39产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定
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39产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定
；旦坐型墅鱼丝里■团圆盈；黔熊；《髦；产锔蛋白酶茅孢杆菌的分禹筛选与鉴定；韩学易，陈惠＋，胥兵，赖欣；（四川农业大学生命科学与理学院，四川雅安６２５０；厂、霭；摘要：从长期堆积腐烂羽毛的土壤中分离出一株能降解；关键词：角蛋白酶；芽孢杆菌；分离；鉴定中图分类号；文献标识码：Ｂ；文章编号：１６７３―１０８５（２００８）４―００；１．１；羽毛是自然界中最丰富的角蛋
。乏彰：旦坐型墅鱼丝里■团圆盈黔熊《髦产锔蛋白酶茅孢杆菌的分禹筛选与鉴定韩学易，陈惠＋，胥兵，赖欣（四川农业大学生命科学与理学院，四川雅安６２５０１４）厂、霭摘要：从长期堆积腐烂羽毛的土壤中分离出一株能降解羽毛角蛋白的细茵，经形态学观察和生理生化实验，初步鉴定为短小芽孢杆菌，且命名为短小芽孢杆菌Ｂ一１５。关键词：角蛋白酶；芽孢杆菌；分离；鉴定中图分类号：￥８５２．６１＋６文献标识码：Ｂ文章编号：１６７３―１０８５（２００８）４―０００７―０３角蛋白酶在国内还未见报道。１材料与方法１．１羽毛是自然界中最丰富的角蛋白材料，含有大量潜在有用的蛋白质和氨基酸。据测定，羽毛角蛋白的粗蛋白含量约在８０％以上，各种氨基酸含量在７０％以上，并且含多种动物所需的必需氨基酸，若样品的采集四川农业大学养鸡场处腐烂羽毛及土样、雅安市菜市场处腐烂羽毛及土样。１．２羽毛处理１．２．１能加以妥善处理．是一种良好的饲料蛋白来源１１Ｉ。随着集约化养殖业的快速发展。有大量的家禽羽毛作为废弃物出现在我们的生活中，开发利用家禽羽毛作为一种非常规蛋白质资源受到人们的关注，因为它不仅可以改善环境，还可以变废为宝。使用微生ＮａＯＨ处理羽毛将鸡毛用０．０５％的ＮａＯＨ溶液煮沸３０ｍｉｎ，洗至中性，烘干备用。１．２．２ＳＤＳ处理羽毛用洗涤剂清洗鸡毛，清水洗净，烘干后以２％的ＳＤＳ于６０℃处理４ｈ，洗净，烘干备用。１．２．３物角蛋白酶能提高羽毛饲料的营养价值，用生物技术处理羽毛废物既可节省能源、保护环境，还可得测酶活用羽毛粉先将鸡毛用０．０５％的到优质的饲料产品．结合其他微生物共发酵方法可弥补发酵产物的不足。羽毛降解产物可用于饲料工业．如同其他糖质原料如纤维素、淀粉质材料等农业下脚料并用于饲料生产。有望获得高蛋白和碳水ＮａＯＨ溶液煮沸３０ｍｉｎ．然后用水充分冲洗干净，曝晒３ｄ，再于烘箱中６０℃烘７２ｈ，用粉碎机粉碎，过１００目筛。１．３培养基㈤１．３．１化合物的饲用产品。该过程可通过共发酵等方法实现【２，一１。目前国内对微生物降解角蛋白的研究还基本停留在产角蛋白酶真菌和放线菌的初步研究，因此富集培养基１牛肉膏０．５％，蛋白胨ｌ％，氯化钠０．５％，ＳＤＳ处理的完整羽毛ｌ％，ｐＨ７．４～７．６。１．３．２富集培养基２（ｇ／Ｌ）磷酸氢二钾１．５９，七水合硫酸镁０．０２５９，氯化钙０．０２５９，七水合硫酸亚铁Ｏ．０１５９，七水合硫酸锌０．００５９，经ＮａＯＨ处理的羽毛１０９。本课题组着手研究产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选，并预期筛选得到产角蛋白酶芽孢杆菌的高产菌株。经过多次分离纯化，从土壤中分离得到一株能高效降解羽毛角蛋白的细菌，经形态学观察和生理１．３．３富集培养基３、４、５富集培养基３、富集培养基４、富集培养基５与富集培养基２配制相同，但ＮａＯＨ处理的羽毛分别替换为未处理羽毛、ＳＤＳ处理的羽毛和ＮａＯＨ处理的羽毛。生化鉴定为短小芽孢杆菌。目前，短小芽孢杆菌产面丽丽五丽乏磊―巨盈墨囵■化钠０．５，琼脂粉２，ｐＨ７．４～７．６。１．３．５复筛培养基（ＬＢ培养基）（％）室佥盟鲎２ＱＱ墨：垒处理用作对照。酶活定义：Ａ２８０值每增加０．１为胰蛋白胨１，１Ｕ，重复３次取平均值。２结果与分析２．１菌株的筛选经过４次富集培养，得到６种终富集培养液，从这６种培养液中选取羽毛降解速度最快、降解最彻底的培养液进行平板稀释分离，得到酵母粉０．５，氯化钠１。琼脂１．５，ｐＨ７．５。１．３．６其它培养基配法见参考文献。１．４主要仪器ＬＲＨ一２５０生化培养箱、电热恒温水浴锅（ＨＨＳ）、７２２Ｓ分光光度计、ＵＶ一２４０１紫光分光广度计、ＴＧＬ一１６Ｃ台式离心机、Ｓｉｇｍａ３Ｋ１８冷冻离心机、尼康ＹＳ２一Ｈ生物显微镜、ＰＢ２０３一Ｎ电子精生长良好的３９个单菌落，依次编号为Ｌ１～Ｌ３９。通过摇瓶复筛发现各菌株都能一定程度地降解羽毛．但比较上清液中的蛋白质含量和酶活力．可以看出菌株Ｌ１５发酵液上清液中可溶性蛋白质增加最多．酶活力最高，因此选用菌株Ｌ１５进行进一步研究。表ｌ中分别列出了摇瓶复筛各菌株上清液中蛋白质含量和以羽毛粉为底物时所测的酶活力。表１各菌株降解羽毛能力的比较菌株上清液蛋白ｉｔｌ活Ｄ菌株上清液蛋一酶活力菌株上清液蛋白酶活力Ｉ。１Ｌ２Ｌ３０．０１１０．０５４０．０３２Ｏ．０２２０．００ｌ０．０７５０．００４０．０３５Ｏ．（）９８０．０７４Ｏ．１２４０．０１３０．０４７２．１１．１１．８２．５２．２１．５２．６１．４２．６０．８５２．９ｌ＿５１．８Ｌ１４Ｌ１５Ｌ１６Ｌ１７Ｌ１８Ｌ１９Ｏ．０８８０．１１０Ｏ．００８０．００ｌ０．０３６０．０２５０．１３５０．０１６Ｏ．０８９Ｏ．０２２０．０６９０．０３３０．０１５２．３３．９Ｏ．８７１．１１．７１．３２．８１．５２．９１．７１．４０．２３１～１２７Ｌ２８１２９Ｌ３０１３ｌＬ３２１３３Ｌ３４１３５Ｌ３６１３７Ｌ３８０．００５Ｏ．０６２０．０７６０．０５０１．２１．８２．１０．５５密天平、１０１Ａ一２电热鼓风干燥箱等。１．５方法１．５．１初筛将样品混合后在５０℃下烘干。称取混合土样５９，加１００ｍｌ水煮沸１０ｍｉｎ，取上清液ｌｍｌ于富集培养基ｌ中．３０℃、１２０９／ｍｉｎ摇床培养至羽毛完全降解。取富集培养基１中培养液分别于富集培养基２、３中。３０℃、１２０９／ｒａｉｎ摇床培养至羽毛降解，再将上述培养液分别在富集培养基３、４、５中培养。选取羽毛降解速度最快、降解最彻底的培养液涂布于初筛培养基，得到单菌落，并在初筛培养基上划线进行分离纯化。１．５．２摇瓶复筛挑取初筛单菌落于发酵培养基ＭＬ５１．６Ｌ７Ｌ８Ｌ９Ｌ１０Ｌ１１Ｌ１２Ｌ１３０．１０６‘３．３０．０２１。０．０３ｌ０．０４２０．０１２０．０１８Ｏ．００８０．０５６１．１‘０．８１．０２．１１．９２．０１．１１．５中发酵培养，保存酶活最高菌株。１．６菌种鉴定１．６．１１２０Ｌ２ｌＬ２２Ｌ２３１２４Ｌ２５Ｌ２６茵落形态观察将菌株Ｂ一１５在牛肉膏蛋白胨平板卜进行划线分离．于３７℃下恒温培养１８ｈ，肉眼观察菌落形状、颜色、表面质地和菌落边缘。１．６．２茵体形态观察将菌株Ｂ―１５制片进行革兰氏染色后，在光学显微镜下放大１００倍后观察菌体的大小、形状及其特殊构造。１．６．３１３９，Ｏ．０２４２．２菌株的鉴定生理生化反应测定将菌株Ｂ―１５进行一２．２．１形态特征菌株Ｌ１５呈直杆状，两端钝圆，为有芽孢的短杆菌，芽孢呈椭圆形。呼吸类型为需氧呼吸，有运动性，革兰氏染色呈阳性。菌落的形态学特征见表２。镜检照片见图ｌ。表２菌落形态学特征菌落特征Ｌ１５形状系列生理生化实验，对其加以鉴别。１．７酶活的测定方法【删１．７．１蛋白质含量的测定将培养液离心．用Ｆｏｌｉｎ酚法测定上清液的蛋白质含量．未经接种的培养基也按上述方法取样ｉ贝０定作为对照，比较上清液中蛋白质含量的变化。１．７．２圆形表面光滑，有微皱褶状突起不整齐表面特征以Ｇｒａｄｉｓａｒ边缘光学特征颜色以羽毛粉为底物测定酶活（２０００）所描述的方法为基础。稍做修改。将发酵液过滤离心。取ｌｍｌ上清液。加入２．ＯｍｌＯ．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ／ＨＣＩ缓冲液，然后加入１０ｍｇ羽毛粉，在３７。Ｃ恒温水无光泽，不透明乳白或淡黄色２．２．２生理生化特征芽孢杆菌个体微小，形态特浴锅中反应，定时取出用力振荡，ｌｈ后加入２．０ｍ１１０％ＴＣＡ终止反应，１００００９、４。Ｃ离ｊ心１５ｒａｉｎ，征简单，在分类鉴定中单凭形态学特征是不能达到鉴定的目的，故必须借助许多生理生化特征来加以鉴别。由于芽孢杆菌对各种生理生化实验的不同反取出上清夜２８０ｎｍ比色测定。反应前即加ＴＣＡ的?｝―――――――――――――――――――一！卜―――――――――――――――――――一旦坐型墅垫丝呈■臣雹团口＿◆培养摹和发酵培养基是牛肉膏蛋白胨培养基．而姚淑敏等【８】报道中采用的发酵培养基则是无机盐培养基。由于本文筛选的是羽毛降解菌，为了使羽毛成为该菌的特异性底物，消除细菌利用其它ｃ源和Ｎ源的可能，因此本文最终采用了无机盐培养基。得到了一株能高效降解羽毛角蛋白的细菌菌株Ｂ一１５。本文从长期堆积腐烂羽毛的土壤中分离得到图１菌株Ｌ１５的显微镜镜检形态特征３９株能降解羽毛角蛋白的细菌，编号Ｌ１～Ｌ３９。通过对这些菌株降解能力的对比实验．菌株Ｌ１５降解羽毛的能力最为突出。通过对菌株Ｌ１５的形态观察发应，显示出各类酶系不同，因此，所反映的结果也比较稳定，可作为鉴定的重要依据。菌株Ｌ１５的生理生化特征见表３。表３菌株Ｌ１５的生理生化特征现：菌株Ｌ１５呈直杆状，两端钝圆．为有芽孢的短杆菌，芽孢呈椭圆形，革兰氏染色呈阳性，再通过生理生化特征实验，初步鉴定菌株Ｌ１５为短小芽孢杆菌。且命名为Ｂ一１５。参考文献：【ｌ】杨建强、汤国营．角蛋白酶研究发展叨．生物技术通讯．２００５，１６（２）：２０１―２０３．【２】李江，姚斌，范云六．微生物角蛋白酶的分子生物学研究进展．工业微生物．２００６，３６（３）：３７＿４２．【３】蔡成岗，郑晓冬．角蛋白酶的来源、理化性质与生物工程研究进展．食品与发酵Ｔ．业．２００６．３２（４）：１１１－１１４．【４】王晶，陈丽，曹张军等．一株羽毛角蛋白降解菌的分离与鉴注：“＋”表示有该特征或可利用该物质。“一”表示不具有该特征或不利用该物质。定．农业环境科学学报．２００７．２６（增刊）：１０５―１０９．【５】东秀珠，蔡妙英等编著．常见细菌系统鉴定手册【Ｍ．北京：科学Ｈ｛版社．２００１。第一版．【６】Ｇｒａｄｉｓａｒｍｙｃｅｓ综上所述。从形态特征和生理生化特征的几个方面，菌株Ｌ１５都与《伯杰细菌鉴定手册》中描述的芽孢杆菌属中的短小芽孢杆菌相似。故菌株Ｌ１５初Ｈ，Ｋｅｒｎｓ，ＦｒｅｉｄｒｉｃｈＪ．Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅｏｆｄｏｒａｔｏ－ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｅｈｎ０１．２０００，５３：ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ［Ｊ１．Ａｐｐｌ步鉴定为短小芽孢杆菌。并命名为Ｂ一１５。３结论１９６－２００．【７】郭蔼光，郭泽坤．生物化学实验技术．北京：高等教育出版社．２００７．第一版．【８】姚淑敏，颜振兰．羽毛角蛋白酶生产菌的选育及产酶条件研究．曲阜师范大学学报．２００１。２７（３）：８１―８３．从芽孢杆菌筛选的参考资料中，我们可以得到不同的筛选方法．其中对富集培养基和发酵培养基的选择有很大区别，如王晶等１４１报道中采用的富集ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅ―ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＢａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓＢ一１５ＨＡＮＸｕｅ―ｙｉ，ＣＨＥＮＨｕｉ’，ＸＵＢｉｎｇ，ＬＡＩＸｉｎ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｂｓｔｒａｃｔ：ＡＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｏａｎｆｒｏｍ６２５０１４，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）ｓｏｉｌａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｉｎｏｕｒｓｔｒａｉｎｏｆｎｅｗｆｅａｔｈｅｒ――ｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｌａｂ．Ａｆｔｅｒｏｂｓｅｒｖｉｎｇｔｈｅｓｈａｐｅｏｆｆｅａｔｕｒｅａｎｄｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｎａｍｅｄａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ＢａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓＢ一１５．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ口产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：韩学易， 陈惠， 胥兵， 赖欣， HAN Xue-yi， CHEN Hui， XU Bing， LAI Xin四川农业大学生命科学与理学院,四川,雅安,625014家禽科学POULTRY SCIENCE2008，(4)0次 参考文献(8条) 1.杨建强.汤国营 角蛋白酶研究发展[期刊论文]-生物技术通讯 2005(02)2.李江.姚斌.范云六 微生物角蛋白酶的分子生物学研究进展[期刊论文]-工业微生物 2006(03)3.蔡成岗.郑晓冬 角蛋白酶的来源、理化性质与生物工程研究进展[期刊论文]-食品与发酵工业 .王晶.陈丽.曹张军 一株羽毛角蛋白降解菌的分离与鉴定[期刊论文]-农业环境科学学报 2007(zk)5.东秀珠.蔡妙英 常见细菌系统鉴定手册 20016.Gradisar H.Kern S.Freidrich J Keratinase of doratomyces microsporus 20007.郭蔼光.郭泽坤 生物化学实验技术 20078.姚淑敏.颜振兰 羽毛角蛋白酶生产菌的选育及产酶条件研究[期刊论文]-曲阜师范大学学报 2001(03) 相似文献(10条)1.期刊论文 张奇.孙丹.杨文博.刘茜.白芳.白钢.ZHANG Qi.SUN Dan.YANG Wenbo.LIU Qian.BAI Fang.BAI Gang 芽孢杆菌L4所产角蛋白酶的纯化工艺、理化性质及其应用研究 -离子交换与吸附)根据芽孢杆菌L4菌株发酵产生的角蛋白酶的分子量和等电点等特征,分别采用硫酸铵盐析沉淀,Sephadex G-75凝胶过滤、DEAE-cellulose 52离子交换和Sepharose 4B凝胶过滤等色谱层析对其进行分离纯化,经SDS-PAGE检测呈现单一条带,分子量为149kD;变性电泳结果显示,该酶由4个分子量约为37.5kD的亚基组成;采用等电聚焦电泳测得其等电点为7.76,并通过纸层析法初步确认该酶为高甘露糖型糖蛋白;最后通过羊毛水解实验确认该酶具有水解羊毛角蛋白的能力,在羊毛仿羊绒等领域具有一定的应用价值.2.学位论文 刘茜 解角蛋白微生物的选育及角蛋白酶酶学性质的研究 2003该研究从腐烂的羊毛中筛选出一株具有降解角蛋白能力的L&,4&菌株,经检测初步印象为芽孢杆菌.通过正交实验对L&,4&菌株的培养条件进行了优化,结果在含3可溶性淀粉,2鸡毛粉,0.5Na&,2&HPO&,4&,0.0375KH&,2&PO&,4&,0.01MgCl&,2&,0.01CaCl&,2&,0.4NaCl,初始pH为7.5的培养基中,于28℃,120转/分的转速下,培养48小时,产生的胞外角蛋白酶活力最高,其肽酶活力可达4.5U/ml,角蛋白酶活力为269.1U/ml.L&,4&菌株所产生的胞外角蛋白酶经过硫铵盐析,Sephadex G-75凝胶过滤,DEAE-cellulose 52离子交换,Sepharose 4B凝胶过滤等色谱层析得到纯化,经SDS-PAGE检测呈现单一条带.角蛋白酶分子量为149KD,由四个分子约为37.5KD的亚基组成,用等电聚焦电泳测得其等电点为7.76,以纸层析法初步确认该酶为高甘露糖型糖蛋白.该角蛋白酶在以酪蛋白为底物时,最适作用温度为50℃,最适pH为7.0,其Km值为3.13mmol/L,Vmax为6.44×10&'-3&mmol/L?s&'-1&.在以自制的角蛋白溶液为底物时,该酶最适作用温度为40℃,最适pH为7.0,其Km值为1.88mmol/L,Vmax为2.72×10&'-2&mmol/L?s&'-1&.该酶受邻啡罗啉和EDTA的抑制,可视为一种含Zn&'2+&的金属蛋白酶.L&,4&菌株产生的角蛋白酶可以酶解羽毛粉,剥离羊毛表面的角质化鳞片,在羊毛经微生物酶法制取仿羊绒的工艺中,具有潜在的应用价值.3.期刊论文 张奇.孙丹.杨文博.刘茜.白芳.ZHANG Qi.SUN Dan.YANG Wen-bo.LIU Qian.BAI Fang 芽孢杆菌L_4菌株角蛋白酶的酶学性质研究 -农业环境科学学报)采用室内实验方法,对芽胞杆菌L_4菌株产生的角蛋白酶进行了系列的酶学性质研究.结果表明,以角蛋白溶液为底物时该酶的最适酶促反应温度为40℃,最适酶促反应pH为7.0,其Km值为1.88 mmol?L~(-1),Vmax为2.72×10~(-2)mmol?L~(-1)?s~(-1).利用不同的蛋白酶抑制剂进行酶活性抑制实验,发现该酶受邻啡罗啉和EDTA的抑制,推测该酶可能是一种含Zn~(2+)的金属蛋白酶.微量元素对该酶活力的影响显著,Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶活力有促进作用,高浓度的Fe~(2+)和Cu~(2+)明显抑制角蛋白活力.4.学位论文 傅伟 地衣芽孢杆菌降解羽毛角蛋白及其发酵产角蛋白酶的研究 2007畜禽类羽毛蕴含了大量潜在的有用蛋白质和氨基酸，我国羽毛角蛋白资源丰富，若合理利用可作为优质饲料蛋白。但是因为其结构稳定，极难降解，找到合适的方法是研究降解角蛋白的关键。传统物理、化学降解法存在众多缺陷，诸如效率低、耗能高、污染大，而采用微生物降解法效果显著，既利用了蛋白资源，也有利于环环境保护。同时角蛋白及角蛋白酶的应用还体现在各行各业中，有广阔的前景及较高的经济价值和社会价值。本课题主要针对羽毛蛋白的资源化利用，从菌种的确定入手，对微生物降解羽毛发酵技术和发酵工艺，以及所产的酶等进行系统研究，并建立发酵动力学模型，取得的主要研究结果如下：1.对两株都能以羽毛为唯一碳源、氮源生长的高效降解菌进行比较筛选，试验结果表明地衣芽孢杆菌ZJUQH(Bacillus licheniformis ZJUQH)能力最强。在基础培养基中加入羽毛，250ml摇瓶发酵，4d～5d后羽毛完全脱落被分解。采用扫描电镜拍摄结果显示发酵5d中整片羽毛的降解情况。2.用地衣芽孢杆菌细胞直接降解羽毛，采用正交实验设计对几个主要影响条件进行优化，结果表明：在细胞生长温度40℃，摇床转速120r/min，发酵时间48h，装液量为25ml，反应pH值为7.5，菌体细胞加量为0.5g时，发酵产酶结果最佳。而当反应pH值为7.0的时候，羽毛降解率结果最佳。前者很好的体现了正交实验设计的优化作用。并且经验证试验，酶活可达55.7U，略高于优化前最大值。3.进行各培养条件优化研究。羽毛发酵前经0.1％的氢氧化钙处理3h，能极大提高羽毛粉消化率，并对以后的微生物产酶及羽毛降解起到明显促进效果。外加碳源中低浓度葡萄糖有利于羽毛分解和角蛋白酶合成，外加氮源没有明显作用。生长因子中玉米粉提取物对菌的生长和羽毛分解有很好促进效果。金属离子中钙离子、镁离子和表面活性剂中吐温-80具有促进效果，但作用不大。采用响应面试验(BBD)设计对培养的营养组成和培养条件(葡萄糖、玉米提取物、磷酸氢二钾)进行优化，结果在最优化发酵培养基：碱处理羽毛粉(鸡毛粉)2％，葡萄糖1.45％，玉米粉提取物0.735％，磷酸氢二钾0.195％，初始pH 7.5，和最佳发酵环境条件下，37℃，180r/min，培养72h，产生的角蛋白酶活力最高达到85.8U，可溶性蛋白在96h最高可达4.在5-L自控式发酵罐中，采用最优化培养基进行实验。分批发酵条件为：搅拌转速200r/min，通气量1L/min，培养温度37℃，装液系数0.6，pH值不控制，接种量5％，发酵7d结果表明放大实验酶活最高值达到61U(72h)，最终的降解率达到64.1％(168h)，可溶性蛋白含量最高可达0.8874mg/ml(108h)，均不如摇瓶，但研究结果为以后的放大深入试验提供基础。5．建立微生物降解动力学模型，地衣芽孢杆菌ZJUQH发酵产酶动力学X=46.4356/1+e&'(3.125t)&和地衣芽孢杆菌zJuQH发酵羽毛降解动力学X()=(5-t)&'0.329965&，并对各自模型的参数进行估计，对模型作了分析和评价。6．对5-L发酵液的氨基酸进行了分析，由发酵前后的对比可知羽毛粉经发酵，原本在生羽毛粉中含量很低的必须氨基酸如：蛋氨酸、组氨酸和赖氨酸等都出现大幅度增加。同时羽毛经过水解，提高消化率，其他各营养成分也得到了改善。因此认为地衣芽孢杆菌ZJUQH发酵降解羽毛生产高营养价值的氨基酸是可行的，并可以进一步优化条件，扩大试验规模。7．由羽毛粉发酵液提取粗角蛋白酶，并分析其酶学性质。酶的最适温度为37℃，温度在35℃～45℃之间较稳定，45℃以上酶活性开始下降，50℃保温90min基本失去或性。最适pH为8.0，pH在7.5～8.5之间较稳定，pH 6.0以下或10.0以上保温90min基本失去活性。该酶受苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、铜离子、汞离子抑制，钙离子和巯基乙醇可提高酶活性。5.期刊论文 韩学易.陈惠.胥兵.赖欣 产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定 -农技服务)从长期堆积腐烂羽毛的土壤中分离出一株能降解羽毛角蛋白的细菌,经形态学观察和生理生化试验,初步鉴定为短小芽孢杆茸,且命名为短小芽孢杆茵B-15.6.学位论文 蔡成岗 角蛋白酶生产菌株选育、发酵与分离纯化研究 2007本文分离到了一株产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌，诱变育种得到了具有良好羽毛降解能力和较高产酶活力的菌株．KD-N&,2&；分别以羽毛和人发为底物对KD-N&,2&的产酶培养基、培养条件、发酵动力学进行了研究，探讨了以羽毛为底物发酵所得角蛋白酶的分离纯化、酶学性质，研究了角蛋白的降解过程及机理，最后对角蛋白酶脱毛效果进行了实验。主要研究结果如下：(1)从养殖场采集的样品中分离到一株具有羽毛降解能力的菌株，经形态学、生理生化和分子特征鉴定为枯草芽孢杆菌。通过亚硝基胍诱变得到一株酶活性提高1.5倍的突变株KD-N&,2&，该突变株最适生长温度和pH值分别为28℃和6.6，其发酵所得粗酶液的最适作用温度为50℃，pH值为8.0。确定了以可溶性角蛋白和天青角蛋白作为底物的酶活性测定方法。(2)比较了羽毛、蚕丝、羊毛、人发等底物诱导产角蛋白酶的效果，发酵24h时最佳底物为10 g/t，羽毛。初始pH值7.5-8.0，培养温度23℃，接种量为2％-5％，种龄16h时有利于产酶。正交实验确定了以羽毛为唯一底物时的培养基组成(g/L)：羽毛10，NaCl 0/5，MgSO&,4&0.2，KH&,2&PO&,4&/K&,2&HPO&,4& 0.35/0.7，培养24h后酶活为66.5 U/mL。培养30h时角蛋白酶活性和可溶性蛋白含量达最大值，发酵液中含苏氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸和赖氨酸等必需氨基酸，半胱氨酸含量最高为0.154 mg/mL，氨含量为0.4424mg/mL。进一步优化实验结果表明，最佳产酶有机氮源牛肉膏浓度为0.5 g/L，有机碳源玉米粉为2 g/L，经响应面实验方法优化后培养基组成为(g/L)：NaCl 0.5，MgSO&,4&0.2，KH&,2&PO&,4&/K&,2&HPO&,4& 0.35/0.7，CaCl&,2&0.01，牛肉膏0.5，玉米粉2.0。碳、氮源的同时加入不利于诱导性角蛋白酶的较快产生。
(3)以人发为底物发酵产角蛋白酶实验结果表明：16 g/L人发浓度、初始pH值6．5、装液量20ml，接种量8％-10％时有利于产酶；在底物浓度10g/L，接种量5％、培养温度28。C、转速200rpm时，最高产酶时间为36h：蔗糖、玉米粉、酵母提取物最佳产酶浓度均为10 g/L。部分因子实验表明。MgSO&,4&和K&,2&HPO&,4&对产角蛋白酶具有显著影响，中心组合试验所得最佳发酵培养基组成为(g/L)：MgSO&,4&0.832，K&,2&HPO&,4&2.38，NaCl1.0，CaCl&,2&0.05，KH&,2&PO&,4&0.4，蔗糖3，优化培养基发酵后酶活性为124.8U/ml，较原培养基提高了83％。(4)以5L发酵罐探讨了以羽毛和人发为底物发酵产角蛋白酶的动力学。结果表明，以两底物发酵过程中，发酵液pH值、可溶性氨基酸和蛋白质含量均呈现增加趋势。其中，以羽毛为底物的发酵过程中氨基酸的生成可以用Peal-Reed模型进行描述：以羽毛为底物的菌体生长和产物生成动力学模型分别为：以人发为底物发酵过程中菌体生长和产物生成动力学模型分别为：(5)以40％-80％饱和硫酸铵对角蛋白酶进行了回收，透析并浓缩后以凝胶层析和离子交换层析两方法对角蛋白酶进行了分离纯化，以SDS-PAGE和毛细管电泳的方法检验了角蛋白酶的纯度。该角蛋白酶分子量为30.5 kDa，最适作用pH值和温度分别为8.5和55℃，最适缓冲液为0.5mMTris-HCl；角蛋白酶活性被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF部分抑制，EDTA在2.5mM、5mM和10mM三种浓度下均对角蛋白酶活性具有激活作用；金属离子Cu&'2+&，Mn&'2+&完全抑制角蛋白酶的活性，Ca&'2+&，Mg&'2+&，Zn&'2+&，Al&'3+&等离子和甲醇、乙醇、二甲基亚砜、异丙醇等有机溶剂部分抑制角蛋白酶的活性，去污剂SDS对角蛋白酶活性具有激活作用；角蛋白酶对可溶性蛋白质酪蛋白、牛血清蛋白和卵白蛋白具有水解作用，对不溶性蛋白质底物羽毛粉、人发和羊毛也具有一定的降解作用，对牛毛和蚕丝没有作用；还原剂二硫苏糖醇、巯基乙醇、亚硫酸钠和含硫化合物L-半胱氨酸、DMSO、氨基磺酸铵对角蛋白酶分解羽毛粉具有促进作用，以5mM DTT和5％的巯基乙醇对角蛋白酶激活作用最大，氨基磺酸铵对角蛋白酶的激活作用为首次报道。(6)发酵过程中羽毛的降解率随羽毛含量增加而减小，在10 g/L羽毛含量时，初始pH值8.0-8.5，培养温度为32℃，接种量2％，种龄20h降解率较高。以羽毛、人发和蚕丝为底物发酵过程中，三种底物均有不同程度的降解，推测为发酵液对底物的溶胀作用、菌体生长、角蛋白酶酶解和机械振荡等共同作用的结果。(7)对以羽毛和人发为底物发酵产角蛋白酶的脱毛效果进行了实验。结果表明，以两粗酶液对羊皮和小牛皮均有较好的脱毛效果。温度较高时脱毛效果更好。小牛皮更易被脱毛，用羽毛发酵所得的角蛋白酶液作用8-12h、以人发发酵所得的角蛋白酶液作用12-16h均可得到良好的脱毛效果。
以上研究为角蛋白酶的发酵生产和应用奠定了基础。7.期刊论文 李小会.何斌.李雪影.王玲.史玉峰.王睿勇 地衣芽孢杆菌1411-1羽毛角蛋白固体发酵工艺的优化及角蛋白酶的初步研究 -江苏农业科学2009(6)对角蛋白高效降解菌地衣芽孢杆菌菌株1411-1固体发酵条件进行了优化,着重考察了培养基含水量、起始pH值、温度、接种量及外源添加物的影响,并确定了优化的发酵周期,同时对角蛋白酶的提取进行了初步研究.研究结果表明,1411-1的最适固体发酵条件为:培养基含水量75%,pH值10.0,温度40℃,菌液接种量0.15 ml/g,发酵周期88 h,氮源对固体发酵有显著的抑制作用,碳源的影响不显著;角蛋白酶的最适提取条件为:以碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH值10.0)作为提取剂,4℃下提取60 min.8.学位论文 张洋 一种新型角蛋白酶的发酵、理化性质及应用研究 2005本文是关于利用地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisFBK-1)发酵产生角蛋白酶粗酶液，对其理化性质进行研究，将其应用到羽毛角蛋白的生物加工过程中，并分析酶解效果的研究。通过微生物发酵得到含角蛋白酶的发酵液，研究了发酵液的最适作用pH、最适作用温度以及金属离子的影响，然后在最适条件下酶解羽毛角蛋白，测定酶解产物的分子量大小、可溶性蛋白质含量、胃蛋白酶消化率及氨基酸组成。地衣芽孢杆菌FBK-1(BacilluslicheniformisFBK-1)在以羽毛为唯一碳源和氮源的液体培养基中会产生含有角蛋白酶的发酵液(粗酶液)，发酵周期为72h，发酵液中角蛋白酶酶活单位在600-700U/ml之间。发酵产生的粗酶液最适作用pH为9.0，最适作用温度为50℃，在pH5.0-9.0、温度在40℃以下时角蛋白酶活性较稳定，一定浓度的Na+、K+、Ca2+、Mg2+对粗酶液中的角蛋白酶酶活有促进作用。将整根鸡毛润湿，在121℃下处理1hr，冷却至室温，加入粗酶液，40℃缓慢震摇3hr，烘干粉碎制成羽毛粉。其中粗蛋白含量80％，可溶性蛋白含量10％，胃酶消化率78％，与市售羽毛粉具有相同品质。将鸭毛粉碎成粉、润湿，在121℃下处理1hr，冷却至室温，加入适量粗酶液，40℃缓慢震摇28h，过程控制pH9.0，离心分离上清与沉淀。酶解沉淀中可溶性蛋白含量为17.96％，胃酶消化率88％，除三种氨基酸(氨酸、蛋氨酸、组氨酸)含量低于鱼粉，其余14种氨基酸含量均高于鱼粉或处于同一水平，可作为饲料添加剂替代鱼粉；酶解液上清经凝胶柱SuperPeptide10/300GL分离，发现酶解液上清中的组分均为分子量在6kD以下的多肽和氨基酸；经过氨基酸组成分析，酶解液中含有17种氨基酸，可作为多肽与氨基酸产品加工的原料。综上所述，地衣芽孢杆菌FBK-1(BacilluslicheniformisFBK-1)的发酵液为一种新型的角蛋白酶酶液，它可酶解羽毛角蛋白，酶解产物可被加工成羽毛粉、氨基酸与多肽等多种产品。9.期刊论文 游银伟.尤升波.岳寿松.YOU Yinw-ei.YOU Sheng-bo.YUE Shou-song 枯草芽孢杆菌YYW-1蛋白酶缺陷株诱变与筛选 -山东科学)包含各类专业文献、外语学习资料、生活休闲娱乐、行业资料、中学教育、专业论文、文学作品欣赏、应用写作文书、高等教育、各类资格考试、39产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定等内容。　
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