高硅铝合金的化验分析方法？_氯化钾_百科问答
高硅铝合金的化验分析方法？
高硅铝合金的化验分析方法？
提问者:朱贤馨
以前帮助一个朋友搜索的资料，你参考一下？上世纪七十年代以前,常量硅的测定主要应用重量法,1862年Stolba、1926年Trevere曾提出过氟硅酸钾使用于测定硅的滴定法,但都因为不稳定未能推广开来.上世纪七十年代初,国内外提出了许多实用的方法,也有许多实验室提出了用于不同样品的操作规程,当时问题较多,七十年代中期氟硅酸钾滴定法国内日见成熟并且得到推广和普及.实际使用中证明氟硅酸钾滴定法测定硅,是测定常量硅的快、准的方法之一,虽然它使用较多的乙醇,但从总的来看成本不会超过重量法,又能达到快速准确测定硅的目的,所以推广的非常好非常快,这都是深入研究克服了许多缺点,才能有强有力的生命力。上个世纪.七十年代中后期它代替了大多数原来是由重量法测定的样品.成为测定常量二氧化硅广泛使用的方法之一。一.原理：二氧化硅滴定分析方法都是间接测定方法，氟硅酸钾容量法是应用最广泛的一种，确切的说应该是氟硅酸钾沉淀分离&酸碱碱滴定法。其原理是含硅的样品，经与苛性碱、碳酸钠等共融时生成可溶性硅酸盐，可溶性硅酸盐在大量氯化钾及F-存在下定量生成氟硅酸钾（K2SiF6）沉淀。氟硅酸钾在沸水中分解析出氢氟酸（HF），以标准氢氧化钠溶液滴定。间接计算出二氧化硅的含量。主要反应：SiO2＋2NaOH＝Na2SiO3＝＋H2O&&&（1）Na2SiO3＝＋2HCl＝H2SiO3＝＋2NaCl&&&（2）H2SiO3＝＋3H2F2＝H2SiF6+3H2O&&&（3）H2SiF6+2KCl＝K2SiF6&＋2HCl&&&（4）K2SiF6＋3H2O=4HF＋H2SiO3＋2KF&&&&&（5）HF＋NaOH=NaF＋H2O&&&&&（6）上面（1）是表示含硅样品的分解，也可用HF分解样品。（2）分解后的试样中的硅酸盐在HCl存在下转化为可溶性的H2SiO3（3）（4）H2SiO3在大量氯化钾及F－存在下生成K2SiF6沉淀（5）K2SiF6沉淀溶解生成HF（6）以氢氧化钠标准溶液滴定HF，间接测定硅含量。虽然表面看起来这个过程就是样品溶解&生成K2SiF6&使K2SiF6溶解析出HF&以标准氢氧化钠溶液滴定&计算硅含量，并不复杂，实际应用时却必须注意一些关键的环节，才能得到准确的测定结果。二.实践：⒈试液的制备:应用氟硅酸钾滴定法,首先必须使样品中的硅完全转化为可溶性的H2SiO3或SiF4⑴样品用碱(NaOH、KOH、Na2CO3、Na2O2)熔融,使硅完全转化为硅酸钠或硅酸钾。一般使用氢氧化钠熔融，具有温度低、速度较快，含氟较高的试样中的硅不致呈SiF4挥发损失，含铝、钛高的样品，应用氢氧化钾。实践过程中证明：如果能使用氢氧化钾熔融的样品尽量使用氢氧化钾,这是因为一方面用它可以提供更多的K+,另一方面制成的试液清澈便于观察。一般样品熔融不加过氧化钠,只有样品不能被氢氧化钾完全分解时,可在加氢氧化钾的同时加入少量过氧化钠助熔.熔融的容器多用银、镍、铁等坩埚.其中使用镍坩埚的比较多，因为镍坩埚耐用,制备的溶液清澈混入的杂质较少.使用镍坩埚时,新的镍坩埚应先用无水乙醇擦去油污,放入马弗炉650℃灼烧30min取出于空气中冷却,形成一层很薄的氧化膜可更加耐腐蚀,延长使用寿命，熔融时应预先在电炉上加热将氢氧化钾中的水分赶尽,再入马弗炉600～650℃熔融5～10min或直至熔融完全。碱熔处理样品普遍用于测定各种样品的含硅量.熔融物的浸取一般用40～50ml沸水20ml盐酸和10ml硝酸，一般控制体积&80ml～&50ml,体积太大会影响氟硅酸钾沉淀，如果单称样品0.1g测定，这样就可以了，若是样品碱熔后，酸化制成的一定体积试液，然后分液测定硅（二氧化硅含量高的样品如硅酸盐等碱熔酸化制成的一定体积试液，然后分液测定硅是不适宜的，因为含硅量高样品在浸取、酸化、稀释到一定体积的试液制备时酸度降低很多，很快会析出硅胶，从而影响测定结果。即使含量较低的样品，也应在试液制备好后立即分液，否则放置时间过长也会有硅胶析出造成结果误差），则分取的部分试液中应补加20ml盐酸和10ml硝酸。⑵用氟酸处理样品:用氟酸处理样品,一般还要加硝酸共同分解样品,对于硅系列的铁合金,由于硅及其它主要成分呈单质状态存在,与氟酸加硝酸溶解反应剧烈往往还要冷却,否则会有样品的散失.对于硅呈化合物状态存在的样品,还需要在加氟酸和硝酸后加热,如果不加热样品分解不完全,但加热温度超过70℃SiF4&会挥发损失,在聚四氟乙烯烧杯中低温蒸发至最后一定剩余10～15ml体积,这样使样品分解完全硅不会损失.1947年Munter做一实验,低温蒸发至最后氟酸体积大于1ml,氟硅酸就可以存在在溶液中,氟酸处理含硅样品时,低温蒸发至一定程度时,就会生成氟硅酸、氟酸和水的恒沸三元体系,恒沸点是116℃恒沸混合物的组成为:硅氟酸36%氟酸10%水54%,1ml恒沸混合物含Si66mg换算为硅氟酸(H2SiF6)约0.5g.有人用氟酸处理样品测定矿石的含硅量也取得了满意的测定结果。.⒉生成氟硅酸钾沉淀的最佳条件：:杂质干扰最少是该方法的前题,由氟硅酸钾生成的反应看到:SiO32-＋2K＋＋6F-＋6H＋=K2SiF6&＋3H2O欲使该反应进行到底,得到完全的氟硅酸钾沉淀,K＋、F-、H＋的浓度要有足够。.⑴沉淀的介质和酸度：介质可以是盐酸、硝酸或盐酸和硝酸的混合酸。在盐酸的介质中沉淀时，铝、钛允许量较小，沉淀速度较慢。但可允许大量铁、钙、镁共存；在硝酸介质中沉淀，铝钛生成的氟铝酸钾和氟钛酸钾的溶解度比在盐酸中大，因此减少铝钛的干扰，但如果同时有大量钙存在时有影响。所以样品中含钙、钛、铝均高时采用盐酸硝酸混合酸较好。所以一般情况使用纯硝酸或盐酸硝酸混合酸结果较好氟硅酸钾沉淀可以完全,一般酸度在3～4mol/L介质中进行(这里的酸度是指硝酸如果是盐酸则要酸度更高，使用纯盐酸介质结果不理想很少有人用)。⑵氟离子和钾离子的浓度是沉淀的必要因素。氟离子和钾离适当的过量可抑制氟硅酸钾沉淀的离解，有助于降低氟硅酸钾沉淀的溶解度。一般F-的浓度要适当一般控制KF&约&100g/L,为了保证已生成的K2SiF6沉淀不复溶。沉淀反应最好在饱和氯化钾或饱和硝酸钾溶液中进行（有人研究提出氯化钾的最小浓度25℃时为100g/L、35℃时为120g/L的条件下氟硅酸钾沉淀完全.）。⑶另外温度也是不可忽视的，在饱和氯化钾或饱和硝酸钾溶液中，只有在室温&35℃的条件下可生成完全的氟硅酸钾沉淀,温度高于35℃氟硅酸钾沉淀会不完全或复溶。还有一个很重要的一个问题要注意，氟硅酸钾沉淀一经生成放置10min就可过滤，沉淀放置的时间不超过1～2h放置时间过长沉淀会吸附杂质和共沉淀给测定结果带来误差，建议以下的操作过程最好一鼓作气进行完成，⑷由于F－与玻璃生成跬氟化合物，使用的烧杯、漏斗、搅棒及装氟化钾溶液的瓶子等器皿，均应是不被HF腐蚀的聚乙烯、聚四氟乙烯或其它塑料制成品。⒊氟硅酸钾沉淀的洗涤：⑴氟硅酸钾沉淀的水溶性较大（KspK2siF6=8.6&10-7,在17.5℃时100ml水可溶解0.12gK2SiF6），沉淀洗涤时为防止氟硅酸钾沉淀的溶解,用氯化钾饱和的无水乙醇溶液或饱和硝酸钾溶液。因用无水乙醇量太大,笔者实验用氯化钾饱和的无水乙醇＋水＝1＋1的溶液做洗液也是可行的,有人用50g/L氯化钾和50%无水乙醇溶液做洗液,也有人反对认为既是低于50%无水乙醇的氯化钾饱和溶液也不能保证氟硅酸钾沉淀不溶解,有人推荐在5～7℃条件下,使用低于50%无水乙醇的氯化钾饱和溶液.液,洗中含无水乙醇的比例应&50%必须有氯化钾饱和.如果洗液是硝酸钾饱和液则可以不使用乙醇，在沉淀时用硝酸钾粉末或硝酸钾饱和溶液，洗沉淀时可以用&150g/L硝酸钾溶液。⑵在这里温度和湿度也值得注意笔者认为夏季室温在高于35℃时不适宜用氟硅酸钾沉淀法测定硅，沉淀在洗涤过程中有溶解的危险（实事是在超过35℃的夏季的测定结果合格率达不到60％，几次造成返工）。同理湿度＞70％，也有同样的问题存在，只是影响没那么大，如使用无水乙醇&氯化钾饱和溶液则可减弱影响。鉴于同样的原因，过滤沉淀前在塑料漏斗上调滤纸时，可直接用洗液，如果用水调好滤纸后，一定要用洗液洗漏斗和滤纸三次以上，使滤纸上的水洗净，留在滤纸上的溶液和洗液达到平衡，完全一致。⒋氟硅酸钾沉淀法测定硅的主要干扰元素及消除：大部分阳离子不干扰硅的测定,SO4-2和PO3-3存在不利于氟硅酸钾沉淀的生成,阳离子的干扰主要的是Al3＋:在盐酸&硝酸中氟铝酸钾沉淀容易生成,氟硅酸钾水解滴定操作过程中滴定终点不稳定，不断褪色，溶液中还会出现白色絮状沉淀，滴定结果显著偏高，这就是氟铝酸钾的影响。硝酸可加速铝络合物的溶解,实验证明在较高酸度6～7.5mol/L,可消除160mgAl2O3(一般控制盐酸&硝酸混合酸度3～4mol/L至少可消除70～80mgAl2O3的干扰)。另外控制F－的含量，采用钾盐熔样防止引入大量钠离子，在硝酸介质中沉淀，缩短沉淀搅拌放置时间等也可防止氟铝酸钾沉淀生成。20mgTiO2、CaO50mg、20mgZrO2的干扰,加柠檬酸也可以掩蔽钛和锆可消除钛和锆的干扰。但不能掩蔽铝不能消除铝的干扰。另外钛的干扰与硅含量有密切关系，当硅含量低时钛量20mg也不影响，但硅含量较高时钛含4mg就明显干扰，可以在沉淀前加入H2O2或草酸盐使生成[TiO（H2O2）]2＋或[TiO(C2O2)]2－可溶性配合物不沉淀。硼可生成KBF4&（100ml试液中，硼含量&5mg即生成KBF4&）干扰测定硅,可以使用含1g/LNaF、&120g/LKCl⒌终点的确定&指示剂的选择：氟硅酸钾滴定法测定硅,是酸碱滴定有许多指示剂可用,实际上并非如此,因为氟硅酸钾水解后生成了两种酸：H2F2和H2SiO3，氢氟酸的电离常数（Ka＝7.2&10－4）比硅酸大的多，以氢氧化钠滴定时，氢氟酸是强酸（H2F2）首先被滴定，不希望硅酸被滴定干扰测定，为防止硅酸（H2SiO3）分解被氢氧化钠滴定，就必须控制滴定终点pH值为7.5～8.0范围内，若pH＞8.5则部分硅酸分解被滴定。所以应选择适用的指示剂：一般选用中性红（pH=6.8～8.0红至亮黄）、酚红（pH=6.8～8.0黄至红）、混合指示剂溴百里酚蓝&酚红（100ml水溶液中含溴百里酚蓝、酚红各0.1gpH＝7.5黄至亮蓝紫色）也有用,硝嗪黄（黄变浅红PH＝6～7.1）、酚酞、百里酚蓝&酚红、次甲基蓝&酚红。实践证明用混合指示剂较为灵敏,而酚酞终点拖的太长,不稳定，只有很少人使用，一般不使用氟硅酸钾滴定中。规程中规定标定氢氧化钠标液使用酚酞,使用酚酞标定时应注意酚酞指示剂的用量应该多一些,一般用5～10滴左右，,酚酞刚变红即是终点,.几份平行溶液终点的红色深浅应一致。实践证明标定氢氧化钠标液改用混合指示剂并不合适.使用溴百里酚蓝&酚红指示剂时因为指示剂的质量和生产批次不同应注意蓝红的比例,要调解到终点时为亮蓝紫色..6.滴定方式:第一终点即氟硅酸钾沉淀及滤纸上洗涤后少量的残余酸,用氢氧化钠标准溶液滴定至终点,第二终点,是滴定(第一终点后加入中和水)氟硅酸钾水解生成的H＋,第二终点可以有两种方法确定:一为返滴定,加过量的氢氧化钠溶液再用酸标准溶液滴定过量的氢氧化钠标准溶液,终点时溶液由蓝紫色变为黄色.另一为直接滴定.第一终点具体操作：将洗净的沉淀及滤纸打开放入预先加了10mlKCl(饱和)&乙醇洗,加2ml指示剂,滤纸上的沉淀倒入溶液中,滤纸贴于杯壁,先滴加氢氧化钠标准溶液中和绝大部分酸,然后将滤纸捅下捣碎继续滴定(这里如果一开始就将滤纸捣碎就很困难,待部分酸中和后再捣碎就会很容易.中和时烧杯壁和搅棒上沾的残余酸不可忽视,一定要以滤纸擦净并仔细中和),溶液由黄变为蓝紫色终点很明显,中和残余酸不计数.第一终点时要求氟硅酸钾一定丝毫没有溶解,这里包括两个意思：一是氟硅酸钾在洗涤过程中不仅一定要洗净而且一定丝毫没有溶解,二是在滴定第一终点时氟硅酸钾一定丝毫没有溶解.因此洗涤氟硅酸钾沉淀时要尽量洗净余酸，一般洗沉淀7～8次不能少。滤纸上,残余酸越少越好,这样滴定终点时生成的水量少，可保证第一终点氟硅酸钾一定丝毫没有溶解,实际操作时中和剩余酸氢氧化钠标准溶液用量应控制在5ml左右,如果氢氧化钠标液用量超过10ml有可能使氟硅酸钾沉淀部分溶解,测定结果偏低（如采用抽滤并洗涤沉淀为中性，可以将沉淀用沸水溶解后直接滴定，不需要两个终点的操作）。第二终点的具体操作：第一终点后,氟硅酸钾沉淀水解过程是：K2SiF6沉淀溶解于热水中，SiF6-2先离解为SiF4，接着四氟化硅（SiF4）迅速反应，水解生成H2F2。SiF4水解是吸热反应，加入沸水有利于氟硅酸钾水解完全，一般操作规程加入150ml沸腾的中和水（或称中性水pH&7.5在此不仅考虑到氟硅酸钾的水解完全,也考虑到蒸馏水中溶解的CO2、酸度等影响酸碱滴定的因素因此使用煮沸的加指示剂并用氢氧化钠标准溶液中和的水)。K2SiF6＝2K＋＋SiF6-2SiF6-2=SiF4＋2F&SiF6-2=SiF4＋2F&SiF4＋3H2O＝2H2F2＋H2SiO3HF＋NaOH=NaF＋H2O150ml沸腾的中和水足以使&70mgSi生成的氟硅酸钾沉淀完全水解.并保持滴定时温度为70～90℃，低于50℃反应速度慢、终点不稳定、测定结果偏低。滴定时要不断地搅拌,搅拌的方向最好顺反交替进行。终点的确定：氢氧化钠标准溶液直接滴定要注意仔细观察颜色变化的过程：溴百里酚蓝&酚红指示剂酸性时为黄色，滴定过程中不停地搅拌,随酸性的减弱快接近终点时颜色变化有一个过渡：由黄色逐渐变成浅紫色继续变化成灰紫色(灰色),继续滴定到终点时有一突跃&灰色突然变亮呈亮蓝紫色,继续搅拌30秒不褪色为终点。如果褪色应该继续滴定到亮蓝紫色30秒不褪色为终点（滴定终点时溶液温度要保持在&50℃范围，注意不能在酸性环境中进行滴定操作）。总之氟硅酸钾滴定法测定硅方法的整个过程,有三项关键操作过程必须做好：㈠首先要使氟硅酸钾沉淀完全；沉淀条件:强酸度&3mol/L～7.5mol/L硝盐混酸；氯化钾饱和操作溶液；氟化钾浓度&10g/L；室温低于35℃.；搅拌2min，放置片刻（＜10min）；滤纸必须用洗液洗涤平衡。缺一不可,条件完全符合时试样溶液中硅酸的Si才能完全转化为氟硅酸钾沉淀。㈡.使氟硅酸钾纯净又没有损失：洗涤氟硅酸钾沉淀时要洗净还要保证氟硅酸钾沉淀不溶解。一般用50%乙醇&氯化钾饱和溶液（饱和硝酸钾溶液或氯化钾50g/L&50％乙醇溶液）洗涤氟硅酸钾沉淀7～8次，将滤纸取下于原烧杯中，以氢氧化钠标准溶液中和残余酸，即可得到纯净的氟硅酸钾。㈢使氟硅酸钾水解完全：氟硅酸钾水解是吸热反应，为防止蒸馏水中CO2及酸度的影响使用一定体积（150ml左右）的沸腾中和水,使氟硅酸钾沉淀完全溶解.滴定时再注意观察终点颜色变化,就可得到测定硅的正确结果..氟硅酸钾滴定法测定硅三项关键的操作过程,一定要深刻的理解他的意义,即第一、二两点所有的工作就是为了使试样中Si完全转化为纯净的氟硅酸钾沉淀并且不复溶。第三点则正好相反,它必须使前面生成的氟硅酸钾沉淀水解完全,这时使测定硅的问题，变为简单的强酸和强碱的中和滴定。在深刻理解三点关键的前题下,在实际操作中必还须做到一丝不苟，才能保证测定硅的成果准确度达到要求.7.其它问题：环境有时也很重要,笔者曾经在一次测定20件硅样品,测定结果出来后发现完全偏低,查原因是同室的其它同事用硝酸和盐酸溶解样品,那天的通风机有毛病屋内酸气较大,恰巧那天天阴下雨,就出了差错.年有几次夏季最热（气温最高达35℃～40℃）的天气,分析了几批试样合格率都＜70%,有个别批次,气温高达40℃时,测定结果合格率不到50%只有报废待气温下降到30℃以下重新返工，.所以环境的温度、湿度、含酸气等，也应该重视,以免影响测定硅结果的准确度。顺便提一下氟硅酸钾滴定法所有用的器皿都是塑料制品.以免氟腐蚀玻璃造成测定硅的结果错误.如果硅的含量高,滴定还不到终点时,塑料烧杯就装不下了,可转入玻璃烧杯中(如果未水解完全应加热使氟硅酸钾水解完全)继续滴定到终点。三.应用：方法一：氟硅酸钾滴定法测定矿石中二氧化硅量1.主题及测定范围：该方法适用于铁矿石、岩石，矿石及冶金炉渣中，二氧化硅含量&1％～&70％的试样，（操作的溶液中含Si量在0.5mg～50mg的范围内）含二氧化硅量的测定。2.方法提要：试样用碱熔酸化，在含有3mol/L硝酸（含有盐酸但浓度以硝酸计）的溶液中，加KCl使呈KCl的饱和溶液，于该溶液中加入KF，使Si呈K2SiF6&，用KCl饱和的30％～50％乙醇溶液洗涤氟硅酸钾沉淀中所含残余的游离酸。纯净的氟硅酸钾在沸水中水解，析出游离酸，用氢氧化钠标准溶液滴定游离酸，间接计算SiO2的含量。3.试剂3.1氢氧化钾（钠）3.2氯化钾3.3硝酸：&＝1.42g/ml3.4盐酸&＝1.19g/ml3.5氟化钾溶液200g/L于塑料器皿（瓶）中配制或保存3.6氯化钾&乙醇洗液乙醇＋水＝1＋2加KCl至饱和3.7溴麝香草酚蓝&酚红指示剂溴麝香草酚蓝及酚红指示剂，各取0.2g溶解于20ml无水乙醇中，加30ml热水，搅拌使完全溶解，混匀。3.8中和水将本次测定所需的中和水盛于3000ml锥形瓶中，于电炉上煮沸加2ml溴麝香草酚蓝&酚红指示剂，滴加氢氧化钠标准溶液（3.9）至呈蓝紫色。3.9氢氧化钠标准溶液3.9.1氢氧化钠储备溶液：c（NaOH）&1mol/L称取40gNaOH溶解于1000ml，煮沸过的蒸馏水中，并加10ml浓度为200g/L的Ba(OH)溶液，储存于塑料瓶中。置暗处3天～4天后使用。3.9.2氢氧化钠标准溶液配制：c（NaOH）&0.074mol/L。取75ml氢氧化钠储备液（3.8），以新煮沸并冷却至室温的蒸馏水稀释至1000ml，混匀。氢氧化钠标准溶液的标定：标定法有多种，介绍一种直接标定法：称取0.1000g～0.5000g基准苯二甲酸氢钾（经105℃干燥1h，并在干燥器中冷却至室温）三份，分别于经烘干的250ml三角瓶中，加100ml沸水，及4滴酚酞指示剂（酚酞10g/L乙醇溶液），用待标定的氢氧化钠标准溶液滴定至呈粉红色为终点。计算：T＝73.549m0/V（mg/mL）式中：T＝滴定度：每ml标准溶液相当的mg二氧化硅含量（mg/L）m0－称取基准苯二甲酸氢钾的量（g）V&消耗待标定的氢氧化钠标准溶液的体积（ml）4.试样样品应用K＝0.1的缩分系数加工、粉碎、研磨至通过150目（&0.1mm）筛孔，送化验试样总量大于250g（重要的样品或因需要应在粉碎至&1mm时留大于250g副样保存），待测定的部分试样还应于100℃～110℃烘干1h，于干燥器中冷却至室温，并保存于干燥器中。5.分析步骤5.1试料称取试样0.1000g，当SiO2含量小于5％时称取0.2000g试样。5.2空白试验随同试料作空白试验5.3测定5.3.1将试料（5.1）置于300ml镊（或银、铁）坩埚中，加入4g氢氧化钾（3.1），于高温电炉上加热驱除水分，直至氢氧化钾熔融。移入600℃～650℃马弗炉中继续熔融5min～10min。取出冷却至室温。5.3.2用湿棉球将坩埚底擦净，卧放于250ml的塑料烧杯中，加入50ml沸水缓缓摇动，使与熔块接触，待剧烈反应停止后，缓缓加入20ml盐酸（3.4），用镊子取出坩埚并用热水洗净坩埚。往溶液中加10ml硝酸（3，3）。冷却至室温（若在冬季因有时气温太低，冷却会出现氯化钾的晶体析出，因该晶体中包含有残余酸，洗不净会与氟硅酸钾沉淀在一起，影响测定，所以遇此情况时，可加热溶液使KCl结晶溶解，再进行下面步骤，但是要注意一定将温度控制在＞35℃。当夏季室温超过35℃，会影响氟硅酸钾沉淀不完全，也需要控制在＞35℃），逐渐地边搅拌边加KCl粉，如溶解则再加，直至在搅拌下有少量KCl粉不溶解剩余下来（此时溶液已成为氯化钾饱和溶液），约加KCl（3.2）粉3g～5g加少许泸纸浆，用塑料量杯加10ml氟化钾溶液（3.5），以塑料棒搅拌1min～2min，放置片刻。5.3.3在塑料漏斗上用氯化钾&乙醇洗液（3.6）将快速滤纸调好（用水调的滤纸，调完后要用氯化钾&乙醇洗液洗涤3次以上），过滤，当溶液流完后，用氯化钾&乙醇洗液（3.6）洗塑料烧杯2～3次，洗沉淀5～7次，洗去绝大部分游离酸。展开滤纸及沉淀，贴在原塑料烧杯壁上（如要短时间存放则浸入氯化钾&乙醇洗液中）加入10ml氯化钾&乙醇洗液（3.6）。5.3.4加2ml溴麝香草酚蓝－酚红指示剂（3.7），用氢氧化钠标准溶液，小心滴定中和残余的游离酸至蓝紫色为第一终点（可不计数）。加入150ml沸腾的中和水（3.8），搅拌使氟硅酸钾分解析出游离酸，用氢氧化钠标准溶液（3.9）滴定至亮蓝紫色为（第二）终点，记下消耗的体积。6.分析结果的计算按下式计算二氧化硅的质量分数：w(SiO2)%=TV/10ms式中：T&氢氧化钠标准溶液对二氧化硅的滴定度（mg/mL）V&滴定第二终点时消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）ms&试料量（g）方法二：氟硅酸钾滴定法测定硅合金中硅量1.主题及测定范围：该方法适用于硅铁、硅猛、锰铁、硅钙等硅系列合金试样，（操作的溶液中含Si量在0.5mg～50mg的范围内）含硅量的测定。2.方法提要：试样用碱熔（亦有用氟酸与其它混酸溶解）酸化，在含有3mol/L硝酸（含有盐酸但浓度以硝酸计）的溶液中，加KCl使呈KCl的饱和溶液，于该溶液中加入KF，使Si呈K2SiF6&，用KCl饱和的30％～50％乙醇溶液洗涤氟硅酸钾沉淀中，所含残余的游离酸。纯净的氟硅酸钾在沸水中水解，析出游离酸，用氢氧化钠标准溶液滴定游离酸，计算SiO2的含量。3.试剂3.1氢氧化钾（钠）3.2氯化钾3.3硝酸：&=1.42g/ml3.4盐酸&＝1.19g/ml3.5氟化溶液200g/L于塑料器皿（瓶）中配制或保存3.6氯化钾&乙醇洗液乙醇＋水＝1＋2加KCl至饱和3.7溴麝香草酚蓝&酚红指示剂溴麝香草酚蓝及酚红指示剂，各取0.2g溶解于20ml无水乙醇中，加30ml热水，搅拌使完全溶解，混匀。3.8中和水将本次测定所需的中和水盛于3000ml锥形瓶中，于电炉上煮沸加2ml溴麝香草酚蓝&酚红指示剂，滴加氢氧化钠标准溶液（3.9）至呈蓝紫色。3.9氢氧化钠标准溶液t:.86mso-char-indent-count:1.0&align=&left&&3.9.1氢氧化钠储备溶液：c（NaOH）&1mol/L称取40gNaOH溶解于1000ml，煮沸过的蒸馏水中，并加10ml浓度为200g/L的Ba(OH)溶液，储存于塑料瓶中。置暗处3天～4天后使用。3.9.2氢氧化钠标准溶液配制：c（NaOH）&0.074mol/L。取75ml氢氧化钠储备液（3.8），以新煮沸并冷却至室温的蒸馏水稀释至1000ml，混匀。氢氧化钠标准溶液的标定：标定法有多种，介绍一种直接标定法：称取0.1000g～0.5000g基准苯二甲酸氢钾（经105℃干燥1h，并在干燥器中冷却至室温）三份，分别于经烘干的250ml三角瓶中，加100ml沸水，及4滴酚酞指示剂（酚酞10g/L乙醇溶液），用待标定的氢氧化钠标准溶液（3.9.1），滴定至呈粉红色为终点。计算：T＝73.549m0/V（mg/mL）式中：T＝滴定度：每ml标准溶液相当的mg二氧化硅含量（mg/L）m0－称取基准苯二甲酸氢钾的量（g）Vtwffan=&done&&&消耗待标定的氢氧化钠标准溶液的体积（ml）4.试样样品应用K＝0.1的缩分系数加工、粉碎、研磨至通过150目（&0.1mm）筛孔，送化验试样总量大于250g（重要的样品或因需要应在粉碎至&1mm时留大于250g付样保存），待测定的部分试样还应于100℃～110℃烘干1h，于干燥器中冷却至室温，并保存于干燥器中。5.分析步骤5.1试料称取试样0.1000g，当SiO2含量小于5％时称取0.2000g试样。5.2空白试验随同试料作空白试验5.3测定5.3.1将试料（5.1）置于300ml镊（或银、铁）坩埚中，加入4g氢氧化钾（3.1），于高温电炉上加热驱除水分，直至氢氧化钾熔融。移入600℃～650℃马弗炉中继续熔融5min～10min。取出冷却至室温。5.3.2用湿棉球将坩埚底擦净，卧放于250ml的塑料烧杯中，加入50ml沸水缓缓摇动，使与熔块接触，待剧烈反应停止后，缓缓加入20ml盐酸（3.4），用镊子取出坩埚并用热水洗净坩埚。往溶液中加10ml硝酸（3，3）。冷却至室温（若在冬季因有时气温太低，冷却会出现氯化钾的晶体析出，因该晶体中包含有残余酸，洗不净会与氟硅酸钾沉淀在一起，影响测定，所以遇此情况时，可加热溶液使KCl结晶溶解，再进行下面步骤，但是要注意一定将温度控制在＞pan&35℃。当夏季室温超过35℃，会影响氟硅酸钾沉淀不完全，也需要控制在＞35℃），逐渐地边搅拌边加KCl粉，如溶解则再加，直至在搅拌下有少量KCl粉不溶解剩余下来（此时溶液已成为氯化钾饱和溶液），约加KCl（3.2）粉3g～5g。加少许泸纸浆，用塑料量杯加10ml氟化钾溶液（3.5），以塑料棒搅拌1min～2min，放置片刻。5.3.3在塑料漏斗上用氯化钾&乙醇洗液（3.6）将快速滤纸调好（用水调的滤纸，调完后要用氯化钾&乙醇洗液洗涤3次以上），过滤，当溶液流完后，用氯化钾&乙醇洗液（3.6）洗塑料烧杯2～3次，洗沉淀5～7次，洗去绝大部分游离酸。展开滤纸及沉淀，贴在原塑料烧杯壁上（如要短时间存放则浸入氯化钾&乙醇洗液中）加入10ml氯化钾&乙醇洗液（3.6）。5.3.4加2ml溴麝香草酚蓝－酚红指示剂（3.7），用氢氧化钠标准溶液，小心滴定中和残余的游离酸至蓝紫色为第一终点（可不计数）。加入150ml沸腾的中和水（3.8），搅拌使氟硅酸钾分解析出游离酸，用氢氧化钠标准溶液（3.9）滴定至亮蓝紫色为（第二）终点，记下消耗的体积。6.分析结果的计算按下式计算二氧化硅的质量分数：w（SiO2)%=TV/10ms式中：T&氢氧化钠标准溶液对二氧化硅的滴定度（mg/mL）V&滴定第二终点时消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）ms&试料量（g）
回答者:章紫弘
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MTT使用讨论总结(附MTS测定方法)07
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快速链接[和讯博客][发表文章][博客设置][文章管理]搜索 分类友情链接培养箱里的湿度条件控制的比较好, 要不就需要弃取周围两轮孔的数据.另外,有些时候在需要加入不溶性颗粒状药物的情况下测定细胞的增殖情况, MTT法就比传统计数法或台盼蓝法效果好, 测定速度快, 不容易引起误计.总的来说, 我认为在基本固定培养条件的情况下, 可以考虑一次性的多选择几种方法来确定细胞增殖的特征曲线(特别是刚买回的细胞的第一次测定), 得到相互修正的关系,而以后在应用中可以根据具体情况采用一种比较方便的方法来做,特别是一些摸索性的实验,都用H3做, 那除非你自己就是核医学部的,天天去求人也挺烦. shao_qx?就我的感觉和自己的实验过程中的得失来看，眙盼蓝记数，重复性和稳定性相差比较大，同一样本在重复记数时差别比较大，主要是稀释度的问题，细胞过多（一个大格超过100）或太少（低于20－30），其记数的可信度就比较差。MTT的方法不够敏感，而且如果不是贴壁细胞的话，在离心后去除培养基是容易丢失细胞，造成孔间平行度比较差。3H-TdR的敏感度非常好，但是重复性不是特别好，孔间差距比较大，而且不同时间的重复试验时CPM值可以相差比较大。可以通过寻找比较好的细胞浓度，确定掺入时机（细胞处于对数生长期）和掺入时间来弥补。至于在比较高档次的杂志发表文章可能与作者的 ideal和实验室的背景，boss的知名度和有关系，同时审稿者的态度很有关系，我们实验室投稿的稿件在回复的意见中就有完全相反的说法，此外可以拒绝日本人审稿，日本人对来自中国的作者特别不友好，其次澳洲的审稿人有部分也不十分友好！！老外也有关系学的。====================================================二、uhouuhou总结的MTT讨论zzy8896MTT有下面一些优点：1、有灵敏度高，重复性好，2、操作简便、经济、快速、易自动化的优点，3、而且没有3H―TdR掺入试验放射性污染，4、还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素所以可以选择这种实验方法jiangqlMTT 理论可以参见司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养. 西安：世界图书出版社. 1996.MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 四唑盐. 实验结束前，如杀伤实验或生存曲线培养48h后，加入5mg/mL的MTT 10μL，继续培养4h后离心弃上清，加入DMSO150μL溶解MTT，选择490nm或550nm波长，在酶联免疫检测仪上测定OD值。有3体会：1.MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。2.贴壁细胞效果好，悬浮细胞要离心2500rpm×10min，室温, 再吸去培养液，加入DMSO。3.如果实验孔不多，DMSO加入后可以用枪头吹打混匀，比振荡溶解效果好。Seattle78MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT，原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan，后者的产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长560nm进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。优点：灵敏度高，操作简便，自动化。缺点：影响因素多，重复性较差。注意：MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。Midas以下的protocol供参考：－－1. Make a solution of 5 mg/mL MTT1 dissolved in PBS and filter sterilized.－－2. 5 hours before the end of the incubation add 20 uL of MTT solution from step one to each well containing cells.－－3. Incubate the plate in a CO2 incubator at 37 oC for 5 hours.－－4. Remove media with needle and syringe.－－5. Add 200 uL of DMSO to each well and pipette up and down to dissolve crystals.－－6. Put plate into the 37 oC incubator for 5 minutes.－－7. Transfer to plate reader and measure absorbance at 550nmgoodfreecn四唑盐(MTT)比色试验(1)MTT溶液：称取250mg MTT，放入小烧杯中，加50ml；PBS(0．01mol／L，pH7．4)在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存。两周内有效。(2)含l0％胎牛血清RPMl 1640培养液、o．25％胰蛋白酶二甲基亚砜(DMSO)(使用分析纯产品)(3)96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、可调移液器、吸管、离心管、计数板(4)孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪[步骤](1)接种细胞：用o．25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含 10％胎牛血清的RPMlt604培养液配成单个细胞悬液，以每 孔100－1000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。(2)培养细胞；将培养板移入COz孵箱中，在37℃、5％CO2：及湿度条件下，培养3―5天．(培养时间取决于实验目的和要其求)(3)呈色：培养第2―5天后，每孔加入MTT溶液(5mg／m1)20ul，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对：浮生长的细胞，需离心,(1000rpm．5min)，然后弃去孔内培养每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。(4)比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。[注意事项l(1)选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有lo‘个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。(2)避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于lo％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。(3)设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。其它试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。FredericMTT原理简单说就是：MTT能被活细胞的酶作用，从而发生变色，变蓝！！用OD550/OD490策的吸光度，活细胞多则吸光度大，反之则吸光度小。从而反映出你的细胞的死亡率，即药物的作用！用来检测凋亡，用于抗肿瘤药物的筛选，在美国的很多公司，也用它来粗筛！我就做过肿瘤药物的筛选，很方便，96孔板做机组不同的药物浓度，分设阳性药物、阴性对照（也作不同梯度），对比结果既可！我觉得其中的难点是：１、细胞分板时，要充分分散，而且要家几个空就重新吹散一次，否则，细胞浓度就会不同。（我曾经试验过，用后加的孔作试验组与用先加的孔作对照组，结果有些差异，也许是我的熟练程度不行！）另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。２、培养后，细胞的培养既要吸干净，否则，残留的蛋白会对ＭＴＴ有一定的吸附作用，影响就过准确性。我使用的是翻转法，将培养液倒掉，这样做很简便，又很快洁。重复性也不错。３、测吸光度值要有一定的时间范围，在测定是你会发现，随着时间的推移没空都会变深些，（这可能是由于ＭＴＴ在空气中氧化的结果，我记不清了，你再找找书，另外，具体时间我也没有记清）４、养性药物的选择，要选择经典的，有说服力的，又对你的细胞有很好的杀伤了力的药物。别认为简单，我就曾经因为阳性药物选择错误而重新做试验，惨痛的教训呀！！Gujun我读书时应用MTT作肿瘤细胞株药敏，采用以下文献“周建军，乐秀芳，韩家娴，等。评价抗癌物质活性的改良MTT方法。中国医药工业杂志 ）：455-6”。该方法为上海中科院细胞所所采用，MTT产物应用三联液溶解彻底，不需振荡，对于悬浮细胞尤其适合，且产物稳定。对于贴壁细胞，他们那时采用SRB方法。简要方法（我的肿瘤药敏实验）：1. 将一定密度的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔微量培养板内,然后加入药液10μl/孔,每种药5个浓度(每个浓度相差10倍),一个浓度设4个复孔。每块板设一个空白调零孔,内加培养液，不含细胞与药物。每种细胞设6个正常对照孔,加样100μl/孔，不含药物。接种完毕后在37℃， 5%CO2条件下孵育培养48小时。2.加MTT：加MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔,混匀后37℃，5%CO2 条件下孵育4小时。3.加三联液：（三联溶解液：SDS 10g， 异丁醇 5ml ， 10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液） 加溶解三联液100μl/孔，混匀后37℃放置过夜以溶解甲N。4．吸光度（A）测定：用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，校正波长为630nm。5.计算：肿瘤抑制率=（对照组A值－治疗组A值）／对照组A值×100%， IC50值用Logit法计算。Wizard回答淋巴细胞增殖1. 应避免稀释MTT，可去培养液，但为简便起见，可以用直接翻板法。翻板后，每孔大约残留液体20ul左右。，MTT最终浓度0.5-1mg/ml。2. 对于DMSO等有机溶剂溶解的时间不能过长，如10min就可以获得结果。3. 96孔细胞培养板接种细胞数应在（0.5-2）×10E4范围，细胞过多，会使MTT等完全降解或细胞拥挤不能单层生长，使光吸收度降低，影响结果。 MTT染色后，96孔板中的上清弃去后是否要用PBS洗一下再加DMSO？另外是用排枪吸去上清液呢，还是甩干即可？遇到不贴壁的细胞如何让细胞不流失？eeflyingＭＴＴ法是一种通过测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况的检测方法。MTT全名四甲基偶氮唑盐，为淡黄色可溶性化合物，或细胞特别是增殖期细胞可通过线粒体能量代谢中的琥铂酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解，形成蓝色结晶状fomazan，沉积于细胞内或细胞周围，形成量与细胞增殖状况成正比，直接地说，是与线粒体的呼吸状态成正比。从上述机理可以得出：1.??不必洗，MTT与fomazan的颜色不同，吸光谱也不同，实际上我们测得是OD570的吸收光，你可以自己测一下，实际MTT的吸光度在此波长很小。其实fomazan对细胞是有害的，部分细胞就死掉了，formazan的结晶在其周围，要洗不就丢了？我们加DMSO,SDS,酸化异丙醇其实只是溶解剂。2.??到是必要注意酚红的影响，酚红是影响D值的测定，要设白对照组。 悬浮细胞ｍｔｔ，何时加药物？细胞接种９６孔板时？？？Lzchengfeng一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细胞是上板同时加。但是，我个人的经验，药物加的时机并不是固定的，具体要根据你实验本身的要检测的指标。如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。但是，如果你要检测的是其他一些指标，比如，如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁 以前就要加药了。eeflying贴壁细胞一般在试验前1-2日接入９６孔板，太晚，细胞在传代后有一个１６小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的MTT数值太低了，太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高，让试验时落在对数早中期最好。 我现在在作星形胶质细胞药物作用后的MTT，但结果总是不理想，同一组的数值差别都特别大。请教各位，作MTT应该特别注意些什么？ wizard1.??必须有适宜的效靶比，因为MTT是线粒体酶底物，效应细胞及靶细胞均能掺入，如果效应细胞数量太大，MTT掺入量太高，则不能有效地反映靶细胞的杀伤状态。2.??建议每一组均做一个空白对照，因浓度不同的底物可能会有不同的结果，如果只做一个空白对照可能会有影响。ylcui我再谈些实际经验：首先，加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。其次，如果用96孔板，周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因，会误差很大，尽量不用。最后，溶解甲N时，如果是悬浮细胞或细胞贴壁不牢，尽量用酸性SDS溶解，不要弃去培养液，以免细胞损失。这还要求最后加入药物和MTT时，血清浓度低于10%。 对照问题fengyouxin个人认为MTT中最重要的是背景对照，就是不加细胞的对照。这包括两方面内容，一是指与实验孔相同，对照孔中也加入相同体积的培养基，各做3-4复孔，取平均值，主要目的是为了减少培养基含有的酚红对比色的影响；二是要在对照孔内加入与实验孔相同成分和浓度的药物（特别是药物PH值为酸性或碱性时），同样也是为了减少比色时的误差。还有人主张采用空白对照，典型的做法是再加DMSO时，将实验孔周围的各孔内都加上相同体积的DMSO，据说可以减少比色、读数的变异系数，但个人经验认为有没有无甚大碍。 1.测量波长的问题，我在文献上见有用490nm，还有用570nm，甚至还有选用其他波长的，不知波长的选择是根据什么做出来的？2.我在文献（Freshney RI. Culture of animal cells：a manual of basic technique. Third Edition. A John Wiley & Sons, Inc, Publication. New York.1994.）中见到，在用DMSO溶解结晶紫以后，再加入Sorense‘s缓冲液（0.1M氨基乙酸，0.1MNaCl，用1MNaOH调节pH至10.5），不知Sorense’s缓冲液在此处是什么作用？3.我是用DMSO溶解结晶紫的，我遇到一个老师，他说我这是一个老土的办法，建议我改用SDS，不知DMSO与SDS的区别在什么地方？有什么优缺点？gujun关于波长的选择，我在实验前也查了不少资料，测定波长（measure absorbance）范围在550－ 600 nm，校正波长（measure absorbance）大于650 nm，根据你处仪器情况，具体选择。（我查到多数外文文献中提到的测定波长为570nm，校正波长为630nm。）这样选择的原因见附图，图中虚线部分为MTT紫外吸收光谱，实线为甲N（formazan）吸收光谱，可见550－600nm为甲N的吸收高峰，在该范围内测定可提高检测的敏感性，且避免MTT干扰。而选择校正波长是为了去除细胞碎片，指纹（？）或其他非特异因素造成的干扰（reduce backgroundcontributed by excess cell debris, fingerprints and other nonspecific absorbance.），当然你可以不选择校正波长，在国内的不少文章中，并没有选择校正波长，但国外文章一般都选择。再上传有关文章，见附件，正所谓言之有据。另外，我建议zhjrun兄有空再到pubmed等数据库中搜索有关文章，会有一个全面了解，不能只听一面之辞，我想作为一个研究人员应该这样。关于选择490nm为测定波长，我看到文献中MTS作用产物最佳测定波长为490nm，若需要了解具体情况，也见所上传的附件。另外在丁香园中也有MTT有关讨论，你可以去看看，我采用的是三联溶解液，在帖子中也提到，我当时是到中科院药研所请教有关老师的（不是细胞所），具体方法可见该帖中文献。祝实验顺利！ 我做的MTT比较多，第一次听说这种情况，的确奇怪。是不是半胱氨酸与MTT可以发生反应？ 我想不会，因为相关文献上报道过用MTT法做homocysteine的细胞毒性实验。（请看链接中的几篇摘要：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=Display&DB=PubMed）。个人认为，您的试剂或者操作有问题。下面给您几点建议：1.首先搞清楚使用的MTT、homocysteine等试剂有无问题；2.尽可能使用新的96孔板，特别注意，在37度4小时后，必须在1500rpm下离心十分钟，使沉淀完全，然后才可弃上清，加入DMSO。还有每孔内加入细胞的数量要适中。3.细菌或霉菌等污染不能排除，理由：（1）加入MTT后很快出现紫色。应该不会。有的时候低度污染或是某些微生物污染的时候挺难发现，而且培养的细胞也能生长，这时候就容易出现上述现象，液体肯定是紫色的，倒上清时一块连细菌什么的都倒了，剩下的沉淀就少了，我想这时加入DMSO肯定是粉红色的；（2）单独把MTT加入同型半胱氨酸培养液后也出现紫色。这更是离谱。MTT的原理为活细胞内的线粒体脱氢酶将黄色的 可溶性四唑盐MTT还原为紫蓝色不溶结晶formazan，难不成您的培养液内有活细胞？所以我高度怀疑您的同型半胱氨酸培养液被污染了，建议取一点涂片，请一位老手看看，必要时送检验科做细菌培养。您不妨更换培养液试试。4.生长曲线的测定不止MTT方法一种，直接细胞计数都行，只要认真操作准确性也差不了哪里去，有很多参考书上都有这个方法，在这里就不多说了。请您按上述要求再做做看，无论什么结果都请继续跟帖讨论。Myf真的很有意思。我请教了一位实验室的前辈，她也是第一次遇到这种现象。她认为不是污染的问题，因为将半胱氨酸培养液直接与MTT相加不到一分钟即可出现紫色，不用孵育，直接加入DMSO就出现粉色，而且其酶标值随浓度改变成弧形曲线。如果是污染的话，MTT与线粒体的酶结合也需要两小时以上。很快显色的原因，可能是半胱氨酸的巯基与MTT反应所致。建议我直接做细胞计数，用胎盘兰染色。不知道还有没有更简便准确易行的方法，以前介绍过的MTS行吗？真的很简便吗？大约需要多少钱？ 可是我以同样的方法做细胞系,却没有这样的情况呀.在加入MTT前在倒置显微镜下观察该原代细胞见其密度及折光性都很好!!不知是否可能是这种情况:原代细胞的细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶没有类似于细胞系的活性?? Midas琥珀酸脱氢酶是琥珀酸氧化呼吸链（氧化呼吸链之一）里重要的复合酶之一，它位于线粒体的内膜上，催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，从而使FAD接受两个氢原子生成FADH2，然后再将氢传递给CoQ，生成CoQH2，继续呼吸链的电子传递过程。所以说琥珀酸脱氢酶是细胞能量产生过程中重要组成酶之一，dancer786您说的“原代细胞的细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶没有类似于细胞系的活性??”不知道有没有其他的理论或实验根据，如果没有的话，就应该可以用MTT检测出琥珀酸脱氢酶的活性！在下次重复实验时请注意：加入DMSO之前，在倒置显微镜下观察（BF），确保有紫色结晶形成。 以前我曾发过MTT的帖子，得到了各位老师的热心帮助，我非常感谢他们！我现在又遇到问题了，只好再次求助，盼望能继续得到大家的帮助。96孔板每孔加入浓度为3X10（E6）的小鼠脾细胞100ul然后加液如下：第一行：高浓度胎盘肽100ul第二行：中浓度胎盘肽100ul第三行：低浓度胎盘肽100ul第四行：最低浓度胎盘肽100ul第五行：高浓度ConA100ul,终浓度10ug/ml第六行：中浓度ConA100ul,终浓度5ug/ml第七行：低浓度ConA100ul,终浓度2.5ug/ml第八行：完全1640培养液100ul，作为对照然后培养，加MTT，加DMSO，比色都如常我的目的在于评价胎盘肽的作用。实验结果却发现第一行：高浓度胎盘肽 与 第八行：完全1640培养液 的OD高其他行OD都低我的问题是：1。高浓度ConA可以引起细胞调亡，但为什么低浓度ConA的OD值仍低于对照？2。免疫调节剂一般大剂量可起抑制作用，小剂量可起促进作用。若胎盘肽大剂量起促进作用或不起作用，而同时小剂量不起作用（OD和对照的OD相等）我还可理解。但为何胎盘肽大剂量OD与对照OD持平，而小剂量起抑制作用（OD低于对照的OD）？Ylcui几个建议：1。96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低，原因最简单不过了，温度梯包含各类专业文献、高等教育、外语学习资料、生活休闲娱乐、文学作品欣赏、幼儿教育、小学教育、应用写作文书、MTT使用讨论总结(附MTS测定方法)07等内容。　
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