建立针对综合指标的定量组效关系模型，使最终得到的有效组分配伍能够满足“突出主效应、兼顾次效应、降低副效应”的优化目标。
2．中药有效组分配伍优化算法比较研究
本项目研究比较了多元回归、偏最小二乘法、支持向量机等计算方法在定量组效关系建模中的优劣，并比较了牛顿法、最速下降法、遗传算法等不同优化算法在配伍优化过程的优劣。研究发现，多元回归和偏最小二乘法较适用于组分数较少的数据集建模（如两组分和三组分配伍优化），当样本数量在10个以下的情况，采用这类方法建立的模型拟合效果较好，而人工神经网络、支持向量机等机器学习算法较适用于样本量较大的数据集建模。在优化算法方面，牛顿法和最速下降法的优化结果大致相同，但这两种方法一般只能用于解决单个药效指标的优化问题，遗传算法可用于多个药效指标的同时优化。
3．中药组分配伍优化设计软件
本项目开发了中药组分配伍优化设计软件。该软件能够根据用户需要，提供中药组分配伍的实验设计指导，根据不同的组分数目、药效指标数确定合理的试验样本数，并能够根据试验数据采用多元回归、偏最小二乘法、支持向量机等算法建立不同的定量组效关系模型。软件提供了线性加权和分层优化两种多指标优化模型，并提供了牛顿法、最速下降法和遗传算法等三种优化算法。用户在输入实验数据后，可以选择合适的建模方法和优化算法，自动计算出各组分的最佳配比。
4．参麦方组分配伍优化设计实例
选择参麦方中的3种组分，人参二醇型皂苷（PD）、人参三醇型皂苷（PT）和麦冬皂苷（OP）构成3个因素，在同一给药剂量下（75mg·kg-1），采用了三因素三水平的单形格子设计，试验点个数为10个。为了简化计算，把各组分的浓度进行了标准化，最小浓度归为0，最高浓度归为1。各点Xi取值为0，1/3，2/3，1。
为考察各因素即方中各种组分的最佳配伍比例，采用单形格子进行实验设计，以各组分PD (X1)、PT(X2)和OP (X3)的比例为因变量，心肌梗死面积和血清MDA含量为生物活性指标，作响应变量，用MINITAB统计软件进行分析，建立定量组效关系模型。根据建模结果分析发现，PT和OP的合用可以显著降低心肌梗死面积，PD在这方面作用不明显。这与之前文献报道PT和PD对血管生成起不同的调节作用，PT促进血管的发生，而PD起着相反的作用相符。此外，分析模型后发现PD和OP的一定比例配伍可以降低血清MDA含量。
通过模型仿真发现，同时降低MIS和MDA含量存在反相关性。为了找到一个组合能同时降低MIS和MDA含量，本研究采用Derringer函数融合多个药效指标来进行多组分的最优组合筛选。根据不同药效指标对疾病病理情况描述的重要程度，还可以赋予药效指标不同的权重，以达到“强化主效应、兼顾次效应”的优化目标。
筛选出的最优组合为PD、PT和 OP 分别占 21.6%、39.2%和39.2%，标记为V1，为下图所示响应曲面的顶点。V1 是通过建模优化方法计算得到的最佳结合，V2和V3为单目标优化结果。为了验证计算结果，用相同的动物模型进行了实验验证。验证实验结果表明V1和 V2与模型组比可以显著降低MIS和血清MDA含量（p&0.05），同时多目标优化结果V1显著优于单目标优化结果V2和V3。
参麦方组分多指标综合优化示意图
V1为多指标融合得到的优化配伍，V2, V3分别为单指标优化配伍
本研究在3组分10次配伍组合实验的基础上寻找到了最优组合的配比比例。这表明，适当的统计实验设计和计算模型，对从复杂中药体系中发现新的组分配伍起着至关重要的作用，可以大大降低药物开发的劳力和成本。
(四)中药有效组分作用模式研究
本项目选择复方丹参方作为模型药物，以组分配伍为为切入点，围绕中药有效组分配伍理论，以组—效、时—效关系及组分配伍整合调节作用为重点开展了研究。
1．组分配伍多维整合调节作用模式
（1）复方丹参方组—效关系研究
研究采用冠脉结扎大鼠心肌梗死模型观察丹酚酸B（Salvianolic acid B，SalB）、三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）两种组分单用和配伍对其心肌梗死的影响。结果表明，在改善大鼠心电图方面，结扎大鼠冠脉前降支后，各组ST段抬高，3h后ST段下降，下降波幅度（△ST）以Sal B组最为明显；采用染色法测定心肌梗死区、缺血区及与左心室的重量，计算Infarct Size、Infarct Size/LV（%）、Risk Size/LV（%）、Infarct Size/ Infarct plus Risk（%）、Risk Area/ Infarct plus Risk（%）、Infarct Size/Risk Area（%）。在梗死区/左心比例方面，组分配伍组可以显著降低梗死区/左心比例，配伍中、高剂量组降低梗死区/左心比例的作用显著优于Sal B组。
在改善左心室功能方面，各组分单用及组分配伍均能显著降低左室舒张末期压（LVEDP）、显著升高左心室内压最大上升速率（+dp/dt max）、最大下降速率（-dp/dt max），且配伍组的作用有优于其它中药组的趋势。
在动物模型的基础上，取梗死区与正常区之间的新鲜组织，制备心肌细胞单细胞悬液，应用流式细胞仪检测，发现与模型组相比，各中药组均能够显著降低凋亡细胞百分率，且配伍组的作用最为明显。各组分单用及配伍应用均有降低血清LDH含量，有降低血浆Ang Ⅱ释放水平的趋势，且配伍高剂量组优于其它中药组。实时荧光定量RT-PCR技术检测结果表明，配伍组均可以显著降低Bcl-2、Bax、caspase-8的表达，各中药组均可以显著降低IL-6、STAT-3的表达，且配伍组有降低JAK-2表达的趋势。
（2）复方丹参方组分配伍时-效关系研究
在组-效关系研究的基础上，进一步探讨时-效关系。结扎大鼠冠状动脉前降支造成急性心肌梗死后，冠状动脉支配的心肌区域出现肿胀、组织呈现白色坏死，主要是前壁和心尖部的梗死；心梗7天出现心室腔扩大，梗死区室壁心肌变薄、拉长、变硬，产生膨出，变薄的组织僵硬，随着梗死时间延长（14天、28天）僵硬程度加重，产生疤痕组织；非梗死区室壁心肌的反应性肥厚，以梗死区周边显著。光镜观察心肌的病理形态和结构结果显示，结扎冠状动脉前降支后，3天时，心肌细胞大部坏死，大量单核细胞、淋巴细胞浸润，坏死区水肿、出血；半暗带区心肌纤维变性、横纹消失，胞质嗜伊红深染，心肌间质炎性细胞浸润；7天时，心肌坏死处肉芽组织中出现纤维组织，较细，毛细血管和炎性细胞浸润减少；14天时，心肌坏死处肉芽组织纤维组织，增粗增多，成纤维细胞和纤维排列有序，毛细血管减少；28天时，心肌坏死处肉芽组织中纤维组织增多，成纤维细胞和毛细血管减少，肉芽组织逐渐成熟形成瘢痕组织。出现早期以炎性改变，后期以纤维化为主的病理过程。
在明确各时间点病理模型改变的基础上，从心肌梗死重量角度观察丹参/三七组分配伍对大鼠心肌梗死后不同时间点的梗死范围和程度的影响。结扎大鼠冠状动脉前降支造成急性心肌梗死后分别给药3天、7天、14天、28天，染色法测定心肌梗死区、缺血区及正常区各部位的重量，并进行相应数值计算。结果显示：冠状动脉前降支支配的坏死区重量随着缺血时间延长逐渐增加；各给药组均不同程度地降低心肌梗死的程度，具有抗心肌缺血的作用。
给药3天时以丹参酮 (Tanshinone,Tan)及Tan/PNS配伍组作用显著。Tan可明显降低Infarct Size/LV（%），与模型组比较差异有显著性差异（P&0.05）；Tan/PNS配伍组在降低梗死区（Infarct Size）重量及梗死区重与左心室比例（Infarct Size/LV（%）方面作用显著（均P&0.05）；即3天时以Tan及Tan/PNS配伍组为优。
给药7天，SalB、Tan、PNS单用及SalB/PNS、Tan/PNS配伍组均能够不同程度地降低心肌梗死程度；但仍以Tan及Tan/PNS配伍组作用为优；Tan及Tan/PNS配伍组在改善Infarct Size/LV（%）尤其是Infarct Size/Risk Area等方面作用显著，继续保持抗心肌缺血的优势；单用PNS组在给药7天显示出一定的抗心肌缺血损伤的作用；SalB/PNS配伍组和Tan/PNS配伍组在改善Infarct Size/LV（%）方面作用显著；在该时间点Tan/PNS配伍组有优于SalB/PNS配伍组的趋势；
给药14天，与给药3天、7天比较上述指标变化不显著，药物的作用显示出以SalB/PNS配伍组和Tan/PNS配伍组为优，并且在该时间点SalB/ PNS配伍组和Tan/PNS配伍组作用趋势相近；给药28天，与给药3天、7天、14天进行比较，SalB显示出抗心肌缺血的作用，具有显著降低Infarct Size/LV（%）、Infarct Size/ Infarct plus Risk（%）、Infarct Size/Risk Area的作用，与模型组比较具有显著性差异（P&0.05）；SalB//PNS配伍组和Tan/PNS配伍组继续保持作用优势，其中在该时间点SalB/PNS配伍组和Tan/PNS配伍组的作用基本持平。
（3）复方丹参方有效组分配伍对急性心肌梗死大鼠基因表达网络调控
在明确复方丹参方及有效组分对急性心肌梗死大鼠心脏保护作用的基础之上，应用丹参的水溶性成分丹酚酸B及脂溶性成分丹参酮，分别与三七总皂苷配伍，采用Affymetrix基因芯片技术，观察丹酚酸B（Sal B）、丹参酮（Tan）和三七总皂苷（PNS）组分单用及组分配伍药物进行干预，观察大鼠心肌缺血后3天、7天、14天及28天不同阶段的基因表达网络调控。
研究筛选出模型与假手术组各时间点的差异基因，排除了单独用药即可引起基因表达的变化，筛选只有药物配伍应用两组才能对抗模型组变化的表达基因，以进行后续的数据分析，共得到514条基因（其中包括50条基因重复），利用GCOS, iMiner、Dchip、K-MEANS等数据分析软件对差异基因进行了分析，从中筛选与心血管疾病密切相关的变化基因，结果表明配伍应用药物对基因表达有明显影响，丹酚酸B及丹参酮与三七总皂苷配伍，可调控心肌缺血的基因变化。
通过统计方法对SalB/PNS组分配伍组的差异基因子集进行分析。采用ANOVA分析，首先分别获取S（Sal B）、P（PNS）及S+P（SalB+PNS）的差异基因子集（Fold change &2, P value&0.01），然后采用VennDiagram分析配伍导致的基因组学变化，进而进行通路分析。结果显示：SalB组与模型组和假手术组（M/N/S）的交集差异基因共有124条（Fold change &2, P value&0.01）；PNS与模型组和假手术组（M/N/P）交集差异基因共有113条（Fold change &2, P value&0.01）；SalB+PNS配伍组与模型组和假手术组（M/N/S+P）交集后差异基因共有130条（Fold change &2, P value&0.01）；配伍后差异基因较组分单用表达增加。
采用Venn Diagram(By Pathway，T/P/T+P)分析得出，M/N/T涉及心血管相关信号通路 22个；M/N/P涉及心血管相关信号通路21个；M/N/T+P相关通路46个；M/N/T、M/N/P、M/N/T+P共同信号通路11个，主要有Jak-STAT signaling pathway、Cell Communication、Focal adhesion、Androgen and estrogen metabolism、Bile acid biosynthesis、ECM-receptor interaction、MAPK signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、C21_Steroid hormone metabolism、ARACHIDONIC Acid metabolism；M/N/T+P配伍后与单用药不同的信号通路22个，主要有Jak-STAT signaling pathway、MAPK signaling pathway、Cell Communication、TGF-beta signaling pathway、Complement and coagulation cascades等。
采用Venn Diagram（By Gene Ontology terms，T/P/T+P）分析，按biological_process、molecular_function、cellular_component进行分类，M/N/T、M/N/P、M/N/T+P差异基因交集共114个；M/N/T+P配伍组有222个差异基因。
采用Affymetrix RAT 230 2.0 基因表达谱芯片和GCOS（数据处理软件），从基因组学角度观察了Sal B、Tan与PNS组分单用和配伍（Sal B/PNS、Tan/PNS）后应用对大鼠心肌梗死后不同时间点（3天、7天、14天、28天）缺血区基因表达的影响，结果显示，冠心病病理机制复杂，其基因表达的改变同样涉及众多环节和通路。缺血区心肌组织存在脂肪酸合成代谢及线粒体β氧化障碍，免疫应答中C3补体通路激活，炎性反应增强，心室重构的相关基因表达增强、凋亡通路和信号传导通路被激活、血液凝固系统亢进、血管紧张素酶转换系统激活等环节。
随后，研究对丹参有效成分丹酚酸及丹参酮两类成分的机制进行了深入探讨，综合分析心肌梗死面积、超声心动图和芯片的结果，研究发现丹参酮的优势体现在缺血早期，其抑制细胞内钙和细胞粘附分子的表达作用明显；而丹酚酸在缺血晚期作用较明显，其减轻氧化应激、G蛋白耦联受体激活及抑制凋亡的作用较显著。实验对GOFFA和KEGG分析得到的不同基因分类挑选差异表达基因进行RT-PCR验证。PCR验证共选择6条差异表达基因，为：Rcvrn、Sod2、C3、Cyp7a1、Fas及Icam-1，分别涉及钙通道、氧化应激反应、补体、代谢酶、细胞凋亡以及炎性反应通路。结果显示RT-PCR验证与基因芯片的结果基本一致，证实基因芯片结果稳定可靠。
（4）复方丹参方组分配伍对大鼠心肌梗死后不同时间点基因表达谱的影响
基因芯片结果显示，大鼠心肌梗死早期差异基因涉及分子调控通路较多，随着时间延长数量稍有减少，而所参与调控的基因通路也有差异，与病理改变具有一定相关性。心肌梗死3天时，钙通道、细胞粘附分子通路表达上调。心肌梗死7天时，血管内皮生长因子通路被激活、细胞通讯增加。细胞因子受体相互作用通路和B细胞信号通路等通路表达上调，表明了炎性反应的发生和免疫反应的增强。心肌梗死14天时，Jak-STAT信号通路表达上调，体现了细胞凋亡的发生。心肌梗死28天后，MAPK通路上调，表明细胞凋亡现象的持续。
大鼠心肌梗死后7天，模型组与假手术组比较基因表达变化明显，各给药组在药物作用7天时对抗心肌缺血基因表达改变最为显著；SalB/PNS、Tan/PNS两个配伍组（SP、TP）在7天时表现出明显的优势，配伍组的基因表达较组分单独用药明显增多。在排除单独用药即可产生基因表达变化的基础上，筛选出组分配伍组与模型组比较的差异表达基因，经GCOS，iMiner及Dchip等数据分析软件分析，共得到514条差异表达基因，且不同的配伍基因表达的变化不同，不同时间点不同类别的基因表达也不同。
以K-MEANS对差异基因进行分析，考察基因在几个时间点内的信号值改变，根据信号值在各时间点的变化趋势不同，结合基因聚类分析，将配伍应用药物所针对的基因分为以下六大类：
细胞粘附及抗原递呈（333条基因,下同）：基因信号值改变在四个时间点无明显改变。
①代谢相关基因（103）：基因信号值改变在四个时间点中稍有变化但不大。
②正向调控相关基因（30）：基因信号值在3、7、14天时间点逐渐升高，28天与14天时基本持平。
③免疫应答相关基因（29）：基因信号值改变呈折线状，在7天时显著升高，14天回落，28天时又稍有升高。
④受体激活相关基因（17）：基因信号值在3、7天无明显改变，但在14天显著升高，与28天基本持平。
⑤信号肽相关基因（2）：基因信号值在3天达到峰值，而后迅速回落，显著降低，从14到28天维持低水平。
⑥从其中筛选出与心血管疾病密切相关的变化基因：
细胞粘附类（Cell Adhesion）：VCAM-1，ICAM-1，integrin，selectin
免疫应答类（Immune Response）：IL-1，IL-6，IL-8，TNF-α，Apoe，IFN
脂代谢类& （Lipid Metabolism）：ApoE，ApoB，ApoA
细胞生长类（Cell Growth）：MMP-2，MMP-9，MMP-13
以上实验结果表明Sal B及Tan与PNS 配伍，可以对抗心肌缺血的基因数量变化，其中在心肌缺血早期（7天）的作用显著。差异基因以细胞粘附、免疫应答、代谢、受体激活、细胞生长类等为主。各给药组在药物作用7天时对抗心肌缺血基因表达改变最为明显；SalB/PNS、Tan/PNS两个配伍组（SP、TP）在7天时表现出明显的优势，配伍组的基因表达较组分单独用药明显增多。而Tan/PNS配伍组与模型组和假手术组的差异基因交集数量（256条）较SalB/PNS差异基因交集数量（130条）明显增多。
2．组分配伍多靶作用模式
在组效、时效研究基础上，应用生物信息学等方法，研究复方丹参方多组分配伍的抗心肌缺血损伤的整合调节作用规律，诠释中药组分配伍的科学内涵，揭示组分配伍的作用优势。
(1) SalB/Tan对H/R损伤内皮细胞的影响
利用体外培养大鼠心脏微血管内皮细胞，借助缺氧/复氧损伤模型，观察丹参水溶性成分丹酚酸B和脂溶性成分丹参酮ⅡA对受损内皮细胞的影响。结果表明丹酚酸B及丹参酮IIA均可促进缺氧复氧损伤内皮细胞增殖，增强细胞活力，降低LDH释放。丹酚酸B及丹参酮IIA均可抑制内皮细胞钙内流。丹酚酸B在剂量1&M、10&M、100&M时对钙内流具有浓度依赖性抑制作用，而丹参酮IIA在10&M剂量组显示出最优效果。利用RT-PCR及ELISA法观察到丹酚酸B及丹参酮IIA抑制缺氧/复氧损伤时HIF-1α的表达升高，丹酚酸B 1&M、10&M作用有优于丹参酮IIA的趋势。p38 MAPK通路抑制剂不能抑制丹酚酸B及丹参酮IIA降低HIF-1α的表达的作用，而ERK1/2抑制剂可以抑制丹参酮IIA的作用而对丹酚酸B的作用无效。说明丹参酮IIA可能通过ERK1/2通路发挥其抑制HIF-1α表达的作用，而与p38 MAPK通路无关。丹酚酸B则不通过p38 MAPK及ERK1/2通路起效。
(2)TanIIA对平滑肌细胞增殖的影响
以体外培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）为模型，观察药物对胎牛血清刺激的VSMC增殖的影响。结果显示丹参酮可抑制VSMC生长，使VSMC生长曲线右移，可浓度依赖性抑制VSMC细胞活力和细胞总蛋白的合成，可使VSMC细胞增殖周期阻滞于G0/G1期，可浓度依赖性抑制FBS诱导的VSMC磷酸化ERK（1/2）、p-38MAPK表达，但对JNK表达没有显著影响；而丹酚酸对VSMC生长曲线没有显著影响，对VSMC细胞活力和总蛋白合成均无显著影响，对VSMC增殖周期没有显著影响。丹参酮对VSMC增殖具有抑制作用，而丹酚酸不具有该作用；丹参酮可使VSMC细胞增殖周期阻滞于G0/G1期，从而抑制VSMC增殖，或可通过抑制ERK和p-38MAPK途径抑制VSMC增殖。
(3)丹酚酸B对小胶质细胞炎性反应的抑制作用
体外原代培养大鼠脑小胶质细胞，用脂多糖（LPS）刺激小胶质细胞建立神经炎性模型，用丹酚酸B进行干预，考察丹酚酸B的抗炎机制。结果表明，丹酚酸B可以抑制小胶质细胞NO、TNF-α和IL-1β的分泌，且成浓度梯度依赖关系；丹酚酸B还抑制iNOS、TNF-α和IL-1β mRNA的表达；其机制是通过抑制NF-κB转录因子的DNA 结合活性；丹酚酸B通过抑制小胶质细胞的激活而起到神经保护作用。
(4)丹参酮类成分抑制刺激剂诱导的儿茶酚胺分泌
本研究以牛肾上腺髓质细胞为模型，以冰片、丹参酮对肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分泌、细胞内钙离子浓度的影响为指标，初步探讨了其治疗心血管疾病的可能机理。研究发现冰片可显著抑制乙酰胆碱、藜芦定碱诱导的儿茶酚胺分泌；对乙酰胆碱诱导的儿茶酚胺分泌的抑制作用随浓度升高而增强；对高钾溶液诱导的儿茶酚胺分泌均未见显著影响。可知开窍药冰片具有抑制交感活性作用，且通过乙酰胆碱受体途径和电压门控钠离子通道发挥作用。丹参酮能显著抑制乙酰胆碱、藜芦定碱、高钾溶液诱导的儿茶酚胺分泌；然而，丹参酮单用能显著促进细胞儿茶酚胺的分泌，而且促分泌作用依赖于细胞外的钙离子。可知丹参中丹参酮对牛肾上腺髓质细胞中儿茶酚胺的分泌具有双向调节作用，其机制与丹参酮单用促进细胞内钙离子浓度升高，抑制ACh、Ver和高钾溶液等刺激剂引起的细胞内钙离子浓度升高有关。
(5)丹参酮IIA通过雌激素样效应发挥心血管保护作用
研究采用荧光素酶报告基因对丹参酮ⅡA的雌激素样活性进行评价，并观察其在MCF-7、MDA-MB-231、Raw 264.7和CMEC细胞中雌激素样效应的差异性。研究结果表明，丹参酮IIA具有促进Hela细胞中ERα和ERβ转录活性的特点，其雌激素样效应在表达ERα和（或）ERβ的细胞中存在差异，丹参酮IIA能够抑制雌激素受体依赖的MCF-7细胞的增殖，丹参酮IIA也可通过雌激素受体途径发挥抗炎作用；在以ERβ表达为主的心脏微血管内皮中，丹参酮IIA可通过影响ERK途径而促进NO产生和eNOS mRNA的表达。上述研究结果表明，丹参酮IIA可以通过雌激素受体途径发挥抗炎及促进血管活性物质分泌的作用。
(6)冰片对血脑屏障体外模型的影响
成功建立体外血脑屏障模型，在此模型基础之上研究冰片对血脑屏障的影响及冰片对P-gp底物药物透过血脑屏障的作用。究结果显示，冰片能够增加Rho123在脑微血管内皮细胞内的堆积，并且能够促进P-gp底物药物地高辛和维拉帕米透过血脑屏障体外模型，表明冰片能够抑制脑微血管内皮细胞P-gp的外排功能。进一步研究表明是通过NF-κB途径介导的P-gp表达的抑制作用是其“开窍”作用的机制之一。
3．组分配伍的基因组学与蛋白质组学研究
本项目选择冠心II号方、双丹方等为模型药物，运用基因组学与蛋白质组学技术开展了探索性研究。研究结果表明，心肌缺血导致了大鼠心肌缺血交界区的基因表达谱和蛋白表达发生了巨大变化，冠心II号方可调节大鼠心肌缺血所致交界区的基因表达变化，通过改善涉及能量和其他物质代谢、信号转导、细胞生长分化凋亡和细胞周期等通路的基因干预缺血。同时，心肌缺血导致了与能量代谢、心肌收缩、抗氧化及蛋白质稳定相关的蛋白表达发生变化，冠心II号有效组分重组复方能逆转心肌缺血导致的蛋白表达异常，且活血药组分与理气药组分对部分差异蛋白表达的调控表现出相加或协同的作用。此外，运用蛋白质组学技术研究发现，双丹方有效组分配伍能通过保护线粒体功能，改善能量代谢以及减轻氧化损伤这几方面途径起到保护缺血心肌的作用。上述研究结果表明，基因组学与蛋白质组学技术能够从基因与蛋白水平揭示方剂有效组分的作用模式。
(五) 组分配伍的体内过程研究
本项目以复方丹参方、茵陈蒿汤有效组分的吸收和代谢为切入点，研究组分配伍对药代动力学的影响，建立了体内外化学组分的分析检测方法，开展了复方丹参方中丹参/三七组分配伍对丹参脂溶性成分药动学的影响以及茵陈蒿汤组分配伍对该方入血成分及其药动学影响两方面的研究。
1．中药药代“Marker”概念的提出
证明中药的有效性、寻找中药的药效物质基础是开展现代中药研究的两项重要内容。证明中药的有效性需要有至少四方面的证据：①中药的作用强度及其与剂量的关系；②服药后机体对中药活性物质的暴露；③与中药疗效相关的作用机理；④中药质量的可控与保证。另一方面，中药的药效物质基础应由具有良好类药属性的中药成分组成。所谓“类药属性”是指中药成分的药理活性、毒性、药代属性和含量。中药药代动力学研究的重要任务就是要证明服药后机体对中药物质的暴露，研究不同中药成分的药代属性。这里所指的“药代属性”包括：①中药成分给药后被吸收及到达作用部位的能力；②中药成分具有一定的代谢稳定性，在体内能够达到并维持产生疗效的浓度；③中药成分能以适当的速度从体内消除。中药所含的成分因化学结构不同，其药理活性的强度和种类往往存在较大的差异；与此相类似，中药成分的药代属性也因其化学结构不同而存在着较大差异。因此，针对中药复杂的化学组成，中药成分的药代属性与其药理活性一样，均可用于鉴别中药成分对于疗效的重要性。
基于上述理论，本项目首次提出了中药的“药代Markers”概念，并发表在美国药理和实验治疗学会主办的国际权威药代动力学研究刊物（Drug Metab. Dispos. 78–1586）上。所谓“药代Marker”是指药代属性良好，能够反映服药后机体对中药物质暴露，在体内测到的中药成分或相关物质。需要指出的是：①除药代属性外，中药的剂量、给药途径等也能影响中药成分或其相关物质是否是中药的“药代Markers”；②对于包含多味中药的方剂而言，用来自不同中药、不同组分的多个“药代Markers”共同反映给药后机体对方剂的暴露优于仅使用单一“药代Marker”；③中药的“药代Markers”不能简单地等同于中药的“药效物质基础”；前者主要强调中药类药属性中的药代属性，而后者则必须全面具备良好的类药属性，包括在体内达到并维持有效浓度。④具有与中药疗效相关药理活性的中药成分用作“药代Marker”时比活性不明或缺失的中药成分使用价值更大。中药的“药代Marker”可用于多种研究，它可帮助设计和解释中药毒理试验和临床试验、用于研究方剂配伍、预测中药与西药合用时是否产生不良作用（HDI）以及帮助中药新制剂开发等。关于如何鉴定中药的“药代Marker”，本项目首先在服用复方丹参方后丹参酚酸类活性成分体内变化特征的研究中进行了成功实践。
(1)复方丹参方中来自丹参的“药代Markers”的发现与鉴定
复方丹参方中酚酸类组分是丹参所含的一类活性组分，包括：丹参素（TSL）、原儿茶醛（PCA）、丹酚酸A（SAA）、丹酚酸B（SAB）、丹酚酸D（SAD）、迷迭香酸（RMA）和紫草酸（LSA）等。为了发现和鉴定复方丹参方的“药代Markers”，首先建立了血浆、尿等生物样品中多种丹参酚酸成分一同检测的方法。在此基础上分析比较了犬口服和静注给药后，血中测到的丹参酚酸类成分。研究发现：犬经口吞服复方丹参滴丸（按临床剂量折算）后，丹参素是血中唯一测到的丹参酚酸类成分，其血浆暴露水平（AUC、Cmax）与口服复方丹参方的剂量（2~8 丸/kg）成线性相关。服药后丹参素吸收快，其口服生物利用度约为40%；in silico计算结果提示丹参素在十二指肠的吸收比其它肠段好。犬血中丹参素的半衰期（t1/2）约为0.5 h。在大鼠上进行了组织分布实验结果表明，丹参素的血浆t1/2与其不同组织的t1/2相近，提示血中丹参素可较好地用来反映该化合物在体内组织中的浓度变化特征。此外，在人体上进行的口服复方丹参方实验也证明丹参素有良好的系统暴露，而其它丹参酚酸类成分仅检测到很低的系统暴露。以上研究结果表明，血中测到的丹参素可作为复方丹参滴丸的一个“药代Marker”，用于反映服药后机体对该方的物质暴露。人体实验表明，服用复方丹参方后丹参素在尿中的累积排泄量（Cum.Ae0→12h和Cum.Ae0→3h）与其血浆AUC0→6h的相关性良好。该数据证明尿中测到的丹参素也可作为复方丹参滴丸的一个“药代Marker”。
(2)其它丹参酚酸成分难以成为复方丹参方“药代Markers”的原因
利用in vivo、in vitro和in silico等手段研究了丹参其它丹参酚酸类成分不能成为“药代Markers”的原因。研究发现原儿茶醛进入血液后迅速被红细胞吸收降解，首过肝代谢也显著降低了该化合物的系统暴露水平，这些造成原儿茶醛的体内暴露水平低。在丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸D和紫草酸的分子中氢键供体和受体数量过大且其脂溶性较差，这些是化合物的膜通透性变差，进而影响了它们在胃肠道的吸收和系统暴露水平。迷迭香酸的膜通透性虽然略好，但服用复方丹参方后该化合物在血中和尿中浓度也很低，这可能与其在肠道被代谢降解有关。
(3)茵陈蒿汤的药代Marker研究
对茵陈蒿汤的21个入血成分进行了经时变化规律研究，并按“易于检测，吸收快，消除慢，具有较高的血药浓度，维持较长的平台期”的标准进行体内代谢行为评价。结果表明体内代谢行为较好的成分中，3个化合物来自君药茵陈蒿，3个化合物来自臣药栀子，3个化合物来自佐药大黄。
项目组分别对君药茵陈蒿、臣药栀子和佐药大黄的主要入血成分进行了药代动力学分析，发现茵陈中的6,7-二甲氧基香豆素是代表君药的有效成分，京尼平苷是代表臣药栀子的有效成分，大黄酸可作为代表佐药的有效成分。因此，选择6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黄酸这3个化学成分作为茵陈蒿汤的药代Marker，开展组分配伍的体内过程研究。
2．复方丹参方体内过程研究
(1)复方丹参方体内外化学组分分析检测方法的建立
以复方丹参方的吸收为切入点，采用计算机预测、体外筛选和在体吸收等相关模型，结合现代分析化学技术，对复方丹参方化学成分及口服吸收入血成分进行研究；在此基础上，从有效成分溶出、吸收、分布和药效等多个角度对复方丹参方的配伍规律进行了探索性的研究。
1)建立了一种鉴定复方丹参化学成分LC-DAD-MSn 方法，并成功用于复方丹参制剂及其组成药味化学成分分析，阐明了复方丹参方化学物质基础。
2)利用计算机预测、体外筛选和在体吸收等多种吸收模型，对复方丹参口服可吸收入血成分进行了定性研究。计算机预测结果表明丹参中7个酚酸，40个丹参酮易吸收入血，而丹参中大分子酚酸和三七皂苷不易吸收入血；通过Caco-2筛选模型发现有19个化学成分可吸收入血，包括9个酚酸，5个丹参酮，4个三七皂苷人参皂苷Rg1、Re 、Rb1和 Rd；大鼠在体研究结果表明10个酚酸、6个丹参酮和5个三七皂苷可以吸收入血。从化学成分定性的角度，明确了复方丹参方的吸收可入血的化学成分，为下面的研究提供了科学依据。
3)选择了可吸收入血的三个酚酸和4个丹参酮作为指标，建立一种能快速分离和测定丹参中两类成分HPLC-UV分析方法，该方法能够准确地测定丹参中7种有效成分的含量，具有较好的精密度、准确度、灵敏度、重现性。通过对不同比例配伍组成复方中君药有效成分的含量的测定，研究了臣药对君药有效成分溶出的影响。在复方丹参方中，臣药三七能够影响君药丹参有效成分的溶出，并与配伍比例有关。从化学成分溶出的环节，揭示了君药和臣药之间的相须的配伍关系。
4)选择丹参中9个丹参酚酸类，4个丹参二萜醌类和三七中3个皂苷类为有效成分指标，采用高效液相色谱-质谱联用检测法同时测定caco-2模型中复方丹参方中可吸收入血的三类有效成分。研究结果表明使药冰片能够促进君药丹参和臣药三七有效成分吸收，从吸收环节在一定程度上揭示了方剂配伍君臣药与佐使药的相使的配伍关系。臣药三七对君药丹参酚酸类有效成分有促进，而对丹参酮类成分有抑制作用。丹参也能够促进三七有效成分的吸收。该结果进一步阐明了君臣之间的相须的配伍关系。
5)以丹酚酸B和4个丹参酮为指标，考察了臣药三七的有效部位皂苷和使药冰片对其吸收的影响，结果表明三七总皂苷和冰片可以促进丹酚酸B和丹参酮的吸收；皂苷对丹参酮吸收可能存在抑制的作用。利用药代动力学的方法，以丹酚酸B为指标，从分布和消除环节研究了方剂配伍对君药有效成分在吸收入血后行为的影响，研究结果表明臣药三七和佐使药冰片都有促进君药有效成分分布、消除的作用。
6)利用化学发光检测原理，基于两种不同化学发光体系建立君药丹参中八种酚酸含量同时测定方法，并进行了丹参制剂质量控制研究。通过对比两种化学发光检测方法的性能，发现基于luminol-H2O2体系所建立化学发光检测方法比基于luminol-邻苯三酚建立化学发光检测方法的更适用于测定不同丹参制剂在较低浓度情况下酚酸类成分。基于luminol- H2O2体系的化学发光检测器与传统紫外检测器对比，该种化学发光检测器具有较好的灵敏度，价格比较低廉等优势。利用化学发光检测检测体系建立了一种测定酚酸的的新方法，并成功用于丹参制剂的质量控制。
7)利用HPLC-CL和HPLC-ESI-MS方法成功地建立了活性整合指纹图谱。该整合指纹图谱是由色谱指纹和清除H2O2的抗氧化活性指纹组成。本研究以丹参注射液为例，构建了丹参注射液的抗氧化活性整合指纹图谱，并用于丹参注射液的一致性的评价。与传统色谱指纹图谱相比，活性整合指纹图谱能全面合理地显示丹参水溶性总酚酸的化学与活性特征。实验结果证明了活性整合指纹图谱是复杂中药质量控制的一种新的高级工具。
8)通过模拟阳性药物峰效关系模型，成功构建了丹参注射液的效价指纹图谱。该方法不仅能够简单、快速地测定复杂体系中有效成分的活性，同时能很好地反映每一个有效成分对总体活性的贡献率。
9)针对复方丹参治疗心血管疾病的特点，提出了二维活性整合指纹图谱技术，并成功应用于丹参药材的质量控制和复方丹参药效配伍规律的研究。通过利用相似度评价和判别式分析与丹参药材二维活性指纹图谱结合，成功地评价不同产地、不同品种、不同栽培方式的丹参药材，从化学信息和活性信息的多角度确定了栽培丹参和山东产的白花丹参可以作为野生丹参药材的替代品，用于复方丹参制剂的生产。同时，利用多维活性指纹技术阐明了复方丹参方清除过氧化氢和超氧阴离子活性的物质基础，从药效环节上显示了君药丹参和臣药三七在复方丹参方中在药效上存在互补的作用，从药效角度阐明了君臣药配伍相须配伍关系。
(2)复方丹参方中丹参/三七组分配伍对丹参脂溶性成分药动学的影响
利用已确定的复方丹参方中丹参及三七可吸收入血成分，采用已建立的LC/MS/MS法测定大鼠灌胃给药后的血浆样品，分别研究了丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮IIA在大鼠正常状态下单独给予丹参酮提取物、配伍给予丹参酮提取物/三七皂苷提取物；在大鼠急性心肌缺血模型状态下单独给予丹参酮提取物、配伍给予丹参酮提取物/三七皂苷提取物的药动学。
结果表明，配伍给药可降低隐丹参酮的入血量，使隐丹参酮的Tmax值降低，并加快隐丹参酮和丹参酮IIA在大鼠体内的消除速率。大鼠在模型状态下，配伍给药可提高丹参酮I和丹参酮IIA的最大吸收量和入血量，提高隐丹参酮的最大吸收量；使其Tmax值升高，并加快其在大鼠体内的消除速率。配伍给药，大鼠处于病理状态下，丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮IIA的最大吸收量有显著提高；隐丹参酮和丹参酮IIA的入血量有显著提高。单独给予丹参酮，大鼠在病理状态下，隐丹参酮的Tmax显著降低、消除速率减慢，且大鼠在模型状态下配伍用药比在正常状态下配伍用药对药动学参数影响大。
(3)丹参脂溶性二萜类组分的药代研究
脂溶性二萜类化合物是丹参所含的另一类活性组分，本项目系统分析这类中药成分的药代属性，研究结果表明，水溶性差、肠排泄快以及肠肝代谢等因素可能会限制这类活性成分作为丹参药效物质基础的潜力。另外，虽然丹参的多个脂溶性二萜类化合物对细胞色素P450药物代谢酶有较强的体外代谢活性，但是由于给药后机体对其暴露水平较低，因此丹参口服给药后因这些成分产生不良HDI的风险较低。
(4)三七皂苷类活性组分的吸收及其体内变化过程的研究
三七是复方丹参方的另一味组成中药。本项目开展的三七提取物药代动力学研究揭示了三七活性皂苷成分的体内变化特征。
1)血中主要测到的是接糖较多、分子量较大、含量相对较高的二醇型皂苷和三醇型皂苷，此外血中还可测到少量三七提取物中所没有的二醇型脱糖降解产物C-K。二醇型与三醇型皂苷的药-时曲线明显不同，前者为单峰曲线、后者呈多峰曲线。经成分剂量校正后的二醇型皂苷成的暴露水平（AUC）明显高于三醇型皂苷，个体差异相对较小。2)上述二醇型皂苷AUC与三七提取物的口服给药剂量呈正相关，但上述三醇型皂苷和代谢物C-K的AUC与三七剂量相关性差。3)上述二醇型皂苷的半衰期（t1/2）较长（7.5~20 h），而三醇型皂苷的较短（0.2~0.4 h）。这些二醇型皂苷在大鼠连续给药8~15天后其AUC和Cmax增加了2.0~2.5倍。4)和系统暴露水平一样，上述二醇型皂苷在不同组织中的暴露水平也显著高于三醇型皂苷和C-K。二醇型皂苷的血药浓度变化特征能较好地反映其在不同组织中的浓度变化特征。5)上述三七皂苷成分及C-K均在尿中可以检测到，但其Cum.Ae的个体差异较大。6)人体服用三七提取物后皂苷成分的药代变化趋势与大鼠的基本一致。以上实验观察证明，二醇型皂苷的t1/2较长，是口服三七提取物后体内出现最显著的三七皂苷成分，血中测到的这些成分可作为“药代Markers”，以反映机体对口服三七提取物的物质暴露。
(5)三七皂苷多成分“构-代关系”分析
1)三七皂苷成分及其脱糖降解产物的胃肠道吸收和相关“构-代关系”分析
虽然三七提取物中主要的二醇型人参皂苷和三醇型人参皂苷的系统暴露水平有很大的差异，但这些皂苷成分的口服生物利用度（F）均较差（&1%）。研究表明：三七所含皂苷类成分的肠道吸收较差主要由这些化合物的膜通透性不好造成的。从分子特征来看，接上多个糖基后造成这些化合物的分子极性表面积变大、氢键供体受体增多、分子柔韧性变大，这些理化性质均不利于其膜通透性。随着脱糖降解，这些分子特征上的矛盾逐渐降低，但脱糖过多又影响了分子的水溶性。前人有一种观点认为皂苷在结肠中微生物的作用下脱糖降解可改善吸收，上述关于三七皂苷吸收方面的“构-代关系”分析提示脱糖降解对三七皂苷肠道吸收的改善有限，大鼠口服给药三七提取物后粪样和血样中皂苷脱糖降解产物的对比分析结果支持这一判断。
2)三七皂苷成分及其脱糖降解产物在体内的关键清除途径和相关“构-代关系”分析
在口服三七提取物后的大鼠粪便中检测到多种二醇型和三醇型皂苷的脱糖降解产物，其中的C-K和GRg1分别是二醇型和三醇型皂苷在粪中发现量最多的脱糖降解产物（注：GRg1在粪样中的累计排泄量超过了其来自三七提取物的给药剂量）。由于三七皂苷成分暴露水平的高低取决于其t1/2的长短，围绕三七提取物所含的皂苷成分和在粪样中测到的脱糖降解产物所开展的“构-代关系”分析发现，这些化合物在t1/2上出现的差异主要来自它们在清除率（CLp,tot）上的显著差异，而在表观分布体积（VSS）上的差异相对较小，该结果提示体内清除途径是进一步研究的重点，它是影响机体对三七物质暴露的另一个重要因素。对口服三七提取物后的大鼠胆汁、尿、粪样品分析结果表明，涉及主动分泌的胆汁排泄途径是大多数化合物迅速且主要的清除途径，除少数化合物外尿排泄是一个较缓慢的相对次要清除途径。另外，I期氧化代谢和在肝等大鼠组织中发生的脱糖水解也是次要的清除途径。
(6)冰片的大鼠药动学研究
本项目采用冰片开展的大鼠药代动力学研究表明，p.o.给药（10 mg/kg）后，龙脑的药时曲线出现双峰现象，约10 min到达第1个峰，5-6 h到达第1个峰，达峰血药浓度均较低（Cmax），仅为10 ng/mL左右。i.v.给药（2 mg/kg）后，龙脑的药时曲线未在5-6 h出峰，其消除半衰期（t1/2）和体内平均滞留时间（MRT）均不超过1 h，体内清除率（CL）为4.66 ±0.86 L/h/kg，其稳态表观分布容积为（Vss）3.54 ±0.85 L/kg。龙脑的口服生物利用度为2.4%。
(7)围绕复方丹参方，针对方剂配伍的可能影响，开展调控中药活性组分体内暴露的相关研究
本部分围绕组成复方丹参方的单味中药的“药代 markers”开展工作，鉴定那些可能对调控这些“药代markers”体内暴露水平其关键作用的转运体蛋白，研究影响这些蛋白后对上述中药的“药代markers和体内非PK markers活性成分的影响，为进一步揭示方剂配伍的科学内涵创造条件。
1)介导丹参素肾主动分泌转运体蛋白的鉴定，研究丹参素体内暴露的调控方法：应用体外研究技术鉴定了介导丹参素在大鼠肾脏主动分泌的转运体蛋白（包括Uptake transporters和Efflux transporters）。在大鼠体内通过影响此蛋白，显著改变了丹参素的体内暴露。
2)影响三七皂苷组分体内暴露的肝脏转运体鉴定：本项目应用体外研究技术鉴定了介导三七皂苷随大鼠胆汁快速排泄的肝脏转运体蛋白（包括Uptake transporters和Efflux transporters）。
3．茵陈蒿汤体内过程研究
(1)茵陈蒿汤入血成分分析
1)茵陈蒿汤体内成分分析
利用已建立的UPLC-Q-TOF/MS分析方法，通过对最佳采血时间、最佳血清样品处理方法等条件的筛选，建立了大鼠口服茵陈蒿汤后血中移行成分总离子色谱指纹图，确立了21个血中移行成分并完成了化合物的结构鉴定。在此基础上，通过对大鼠口服茵陈蒿汤全方、缺味方、单味药的体内外的总离子色谱图中各色谱峰的保留时间、质荷比的比较，明确了各移行成分的生药归属，包括有来源于茵陈蒿、茵陈蒿汤生药中原型成分吸收入血形成；来源于栀子，为体外成分原型吸收入血形成；来源于大黄，为体外成分原型吸收入血形成；由茵陈和栀子共同产生；由茵陈和大黄共同产生；绿原酸的衍生物或同分异构体；是6，7-DME的代谢物。
2)茵陈蒿汤组分配伍对入血成分的影响研究
以茵陈蒿汤体内成分分析中所建立的血浆样品处理及分析方法对大鼠口服茵陈蒿汤不同配伍即全方、缺味方及单味方冻干粉后的血清样品进行分析，研究不同配伍对生药中成分吸收性质的影响及配伍后血中移行成分实际。通过分析发现不同配伍样品的血中移行成分的体内曝露情况各不相同。全方配伍从体外45个成分中有选择地吸收与茵陈蒿汤保肝、利胆作用直接相关的27个成分，以控制和保证方剂的基本作用方向，其数量之和不等于中药方剂为存在形式的茵陈蒿汤的血中移行成分数量，说明方剂不等同于组成药物的简单加和。
中药化学成分的复杂性，决定了中药作用的多效性，实际应用中通过一定的配伍原则形成方剂，以此为主要用药方式来发挥中药的预防和治疗作用。一定的配伍环境决定了中药功效发挥的方向，配伍的目的在于调整药物的偏性，增强或改变药物的原有功能，减缓或消除药物对人体的不良影响，使各具特性的药物个体，组成一个有机整体，以符合中医辨证论治的要求，达到预防和治疗疾病的目的。21个血中移行成分中有8个成分，只有在茵陈蒿汤全方配伍的情况下才能被机体吸收，而这8个成分均具有较强的利胆保肝活性。说明以湿热黄疸为主治症候的茵陈蒿汤口服后，机体选择性吸收具有保肝利胆活性的成分入血发挥药效，达到治疗疾病的目的，从血清药物化学的角度阐释了“方剂为有制之师”的中医药理论。
君药茵陈蒿的主要活性成分6,7-二甲氧基香豆素在全方中同单独给予茵陈蒿相比，Cmax有所增加，Tmax减小，同时T1/2显著延长，表明茵陈蒿汤全方用药时，能够适度加快6,7-二甲氧基香豆素的吸收，使得6,7-二甲氧基香豆素在体内消除速度减慢、滞留时间延长，明显提高药物生物利用度，有利于药物在体内持久的发挥药效。京尼平苷为臣药栀子所含成分，茵陈蒿汤全方给药较给予茵陈蒿配伍栀子，大鼠体内京尼平苷的药代动力学行为发生明显变化，即京尼平苷的Cmax有所增加，Tmax减小，同时T1/2显著延长，说明配伍大黄能够加速京尼平苷吸收和减慢其体内消除速度，使京尼平苷延长体内药效时间。对茵陈蒿汤不同配伍的样品进行分析，研究结果表明单味药中含有的成分只有在配伍的条件下才能够被吸收，包括新绿原酸或异绿原酸、栀子苷B、京尼平龙胆二糖甙、异鼠李素-3-0糖苷、异鼠李素-3-O-半乳糖苷等。这些成分都具有较强的保肝利胆活性，说明肝损伤大鼠对茵陈蒿汤在配伍的条件下选择性的吸收具有较强保肝利胆活性的物质进入血液循环。上述结果表明，全方配伍达到了选择性地吸收有特定功用的有用成分，减少无用成分的吸收，且能够明显提高主要活性成分的横无理拥堵，有利于其在体内持久发挥药效，以保障方剂的整体效果。
为了比较研究正常与疾病模型中主要活性成分的体内过程差异，本项目采用CCL4损伤动物模型研究方剂配伍对茵陈蒿汤血中移行成分影响研究。结果表明，肝损伤大鼠比正常大鼠多选择性吸收了15个成分，且有6个成分只有在全方配伍时才吸收入血，说明CCL4干预大鼠促进了对茵陈蒿汤选择性吸收具有保肝护肝效果的活性，从而达到治疗目的，说明了方剂配伍的科学性。
(2)方剂配伍对茵陈蒿汤体内主要成分的药代动力学的影响
当茵陈蒿汤全方给药时，其6,7-二甲氧基香豆素在大鼠体内的药动学行为兼有了大黄和栀子的双重优势，与单独给予茵陈蒿相比，6,7-二甲氧基香豆素的Cmax有所增加，Tmax减小，同时T1/2显著延长，Ke显著减小，表明茵陈蒿汤全方用药时，能够适度加快6,7-二甲氧基香豆素的吸收，使得6,7-二甲氧基香豆素在体内消除速度减慢、滞留时间延长，明显提高药物生物利用度，有利于药物在体内持久的发挥药效。以上从方剂主要活性物质动态量变角度提示茵陈蒿汤配伍的的合理性。
栀子配伍茵陈后，大鼠体内京尼平苷的药代动力学行为发生明显变化，即京尼平苷的AUC加大，Cmax有所增加，Tmax减小，同时T1/2显著延长，Ke显著减小。配伍大黄，虽然生物利用度有所变小，但能够加速京尼平苷吸收和减慢其体内消除速度，使京尼平苷延长体内药效时间。全方情况下，兼顾了配伍茵陈蒿的二次吸收产生带来的AUC加大，以及配伍大黄带来的吸收快，消除慢的优势，从一个侧面再次阐明茵陈蒿汤配伍的潜在规律。
(3)茵陈蒿汤中主要活性成分6,7-二甲氧基香豆素大鼠体内代谢产物分析
&结果表明，6,7-二甲氧基香豆素在粪便中无排泄。6,7-二甲氧基香豆素大鼠体内四个代谢产物分别为scopleletin，isoscopleletin, isofraxidin, 和 fraxidin。已有研究表明四个代谢均具有良好的抗氧化，抗炎和抗病毒活性，故可以认知6,7-二甲氧基香豆素广谱的生理活性和保肝作用部分与其代谢产物的活性有一定关系，进一步说明6,7-二甲氧基香豆素是茵陈蒿汤主要有效成分，同时本研究为体内直接作用物质的代谢研究及配伍规律奠定物质和方法学基础。
(4)基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤配伍的药代动力学研究
茵陈蒿汤不同配伍组合样品给予CCL4氧化性肝损伤大鼠后，6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷和大黄酸在病理状态下的药代动力学行为变化，揭示方剂配伍对方剂体内主要活性物质的体内代谢行为的影响规律和作用方式，从而阐明方剂配伍用药的合理性和科学性。
1)6,7-二甲氧基香豆素（6,7-DME）药代动力学
茵陈蒿配伍栀子给予大鼠后，6,7-DME药代动力学行为与单独给予大鼠茵陈蒿相比，虽然生物利用度（AUC）显著下降，但Tmax有所延长，而消除相T1/2beta改变不明显，证明栀子能够在不影响6,7-DME消除速度的情况下减缓6,7-DME的吸收，有利于其缓慢释放药效，进一步观察茵陈蒿配伍大黄给药后，与单独给予大鼠茵陈蒿相比Tmax显著延长，T1/2beta显著缩短，展示大黄能减慢6,7-DME消除，表现出天然的缓释作用，同时加快其消除，避免其体内长时间停留所引起的器官毒性。当给予大鼠茵陈蒿汤后，与其它给药形式相比，AUC和Cmax显著提高，且Tmax显著延长，T1/2beta适中，证明茵陈蒿汤全方给药时6，7-DME的生物利用度显著提高，且表现出慢吸收快消除的作用优势，更有利于茵陈蒿汤特色治疗作用的表达。
2)京尼平苷（Geniposide） 药代动力学
栀子配伍茵陈蒿给予大鼠后，京尼平苷药代动力学行为与单独给予大鼠栀子相比，AUC和Cmax显著提高， Tmax无明显变化，而消除相T1/2beta显著延长，证明茵陈蒿能够在不影响geniposide吸收速度情况下，显著提高其生物利用度，同时延长其体内作用时间，为其持久地发挥药效提供前提。进一步观察栀子配伍大黄给药后，与单独给予大鼠栀子相比，虽然AUC和Cmax显著下降，降低京尼平苷的生物利用度，但其Tmax显著缩短，T1/2beta的改变不明显，阐释栀子能够加快京尼平苷的机体吸收，为其快速发挥药效提供可能。当给予大鼠茵陈蒿汤后，与其它给药形式相比，AUC和Cmax显著提高，且Tmax缩短，T1/2beta显著延长，证明茵陈蒿汤全方给药时geniposide的生物利用度显著提高，同时兼顾配伍茵陈蒿和大黄的双重优势，既快吸收慢消除的作用特点，更有利于茵陈蒿汤快速持久治疗作用的发挥。
3)大黄酸（Rhein） 药代动力学
大黄配伍茵陈蒿给予大鼠后，大黄酸药代动力学行为与单独给予大鼠大黄相比， AUC和Cmax有所下降， Tmax无明显变化，而消除相T1/2beta显著缩短，证明茵陈蒿能够在不影响大黄酸吸收速度情况下，加快其排泄，或许可以避免体内停留时间过长引起的器官毒性，实现安全用药。进一步观察大黄配伍栀子给药后，与单独给予大鼠大黄相比， AUC显著升高， Tmax有所延长，而消除相T1/2beta显著缩短，证明栀子能够提高大黄酸生物利用度，在不影响其吸收速度的前提下，加快其排泄过程，实现安全有效用药要求。当给予大鼠茵陈蒿汤后，与其它给药形式相比，AUC显著提高，且Tmax显著延长，T1/2beta显著缩短，证明茵陈蒿汤全方给药时大黄酸的生物利用度显著提高，同时兼顾配伍茵陈蒿和栀子的双重优势，既慢吸收快消除的作用特点，更有利于大黄酸安全有效治疗作用的表达。
我们从茵陈蒿汤君、臣、佐三味不同的中药各选择其入血成分，即茵陈蒿中的6,7-二甲氧基香豆素（君），栀子中的栀子苷（臣），大黄中大黄酸（佐）三个体内直接作用物质进行成分配伍研究，通过比较经PCA处理的不同给药大鼠生理生化指标数据我们发现CCL4模型大鼠较正常大鼠在生理生化指标方面显示出了较大的差异性，而各给药组对这种差异均起到了一定的回调作用，其中6,7-二甲氧基香豆素+栀子苷+大黄酸的全成分给药组效果优于两成分组及单成分组，两成分组中，6,7-二甲氧基香豆素+大黄酸优于6,7-二甲氧基香豆+栀子苷优于栀子苷+大黄酸，单成分中，6,7-二甲氧基香豆素优于大黄酸优于栀子苷，在两成分与单成分的比较中，6,7-二甲氧基香豆素单成分对生化指标的回调效果优于栀子苷配伍大黄酸的两成分组，提示我们茵陈蒿有效成分新组方中6,7-二甲氧基香豆素对CCL4致肝损伤起主要治疗作用；配以栀子苷可加强其治疗作用（增效）；再配以大黄酸可发挥其佐助之功（增效），三药相须为伍，相使为用，彼此相升以助药力，从一定程度上阐明了成分配伍意义，揭示其配伍规律，并为方剂配伍规律研究在方法学上提供借鉴。
4．参麦方体内过程研究
在大鼠进行的神威参麦注射液药动学研究表明，5 ml/kg i.v.给药神威参麦注射液后，在大鼠体内共测到了12个人参皂苷化合物。其中，二醇型人参皂苷GRa3、GRb1、GRb2、GRd在大鼠体内的暴露较高，消除半衰期&10 h，GF2暴露较低，消除半衰期（t1/2）为0.79 ± 0.37 h。三醇型人参皂苷GRe、GRf、GRg1、F1/Rh1和20-g-Rf在大鼠体内暴露较低，消除半衰期（t1/2）& 1 h，GRg2的t1/2为7.81 ± 3.46 h。红参特征性人参皂苷GRg3在大鼠体内5 min的血药浓度（Cmax）分别为4.73±0.50μM；体内暴露水平AUC0-24h分别为2.56±0.6μM∙h；消除半衰期（t1/2）在大鼠上分别为7.81±3.46 h；大鼠体内清除率分别为（CL）100±31 mL/h/kg，其分布体积分别为（VSS）156±94 mL/kg。
(六)共性关键技术与技术平台
本项目以组分配伍创制中药新药的关键技术环节为研究重点，发展了一系列先进技术，从化学、药理和计算预测三方面搭架了相应的技术平台，并开发了两个数据库。共性关键技术组成如下图所示。
1．组分分离与制备技术
本项目在综合应用多种现代分离技术的基础上，采用全面分离与目标分离相结合的分离策略，发展完善了中药组分分离与制备技术，并制定了一系列的标准规范，实现了标准组分的批量获取，确保了提取和分离制备过程的标准可控。其技术特征包括：采用多种材料和分离模式，实现中药组分的全面分离、可控分离与有序分离，以满足高通量筛选和大规模活性评价的要求；采用高分辨率的化学组成表征方法与自动化的数据处理方法，实现了依靠分子量、紫外光谱、药材来源、色谱保留时间等信息表征化学组成，从而降低了中药组分化学组成鉴定的工作量；将中药组分制备技术与成分分析相耦合，有利于大规模、快速制备中药组分，为有效组分筛选与活性评价提供样品资源。本项目所建立的组分制备方法采用标准化的色谱分离模式制备方剂组分，因此具有良好的重现性。当发现某个组分具有较好的生物活性后，能够高效制备出所需的有效组分。当化合物结构已被推定时，可通过商业途径直接购买纯化合物进行进一步活性评价。因此，该方法有助于提高发现方剂有效组分的效率。
2．方剂化学组成快速鉴定技术
近年来，高效液相串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）已逐渐成为方剂物质基础研究的有力手段。但是基于常规HPLC的分析方法所需时间比较长，对方剂等复杂化学物质体系的分离时间一般在30min以上。随着色谱技术的发展，超高效液相（UPLC）技术大大的缩短了分析时间，同时还提高了峰容量和灵敏度。此外，串联飞行时间（TOF）质谱提供的精确分子质量对于化合物以及裂解碎片的鉴别和分析非常有帮助。因此，UPLC-QqTOF-MS/MS技术非常适合于方剂化学物质基础研究。本项目研究建立了基于超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）、液相色谱－质谱联用（LC-MS）等技术的方剂化学组成快速鉴定技术。这类技术充分利用了质谱分析数据，能快速推断方剂中主要化合物结构，实现了方剂化学信息的快速获取，具有分析速度快、灵敏度高、分辨率高等特点，适用于方剂复杂化学物质体系的全面分析。
3．中药体内微量物质分析技术
在中药多成分药代动力学研究所需的众多研究技术中，中药体内微量物质多成分同时分析是首先要突破的瓶颈环节。液-质联用分析技术的迅速发展大大地促进了中药多成分药代动力学研究的开展。然而，由于液-质联用技术自身的弱点和中药药代分析的复杂性，简单地将二者相结合常常不能完全满足高水平的研究要求。
本项目发现了质谱的“低浓度电解质效应”（LC-Electrolyte Effects），创建了“脉冲梯度洗脱色谱技术”（Pulse Gradient Chromatography）。“低浓度电解质效应”（LC-electrolyte effects；该英文术语已被国际接受）是指：当在流动相中使用极低浓度电解质后，会产生一种十分有利于液-质联用检测的效果：ESI-质谱的检测响应获得显著提高，且复杂生物样品的基质成分引起的干扰（基质效应）被大大减弱。质谱学概念，它是指为满足定量分析的要求，在一定的被测化合物浓度范围内保持ESI效率不变的能力。“低浓度电解质效应”从三方面显著改善ESI-质谱检测，即：提高检测响应、抗样品基质干扰和提高定量上限，丰富了相关质谱学理论。
脉冲梯度色谱技术的原理是采用双溶剂系统，进样后首先采用几乎是水的流动相将被测化合物保留在反相色谱柱的柱头，直至极性基质成分和样品中有机溶剂从柱上完全洗脱掉，随后再用洗脱能力强的流动相以最快的速度将被测化合物从柱上洗脱下来，以达到压峰、抗基质效应和抗溶剂效应的目的。脉冲梯度色谱技术是通过让被测化合物“先停一停再冲刺”来实现与其它物质的分离，而传统色谱洗脱技术是利用被测化合物与其它化合物“跑的快慢不同”来实现分离。
4．血中移行成分辨析技术
该技术从口服方剂给药后血清中移行成分分析、分离、鉴定及药效相关性研究入手，阐明方剂的体内直接作用物质及其动态规律，从而揭示方剂体内直接作用物质的存在情况、所处的位置以及新成分产生情况、各成分相互关系、主要治疗成分的动态（参数）规律等阐明配伍的本质或内在规律，即从体内直接作用物质运动（产生、代谢、量变）层面阐明方剂配伍规律。通过分析口服给药后血清中成分，确定中药方剂的体内直接作用物质，将成为快速、准确的研究确定中药方剂药效物质基础的有效途径，为方剂配伍规律研究提供明确的、数量有限的研究载体。
5．方剂药物代谢组学研究技术
代谢物组学作为后基因时代的一种全新的组学技术，以生物体内低分子量物质的动态规律变化来表征生物体的生理病理变化趋势，最终，通过还原相关联生物事件揭示生物体的病理生理变化实质和机理所在。方剂是在中医理论指导下，依据饮片的药性，按照君、臣、左、使关系配伍形成的“有制之师”。配伍是方剂中药物的核心关系，而配伍规律是理、法、方、药的核心内容，是治病的核心理论和技术，对它的理解和发展直接决定方剂的有效性，亦直接决定组方设计的合理性，更决定临床疗效及中药创新药物水平。
方剂能发挥符合证候治疗要求的效果，取决于方剂药物质与量的关系，不同质与量药物的组合，就会形成不同方剂，因此也就会产生对应与证候的不同治疗效果。方剂配伍规律的研究不能停留于配伍过程中饮片层面药物质与量变化（称其谓表观配伍apparent compatibility），更应关注药物成分吸收的影响，注重体内直接作用物质的变化，及与之相应的效应变化规律（称其谓内在配伍intrinsic compatibility）。基于上述理念，认为方剂配伍规律研究必须以中医理法方药理论为指导，在正确认识方剂的配伍意义和方剂化学研究（constituents in vitro and in vivo）的基础上，利用现代多维联用色谱技术，研究不同配伍情况下方剂口服后体内成分及其动态变化规律，阐明方剂成分的体内命运，阐释药物代谢层面的配伍意义；同时利用代谢组学对整体代谢轮廓的描述来评价复杂性多元（方剂成分及代谢产物）输入的调整带来整体效应的变化，克服有限指标的局限，最大限度从对证侯的整体效应变化层面揭示配伍意义。
基于中药血清药物化学的方剂药物体内代谢和代谢组学研究，即可从体内成分及其代谢产物的变化规律层面阐明配伍规律，同时结合代谢组学对整体代谢轮廓的描述来评价复杂性多元（方剂成分及代谢产物）输入的变化带来整体效应的变化，克服有限指标对效应评价的局限，最大限度地体现方剂对证侯的整体作用。二者的结合系统地从PK-PD结合角度解读方剂配伍对体内直接作用物质的影响，以及体内直接作用物质与整体效应的关系。这一研究途径或方法可称为中医方剂药物代谢组学（pharmacometabolomics of chinmediformulae），即从中药方剂体内多成分分析入手，结合代谢轮廓与成分的关系分析，揭示方证相应及成分效应相应的配伍关系，多成分量-时-效相互关系，评价方剂的ADME/T的药理学特性，解决方剂设计、临床合理用药及基于经方的药物发现等科学问题的应用学科。
采用上述技术开展了茵陈蒿汤代谢组学研究，结果表明预防给予6,7-二甲氧基香豆素后，使动物状态在一定程度和一定方向上远离模型状态，配伍京尼平苷或大黄酸后增加了其预防作用，但均是通过其他途径起到肝损伤发生的作用。配伍京尼平苷和大黄酸形成茵陈蒿汤有效成分新组方后综合干预模型发生的各因素，直接阻断动物机体从正常状态向疾病状态的发展，起到预防疾病发生的作用。单用京尼平苷或大黄酸，或两两配伍在一定程度和方向上能抑制模型的发生和发展，但只有三药配伍形成新组方后才能全面的干预模型发生的各因素，防止肝损伤的发生。
6．组分药性预测技术
本研究运用所建立的四性、五味的贝叶斯网络模型，预测了部分中药活性组分的药性，并探讨了组分药性与饮片药性的关系。结果证明，贝叶斯网络学习算法可用于预测中药有效组分的药性。预测结果在一定程度上体现了组分药性与饮片药性之间的关联关系。中药饮片的药性是对其所含有效组分药性的复杂叠加，组分药性与饮片药性相比，既有继承性又有涌现性。然而，由于目前药理实验数据的有限性，预测结果也难免存在一定偏差。随着相关研究的不断深入，分类模型和预测结果将进一步完善和准确。
(七)总结组分配伍创制现代中药新模式
方证明确、疗效可靠的经典小复方，具有临床基础好、开发风险小成功率高等特点，是创新中药新药发现的重要来源之一。本研究在组分配伍思路指导下，以中医学理论为基础，遵循传统方剂的配伍理论与原则，在明确方剂药效物质和作用机理的基础上，以组效关系为基础，遵循“突出主效应，兼顾次效应，降低副效应”的的效应配伍策略，以中药标准组分库表征的组分化学和活性信息为基础，采用现代中药组分提取、分离、分析等关键技术，制定提取工艺，提取方剂标准组分；以动物整体研究为重点，细胞水平为特色，开展整体、器官、细胞、分子等药理层次的活性评价，明确组效关系；并根据组效关系，优化工艺，同时在多个药理水平上进行组分配伍作用及机理研究，明确组分配伍协同增效，拮抗减毒关系，依据上述研究，采用计算机辅助组分配伍优化设计技术，对组分配伍组方进行优化，以现代分析技术为依托，研究组分配伍对药物代谢的影响，基本明确组分的体内过程，研制物质基础、作用靶点和机制相对明确的组分配伍创新中药。