RT-PCR qpcr扩增效率率不稳定，求助

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-04-26 04:48 标签： 荧光定量pcr扩增曲线
&& 查看话题
PCR扩增片段大小与目的片段不符，请指教可能问题，附图
电泳如图，我做的是MLST，测7个目的基因，采用了国际上推荐的引物，参照推荐的温度基础上用梯度pcr优化了退火温度：第1、3、5为57度，其余为55°C(推荐温度)，终于将每个基因电泳图都取得单一明亮条带，只是有几个（图中标注了4个）大小与目的基因片段大小不相符，但是又差别不是很大，劳各位估计一下。
& && &老师说不知道是什么东西，先试试测序看结果如何。外送测序时，测序引物也是采用国际上推荐的送英俊测序，返回只有2个基因（图中第二、七）是对的，其余无信号，请大家指教可能的问题，拜谢！
QQ图片51.jpg
从胶上观测到的大小本身有一定误差，一切以测序结果为准。PCR产物产物直接测序可能导致信号不好，最好纯化后再测序。有时候PCR产物在胶上一条带但实际上是多种分子量接近的混合物，保险起见可以克隆到载体后再测序。 我是来看答案的~ : Originally posted by cicelyzh at
从胶上观测到的大小本身有一定误差，一切以测序结果为准。PCR产物产物直接测序可能导致信号不好，最好纯化后再测序。有时候PCR产物在胶上一条带但实际上是多种分子量接近的混合物，保险起见可以克隆到载体后再测序。 谢谢，我这些是给公司纯化的了，是不是要求公司再测一次呢 : Originally posted by juanly at
谢谢，我这些是给公司纯化的了，是不是要求公司再测一次呢... 可以再试一次。PCR的条件也最好能优化一下。 : Originally posted by cicelyzh at
从胶上观测到的大小本身有一定误差，一切以测序结果为准。PCR产物产物直接测序可能导致信号不好，最好纯化后再测序。有时候PCR产物在胶上一条带但实际上是多种分子量接近的混合物，保险起见可以克隆到载体后再测序。 中间断断续续的找其他条件，始终条带大小都是不符合目的基因的大小，月初硬着头皮在测序一次，居然全都出来了，比对了一下是有扩增出目的条带的，我心痛那中间浪费的时间啊，呜呜
var cpro_id = 'u1216994';
欢迎监督和反馈：本帖内容由
提供，小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。欢迎协助我们监督管理，共同维护互联网健康，如果您对该内容有异议，请立即发邮件到
联系通知管理员，也可以通过QQ周知，我们的QQ号为：8835100
我们保证在1个工作日内给予处理和答复，谢谢您的监督。
小木虫，学术科研第一站，为中国学术科研研究提供免费动力
广告投放请联系QQ： &
违规贴举报删除请联系邮箱： 或者 QQ:8835100
Copyright &
eMuch.net, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有关于RT-PCR扩增效率的问题初做RT-PCR,仪器会自动给出吗?我们用的Agilent Mx3000P,好像没有给出这个值,我要怎么得知这个值?_百度作业帮
关于RT-PCR扩增效率的问题初做RT-PCR,仪器会自动给出吗?我们用的Agilent Mx3000P,好像没有给出这个值,我要怎么得知这个值?
初做RT-PCR,仪器会自动给出吗?我们用的Agilent Mx3000P,好像没有给出这个值,我要怎么得知这个值?
做标准曲线时才有扩增效率,在仪器设定的时候选择标曲制作.
你好，我最近也在做，我做的是半定量，问了很多的师哥师姐，据我自己理解应该是用Ct值来反应扩增效率的，它没有绝对的值，只是说相对的效率吧，相同引物，不同的反应条件扩增效率不同，非要知道的话可以根据Ct值相对估计一下吧
您可能关注的推广回答者：&& 查看话题
qPCR的标准曲线成线性很差，扩增效率低，是什么原因
如题。最近在分析一个家族中三个基因的表达，试引物的时候发现溶解曲线只有一个峰，但是标准曲线成线性很差，计算出来的扩增效率不在90—110%之间。求大虾指点迷津。
内参溶解曲线.JPG
内参标准曲线.JPG
内参溶解曲线.JPG
基因1标准曲线.JPG
怎么没人回复啊。。。:cry:
目的基因1的溶解曲线.JPG 不懂，帮顶 引物的特异性很好，有可能是你的标准曲线没做好，比如稀释的不准，如果标准曲线没有问题的话，那你的引物不能用，扩增效率太差 : Originally posted by gyesang at
引物的特异性很好，有可能是你的标准曲线没做好，比如稀释的不准，如果标准曲线没有问题的话，那你的引物不能用，扩增效率太差 谢谢。 标曲可以3倍3倍的稀释，如果10倍10倍的稀释后几个点会太低，识别不了，可能导致虚假扩增
var cpro_id = 'u1216994';
欢迎监督和反馈：本帖内容由
提供，小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。欢迎协助我们监督管理，共同维护互联网健康，如果您对该内容有异议，请立即发邮件到
联系通知管理员，也可以通过QQ周知，我们的QQ号为：8835100
我们保证在1个工作日内给予处理和答复，谢谢您的监督。
小木虫，学术科研第一站，为中国学术科研研究提供免费动力
广告投放请联系QQ： &
违规贴举报删除请联系邮箱： 或者 QQ:8835100
Copyright &
eMuch.net, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有丁香客App是丁香园社区的官方应用，聚合了丁香园论坛和丁香客的精彩内容。医生可通过丁香客App浏览论坛，也可以在这个医生群集的关系网络中分享和互动，建立更广泛的学术圈子。
扫描二维码下载
今日：6 | 主题：260484 | & 收藏本版
每发1个新帖可以获得0.5个丁当奖励
【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
分享到哪里？
这个帖子发布于2年零279天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
我做RT-PCR遇到如下问题。望高手指教， 万分感激。（1）目的基因标准曲线不好。我是稀释五个梯度：1, 1/4, 1/16, 1/64, 1/256。 1与1/4 梯度曲线基本重合，1/64 与1/256 曲线基本重合。如果取1/4, 1/16, 1/64三个梯度，标准曲线是否不错。（2）同一样品，重复性极差。 我每个样品重复三次， 三个曲线相差很大。补充说明：目的基因的表达量较低，在40个循环左右才能达到平台期； 内参GAPDH标准曲线很好，内参同一样品的重复性也很好。 目的基因标准曲线
GAPDH标准曲线
idmzhuxq edited on
回复：【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
分享到哪里？
“内参GAPDH标准曲线很好，内参同一样品的重复性也很好”说明操作没问题。至于目标基因，那是因为浓度太低导致扩增失败，这种情况重复性当然差。而且这么后面的Ct值应该很多杂志会质疑的。你应该看一下目标产物的电泳结果，个人估计应该全是primer dimer，属于根本没扩出来。
回复：【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
分享到哪里？
我跑了目的基因标准曲线的电泳。请各位给些建议。谢谢！
回复：【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
分享到哪里？
idmzhuxq 我跑了目的基因标准曲线的电泳。请各位给些建议。谢谢！有时候如果目标分子浓度本身就很低的话有时候就是没办法的。你可以试着先增加模板量试试（最好10倍比例增加，否则效果不明显）。不行的话可以想办法提高RT或RNA提取效率，比如你原先用自己配的试剂提RNA的话，可以考虑用商品化的试剂或Kit。还有就是重新设计引物或在文献中找现成的引物，因为有可能你现在用的引物扩增效率较低。
回复：【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
分享到哪里？
chao_yw 有时候如果目标分子浓度本身就很低的话有时候就是没办法的。你可以试着先增加模板量试试（最好10倍比例增加，否则效果不明显）。不行的话可以想办法提高RT或RNA提取效率，比如你原先用自己配的试剂提RNA的话，可以考虑用商品化的试剂或Kit。还有就是重新设计引物或在文献中找现成的引物，因为有可能你现在用的引物扩增效率较低。我还发现GAPDH的溶解曲线不对。你能给我解释一下吗？谢谢
回复：【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
分享到哪里？
idmzhuxq 我还发现GAPDH的溶解曲线不对。你能给我解释一下吗？谢谢有些难判断，最后两张是单峰，原则上是单一产物。前三张比后两张中多出来一个峰，且其Tm值更高，所以这个峰应该不是primer dimer。如果后两张图的单峰是GAPDH，那么前三张图中的杂峰是由于其他错配情况导致的，这种情况下你就用稀释度高一些的RT产物做定量就可以了。如果前三张图中多出来的那个峰是GAPDH，那么很有可能后两张图中看到的峰是primer dimer，那只能提高模板浓度来减少primer dimer的产生。具体哪种情况你可以将上述产物跑个电泳根据大小判断。
回复：【求助】RT-PCR 扩增效率不稳定！求助
分享到哪里？
请问怎样做RT-PCR 引物的标曲。我是把cDNA按十倍的浓度稀释的，做出来的实验结果不知道怎么计算数据。麻烦楼主能不能发我一些资料什么的，让我参考一下。不胜感激。我的邮箱
关于丁香园 下载
 收藏
该文档贡献者很忙，什么也没留下。
 下载此文档
正在努力加载中...
RT-PCR不得不注意的几点
下载积分：800
内容提示：RT-PCR不得不注意的几点
文档格式：DOCX|
浏览次数：0|
上传日期： 12:04:27|
文档星级：
该用户还上传了这些文档
RT-PCR不得不注意的几点.DOCX
道客巴巴认证
机构认证专区
加  展示
享受成长特权
官方公共微信

我要回帖

更多关于 荧光定量pcr扩增曲线 的文章

 

随机推荐