一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法
专利名称一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法
技术领域本发明涉及一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法，属于微生物快速诊断领域。
背景技术类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)是一种革兰氏阴性、能运动、兼性厌氧、氧化酶阳性的非孢子繁殖的细菌，曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属于弧菌科，后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近，在第二版《系统细菌学伯杰氏手册》中，类志贺邻单胞菌划归到肠杆菌科，邻单胞菌属。淡水水源和江河水生态环境是类志贺邻单胞菌的主要储存地，鱼类是类志贺邻单胞菌常见的宿主。最近几年由该菌引起的婴幼儿、老年人以及免疫功能不全病人的胃肠道感染病例逐渐增加，是人类肠胃炎的主要病因之一，世界各地屡有报道。类志贺邻单胞菌亦 可引起人类菌血症、蜂窝组织炎、脑膜炎等肠外感染，该菌亦与旅行者腹泻密切相关。来自日本的一项研究发现在年间所有引起旅行者腹泻的肠杆菌中，类志贺邻单胞菌位居第一(66.7%)。由类志贺邻单胞菌引起的死亡率也在逐渐增高。一些类志贺邻单胞菌的感染者由于未能快速准确的诊断和合理的应用抗生素，而没有得到及时的治疗而产生了严重的后果，甚至死亡。虽然类志贺邻单胞菌诱发肠胃炎的致病机理并未完全阐明，但研究者已经对一些潜在的毒力因子进行了深入的研究。摄取铁离子与一些病原菌的毒力密切相关，人体中的亚铁血红素是病原菌铁离子的一个重要来源，并且许多病原菌本身就具有亚铁血红素运输系统，hugA基因是编码类志贺邻单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一，并且编码外膜蛋白受体，是影响类志贺邻单胞菌毒力的一个重要基因，因此也是一个理想的检测目的基因。目前类志贺邻单胞菌的检测方法主要有分离培养、生化鉴定，普通PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法。分离培养方法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要3-5天完成，不能满足快速检测的需求。并且该菌缺少特异的筛选培养基，在一些肠道培养基上形成的菌落性状与嗜水气单胞相似，难以区别，这也影响了类志贺邻单胞菌的分离率。最近几年，PCR和实时荧光PCR分子生物学检测方法在病原菌检测中的应用越来越广，但这些方法的检测成本高，需要精密昂贵的热循环仪器，且对实验环境和操作者的技术也有严格的要求，因此限制了该技术的普遍适用性，不利于在农村地区以及基层实验室的推广应用。类志贺邻单胞菌做为一种新发的传染性疾病对流行病学家和临床医生造成的最大困难就是缺少能够对其进行早期、快速、准确检测的方法，以满足农村地区和基层实验室的实际工作需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是Notomi等建立的一种新的核酸扩增方法。LAMP是针对祀序列的6个特异部位设计4条引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4 条引物之中 2 条为内引物，即 FIP(ForWard inner primer, FIP)和 BIP(Backwardinner primer, BIP)。FTP 包含 Flc 和 F2 (F2c 区域的互补序列)，即 5' _Flc_F2 ;BIP 包含Blc(Bl区域的互补序列)和B2，即5' -Blc-B2。外引物为F3和B3。LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段。LAMP反应中60 65°C是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65°C左右处于动态平衡状态，任何一个弓I物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3'末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3'末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP引物合成的DNA链。一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5，末端存在互补的Flc和Fl区段，于是发生自我碱基配对，形成茎环结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3'端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。接着，类似于F3，B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3'端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述2个过程，形成双链DNA。被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。LAMP法基因扩增循环阶段首先在哑铃状结构中，以3'末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应，解离由Fl区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，经过相同的过程，又形成茎环结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。为了进一步缩短LAMP的反应时间，还可以在Flc-F2c/BIc_B2c之间设计一对环弓I物LF/LB，环引物通过结合在茎环结构的环状区域互补序列上，大大加速了整个链置换反应过程，从而提高了反应效率。LAMP可以特异、高效、快速的扩增DNA^ I小时之内使产物的量达到IO9个拷贝。LAMP方法最大的缺点就是容易出现假阳性，由于LAMP采用了多条引物，而且是在同一温度条件下进行扩增，引物之间有可能互补而扩增出非特异性条带，造成假阳性。因此LAMP方法对引物的特异性要求很高，设计也更为复杂。由于LAMP省略了 94°C变性步骤，同时退火和延伸步骤在同一温度(等温)条件下进行，反应体系的组成也较传统PCR复杂，除了反应体系中必须的缓冲液、dNTP引物、酶等成分外，还需要加入甜菜碱(betaine)、硫酸镁等必需成分,反应体系较为复杂,对体系中主要成分的配比优化液要求较高,否则会降低反应的特异性和灵敏性。本发明的目的就是通过引物设计和组分优化，建立一种类志贺邻单胞菌的方便、快速、特异、灵敏的LAMP检测方法，以能够在基层实验室进行大规模的推广使用。
本发明提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方法，所述方法包括如下步骤(I)将待检测样本、序列如SEQ ID NO 1_2所示的一对外引物、序列如SEQ ID NO3-4所示的一对内引物、序列如SEQ ID NO 5_6所示的一对环引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、 MgSO4、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中；(2)将步骤⑴所得的混合液放置于65°C恒温环境中进行DNA扩增反应；
(3))将步骤⑵获得的产物放置于80°C恒温环境中，以终止步骤(2)所述的DNA扩增反应；(4)检测步骤⑶获得的产物。其中，SEQID NO I 为引物 F3，SEQ ID NO 2 为引物 B3，SEQ ID N03 为引物 FIP，SEQ ID NO 4 为引物 BIP，SEQ ID NO 5 为引物 LF，SEQ IDNO 6 为引物 LB。本方法检测的目的基因为类志贺邻单胞菌的hugA基因，引物设计所依据的基因序列为(Gene Bank ID号AY008342. I)，SEQ ID NO 1-6在hugA基因序列中的位置如表I所示。表I实验中所用到的LAMP弓丨物序列
1.一种检测类志贺邻单胞菌的方法，所述方法包括如下步骤
(1)将待检测样本、序列如SEQID NO 1-2所示的一对外引物、序列如SEQ ID NO 3_4所示的一对内引物、序列如SEQ ID NO 5-6所示的一对环引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgS04、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中；
(2)将步骤(I)所得的混合液放置于65°C恒温环境中进行DNA扩增反应；
(3))将步骤⑵获得的产物放置于80°C恒温环境中，以终止步骤(2)所述的DNA扩增 反应;
(4)检测步骤(3)获得的产物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述MgSO4的浓度为6mM，所述甜菜碱的浓度为10mM。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述待检测样本为DNA提取物。
4.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的DNA扩增反应时间为I小时。
5.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的终止反应时间为5分钟。
6.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的检测方法可以是电泳检测法、浊度检测法、或染色检测法。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述染色检测使用的染料为SYBRgreenI荧光染料。
8.—种检测类志贺邻单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包括序列如SEQID NO 1-2所示的一对外引物、序列如SEQ ID NO 3-4所示的一对内引物、序列如SEQ ID NO 5_6所示的一对环引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO4、甜菜碱、环介导等温扩增缓冲液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述MgSO4的浓度为6mM，所述甜菜碱的浓度为10mM。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂盒。
本发明提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方法，所述方法利用环介导等温扩增技术，以hugA基因为目标基因，通过设计3对DNA引物，与待检测的DNA模板放入包括MgSO4和甜菜碱在内的扩增缓冲液中，在65℃恒温环境中扩增，再以80℃恒温环境终止反应，并对扩增产物进行检测。该方法设备简单，易操作、具有良好的特异性、灵敏度和重复性。
文档编号C12Q1/68GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者孟双, 徐建国, 叶长芸 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所工具类服务
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草鱼致病性类志贺邻单胞菌的分子鉴定及快速检测
应用原核生物16S rRNA基因通用引物对草鱼致病菌株LCCiL90625NA进行16S rRNA基因的克隆、序列分析.核酸序列同源性分析表明,该序列与Plesiomonas shigelloides菌株PIC3的16S rRNA基因序列(NCBI登录号:GQ359957)同源性最高,为99.7％.同时,通过与弧菌科代表菌株16S rRNA基因构建的发育进化树表明,该菌株与已登录的类志贺邻单胞菌聚为一类.设计引物扩增Plesiomonas shigelloides 23S rRNA基因的特异性片段进一步证实分离菌株为类志贺邻单胞菌,同时证明该引物可以用于类志贺邻单胞菌的快速检测.
ZHANG Xin-yan
FAN Hai-ping
ZENG Zhan-zhuang
作者单位：
福建省淡水水产研究所,福建福州,350002
年，卷(期)：
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机标分类号：
在线出版日期：
基金项目：
福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项
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志贺菌属与类志贺邻单胞菌可用动力和氧化酶试验加以鉴别
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类志贺邻单胞菌ATCC
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【简单介绍】
质控菌种，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的ATCC,CMCC,CICC,DSMZ标准菌株。，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的ATCC,CMCC,CICC,DSMZ标准菌株。 类志贺邻单胞菌ATCC
【详细说明】
ATCC可以提供以下类别生物标准品：细胞株（3000多种）；菌株（15000多种）；动植物病毒株（2500多种）以及重组物质等。现已成为可信赖的活体微生物、细胞系等获得、保存和发放的国家资源中心，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的ATCC,CMCC,CICC,DSMZ标准菌株。，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的ATCC,CMCC,CICC,DSMZ标准菌株。目前，ATCC有29,000多种不同品系可靠的动物细胞和微生物培养体，它能满足各科学团体对可信赖品系的需要。仅1981年就有39,000多培养物发放给全世界的科学工作者，并成功地用冷冻和冷冻干燥的方法保存各种细胞品系。&ATCC是一个非（学会单位）无利润的公司，由各科学组织推选成员组成理事会进行管理。现有工作人员125人。参加的科学团体有：美国免疫协会、美国生物化学会、美国细胞生物学会、美国微生物学会、美国动物学会、美国遗传学会、原生动物学会和组织培养协会等16个学术组织。在ATCC可利用各种材料以及工具和设备进行广泛的研究。主要研究项目有：酶联免疫吸附分析技术（ELISA），真核细胞转录的调控，杂交瘤、淋巴类和髓类以及其他细胞系的建立，人突变细胞系的基因蛋白质，借助计算机进行鉴别分析，培养物的特征鉴别和保存技术的改进,关于化学致癌、致畸和致突变质控菌种，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的ATCC,CMCC,CICC,DSMZ标准菌株。，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的ATCC,CMCC,CICC,DSMZ标准菌株。&欢迎来电咨询021-，周经理刘经理公司网站&,&&&www.beinuobio.com&&&&&&&&&&&http://www.atcc.org/大肠埃希氏菌 O157：H7大肠埃希氏菌ATCC35218大肠埃希氏菌ATCC25922大肠埃希氏菌ATCC44568大肠埃希氏菌&ATCC44102肺炎克雷伯菌 ATCC700603肺炎克雷伯菌ATCC13883肺炎克雷伯菌ATCC35657肺炎克雷伯菌CMCC46117铜绿假单胞菌 ATCC27853流感嗜血杆菌 ATCC49247流感嗜血杆菌ATCC9007副流感嗜血杆菌 ATCC彭氏变形杆菌 ATCC普通变形杆菌 ATCC奇异变形杆菌 CMCC49027创伤弧菌 ATCC溶藻弧菌 ATCC副溶血弧菌 ATCC甲型副伤寒沙门菌 ATCC乙型副伤寒沙门菌 CMCC50094伤寒沙门菌 ATCC鼠伤寒沙门菌 ATCC粘质沙雷菌 ATCC宋内志贺菌 ATCC福氏志贺菌 ATCC类志贺邻单胞菌 ATCC阴沟肠杆菌 ATCC700323荧光假单胞菌 ATCC恶臭假单胞菌 ATCC枸橼酸杆菌 CMCC48017格高菲肠杆菌 ATCC弗氏柠檬酸杆菌 ATCC摩氏摩根菌 ATCC阪崎肠杆菌 ATCC迟钝爱德华 ATCC解脲棒状杆菌 ATCC嗜水气单胞菌 ATCC产气肠杆菌 CMCC45103嗜麦芽窄食单胞菌 ATCC17666鲍氏不动杆菌 ATCC洛菲不动杆菌 ATCC斯氏普罗威斯O斯菌 ATCC威斯康星米勒菌 ATCC白喉棒状杆菌 ATCC多杀巴斯德菌 ATCC脑膜脓毒性金黄杆菌 ATCC单核细胞增生李斯特菌ATCC 伊氏李斯特菌 ATCC蜂房哈夫尼亚菌 ATCC蜡样芽孢杆菌 CMCC63301星形诺卡菌 ATCC德尔卑沙门菌 ATCC卡他布兰汉菌ATCC 粪产碱杆菌 ATCC龟分枝杆菌 ATCC洋葱伯克霍尔德菌 ATCC产酸克雷伯菌 ATCC700324植生克雷伯菌 ATCC木糖氧化产碱杆菌 木糖亚种ATCC非O1群霍乱弧菌 &ATCC金黄色葡萄球菌 ATCC25923金黄色葡萄球菌 ATCC29213金黄色葡萄球菌&ATCC43300金黄色葡萄球菌&MRSA表皮葡萄球菌 ATCC12228表皮葡萄球菌&CMCC26069粪肠球菌（高耐） ATCC51299粪肠球菌 ATCC29212粪肠球菌 ATCC33186淋病奈瑟氏菌 ATCC49226淋病奈瑟氏菌 ATCC19424脑膜炎奈瑟氏菌 ATCC乳糖奈瑟氏菌 ATCC咽峡链球菌 ATCC无乳链球菌 ATCC草绿色链球菌 ATCC肺炎链球菌 ATCC49619化脓性链球菌 ATCC19615鹑鸡肠球菌 ATCC腐生葡萄球菌 ATCC屎肠球菌 耐万古ATCC溶血葡萄球菌 ATCC藤黄微球菌 ATCC木糖葡萄球菌 ATCC35663铅黄肠球菌 ATCC700327产色葡萄球菌 ATCC耳葡萄球菌 ATCC沃氏葡萄球菌 ATCC克氏葡萄球菌 ATCC头状葡萄球菌 ATCC路邓葡萄球菌 ATCC人葡萄球菌 ATCC马链球菌兽瘟亚种 ATCC43079嗜热链球菌 ATCC19258白色念珠菌 ATCC10231白色念珠菌ATCC90029白色念珠菌ATCC90028白色念珠菌 ATCC14053光滑念珠菌 KTCC0001热带念珠菌 ATCC750克柔念珠菌 ATCC6258季也蒙念珠菌& ATCC葡萄牙念珠菌 ATCC34449近平滑念珠菌 ATCC22019郎比克念珠菌 ATCC新型隐球菌 ATCC皱褶念珠菌 ATCC
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