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HPV18E7抗原HLA—A2限制性CTL表位的初步筛选及鉴定
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HPV16E7抗原HLAA2限制性CTL表位鉴定及其分子修饰的实验研究
第三军医大学 博士学位论文 HPV16E7抗原HLA-A2限制性CTL表位鉴定及其分子修饰的实验研 究 姓名：徐云升 申请学位级别：博士 专业：皮肤性病学 指导教师：郝飞
第三军医大学博士研究生论文ＨＰＶ１６Ｅ７抗原ＨＬＡ．Ａ２限制性ＣＴＬ表位鉴定及其 分子修饰的实验研究＋摘 要人体感染的ＨＰＶ常见型别分为良性型ＨＰＶ６、１１型和恶性型ＨＰＶｌ６、１８型等。ＨＰＶ 感染后可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病，特别是恶性型ＨＰＶ感染与宫 颈癌的发生密切相关。ＨＰＶ基因组中Ｅ区可分为８个开放读码框，分别参与ＤＮＡ复制、 转录、翻译、调控等，Ｅ７主要与细胞转化功能及致癌有关，因此在研究中倍受重视。 目前临床上应用的干扰素等抗病毒治疗效果不确切，迫切需要寻找一种有效清除ＨＰＶ 感染以防止尖锐湿疣复发和宫颈癌的发生。对Ｅ７抗原的ＣＴＬ表位进行预测，在国内外 相关研究基础上筛选抗原性更强的表位，进行多肽的表位修饰、制备相应的治疗性肽 疫苗无疑具有重要的临床意义，本课题就相关问题作了探索性研究。Ｅ７抗原的ＣＴＬ表位可以被ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３分子递呈，而我国ＨＬＡ―Ａ２阳性人群高达５３％左右，故预测Ｅ７抗原的ＨＬＡ―Ａ２限制性表位具有重要的现实意义。本研究采用 超模体方案、多项式方案与量化模体方案等对Ｅ７抗原的ＨＬＡ―Ａ２限制性ＣＴＬ表位进行 预测，综合考虑预测结果确定了Ｅ７ ７．１５（Ｐ１）、Ｅ７ １１－１９（Ｐ２）、Ｅ７ ４９．５７（Ｐ３）、Ｅ７６６．７４（Ｐ４）和Ｅ７ ８２＿帅（Ｐ５）作为合成对象。对已经预测出的ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位，采用标准Ｆｍｏｃ方寨合成多肽，产物经ＲＰ―ＨＰＬＣ纯化、分析，并进行质谱分析鉴定。根 据不同九肽疏水性的差异选择不同的流动相达到了满意的分离提纯效果，ＲＰ―ＨＰＬＣ纯 化后，获得了纯度高于９５％的九肽产物，经质谱测定分子量所得测定值与理论值相符 合。高纯度的合成肽为表位筛选与鉴定奠定了前提和基础。对合成、纯化和经过质谱 鉴定的多肽，运用敏感性和特异性较高的细胞毒性实验（ＬＤＨ释放法）进行表位鉴定， 经过特异性杀伤实验对照研究确定其特异性的抗原作用，结果发现ＨＰＶ１６ Ｅ７１１∞（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）和ＨＰＶ １６ Ｅ７ ４９－５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）属于ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位。实验结果对于ＨＰＶ感染治疗性肽疫苗分子设计以及临床应用试验奠定了可靠的研究基础。在前面对ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原表位的研究中发现，从理论上分析与ＨＬＡ－Ａ２结合力极高 的Ｐ１、Ｐ４和Ｐ５，并不具备相应的抗原性。因此，为了解多肽间的相互作用关系，采’国家自然科学基金资助项目（ＨＰＶ感染致ＣＴＬ功能缺陷的分子基础，编号：３００７０６９８）Ｖ１第三军医大学博士研究生论文用细胞毒实验（５１Ｃｒ释放法）对Ｔ２细胞同时包被表位和另外一条多肽的方法，观察 多肽是否影响表位诱导特异性ＣＴＬ杀伤靶细胞。实验结果表明，ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原所包含 的多肽序列中，Ｐ１、Ｐ４和Ｐ５与ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位Ｐ２和Ｐ３之间存在明显的竞争 抑制关系， 其主要原因在表位本身与ＨＬＡ－Ａ２分子结合力偏低，当表位与多肽同时包被Ｔ２细胞时，其抗原诱导作用明显受到多肽的影响，因此靶细胞溶破率明显降低。多 肽问的相互竞争抑制作用，可能是ｔｔＰＶ感染局部损害反复发生、病毒难以被机体自发 清除和致癌的重要原因之一，也是进行表位置换修饰的重要依据。 由于Ｉ＇－ＩＰＶｌ６Ｅ７４９－５７作为ＨＩ，，Ａ－Ａ２限制性表位虽然能够诱导特异性ＣＴＬ杀伤靶细 胞，但与ＨＩ．．Ａ－Ａ２的结合力不高，因此本部分实验采取置换修饰的方式，以期鉴定出 结合力更高又同时保留原有抗原性的新表位。对置换修饰初步得出的多肽序列运用量 化模体法比较其与ＨＬＡ－Ａ２分子的结合力，选择量化积分靠前的多肽，应用计算机分子 模拟的方法，从理论上了解多肽与ＨＬ＂Ａ２的结合情况，以确定合成多肽的序列。分 子模拟演示的原有表位Ｅ７４９．卯与另外２条置换多肽的三维结构图和分子动力学模拟显 示：各肽的羧基末端氨基酸残基侧链都指向ＨＬＡ―Ａ２．１分子肽结合槽的Ｆ凹槽：第一位 氨基酸残基定位都相同，其侧链指向溶液；第二位氨基酸残基都定位于ＨＬＡ－Ａ２．１分子 肽结合槽的Ｂ凹槽附近；第二位氨基酸残基的Ｃａ和羧基末端氨基酸残基的Ｃａ之间距离分别为Ｐ３（Ｅ７ ４９ ５７）１７．８６ Ａ、Ｐ。（ＲＬＨＹＮＩＶＴＦ）１７．８６ Ａ和Ｐ＠（ＲＬＨＹＮＩＶＴＶ）１７．７２Ａ。各九肽进入ＨＬＡ．Ａ２．１分子肽结合槽后，都能被肽结合槽中部所容纳。因此，２条修饰多肽可能成为ＨＬＡ－Ａ２限制性ｃ】几表位，可以进行多肽合成、纯化及其鉴定。 分子模拟结果是进一步实验验证的重要理论基础。 经过分子模拟初步证实后，根据标准Ｆｍｏｃ方案采用固相合成法合成多肽，经 ＲＰ―ＨＰＬＣ纯化、纯度分析，用质谱进行定性鉴定。对经过合成、纯化和鉴定的多肽序 列，运用细胞毒实验（ＬＤＨ释放法）鉴定其抗原性，实验采用包含ＨＰＶｌ６Ｅ７序列、ＨＬＡ－Ａ“的宫颈癌细胞株作为靶细胞，对照肽、Ｐｏ和Ｐ＠诱导特异性ＣＴＬ杀伤靶细胞的结果表明Ｐ国具有诱导杀伤作用，Ｐ＠与对照肽无此作用。因此Ｐ。可初步确定为 ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原ＨＬＡ－Ａ２限制性新的ＣＴＬ表位。其置换的氨基酸位于第２位，置换成 亮氨酸，置换后第二位氨基酸残基的ｃａ和羧基末端氨基酸残基的ｃａ之间距离仍然保持不变，为１７．８６ Ａ；而同时置换第２位和第９位氨基酸的多肽Ｐ＠，第二位氨基酸残基的ｃａ和羧基末端氨基酸残基的Ｃａ之间距离缩短为１７．７２ Ａ，尽管仍然符合ＨＬＡ―Ａ２分子限制性表位要求，但对包含ＨＰＶｌ６Ｅ７序列、ＨＬＡ．Ａ“的宫颈癌细胞株没有诱导ⅥＩ第三军医大学博士研究生论文杀伤作用，没能保留原有表位ＨＰＶＩＥ７４＂７的抗原性。 表位抗原性可以通过相关的体外实验和体内实验来确定。体外实验初步确定了 ＨＰＶｌ６Ｅ７４９．５７及其置换修饰多肽Ｐｏ的抗原性，后续实验通过荷瘤小鼠体内实验，观察 ２种多肽在体内能否诱导特异性ＣＴｌ．．ｓ杀伤靶细胞，进而影响肿瘤的生物学特性，为 临床上肽疫苗分子设计初步确定多肽表位。结果表明，Ｉ＂ＩＰＶｌ６Ｅ７４９＿５７及其修饰肽Ｐ。在 荷瘤小鼠体内能诱导特异性ＣＴＬ产生，有效杀伤靶细胞，控制瘤细胞的血液和淋巴途 径转移，延长平均存活时间；但注射乳化多肽表位不能阻止局部肿瘤的浸润性生长。关键词：人乳头瘤病毒，细胞毒Ｔ细胞，多肽，表位，分子修饰。ｖ１１１墨三兰堕查堂苎主堕壅竺丝苎Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－Ａ２－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ＥｐｉｔｏｐｅｓＤｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｅ７ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＨＰＶ－１６’ ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅ ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）６，１１，１６ａｎｄ１８ａｒｅｔｈｅｃｏｍｍｏｎ Ｉ－ＩＰＶ ｔｙｐｅｓＨＰＶ－１１ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉＯＵＳ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎｂｅｎｉｇｎ ｔｙｐｅｓ，ａｎｄ ＨＰＶ?１６ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌｈｕｍａｎｓ．Ａｍｏｎｇ 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ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｔｈｏｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｔｏ ｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ，ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＣＴＬｅｐｉｔｏｐｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＨＬＡ－Ａ２ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ－Ａ２一ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｉｔ Ｗａｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｕｂｓｄｔｕｔｅｄ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ－Ａ２ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈａｄ ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｐｅｐｔｉｄｅｓｔｗｏｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｔｈｉｓｂｅｃａｍｅ ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（ｔ．ＤＨｒｅｌｅａｓｅａｓｓａｙ）ｗａｓｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅｔｗｏｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．Ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｎｏｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｏ（ＲＬＨＹＮＩＶＴＦ）（Ｐ，ＬｒｎｒＮＩ㈣ｈａｄＣＴＬｓ，ＨＰＶｌ６Ｅ７＋Ｕ１４ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙｔｏＨＰＶｌ７Ｅ７４９－５７，ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄｐｅｐｆｉｄｅ ｔｈｅＰ＠ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＳｏＰ回（ＲＬＨＹＮＩＶＴＦ）ＷａｓｎｏｖｅｌＩ－ＩＬＡ―Ａ２?ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｉｆ ｔｈｅ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｅ７４９－５７ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｅｐｉｔｏｐｅ Ｐｏ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｗａｓｃａｎｉｎｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ６１５ ｍｉｃｅ．Ｉｔｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｔｗｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’Ｓａｄｊｕｖａｎｔ ｃｏｕｌｄ ｐａｒｔｌｙｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ 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宫颈上皮内瘤ＣＡＣＩＮ ＣＴＬ Ｄ ＤＣ ＤＣＣ细胞毒性啉巴细胞天冬氨酸树突状细胞二环己基碳二亚胺 二氯甲烷 二甲基亚砜 谷氨酸乙二硫醇ＤＣＭ ＤＭＳＯＥ ＥＤＴ Ｆ Ｆｍｏｃ ＧＨｄｉｃｈｌｏｍｍｅｔｈａｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ １，２－ｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｃ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｃ苯丙氨酸 ９－芴甲氧羰基甘氨酸９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｃｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ组氨酸 人白细胞抗原 ｐ－羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯 １－羟基苯并三唑 高效液相 人乳头瘤病毒 异亮氨酸 赖氨酸 亮氨酸 朗格汉斯细胞乳酸脱氢酶 蛋氨酸ｌＨＬＡｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｃｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＩ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｄａｚｏｌｅＨＭＰＨＯＢｔ ＨＰＬＣ ＨＰＶ Ｉ ＫＬｈｉｇｈ?ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｌｃｕｃｉｎｅ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ Ｉａｔｉｃ ｄｅｈｙｄｒｏｇｃｎａｓｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅＬＣｓ ＬＤＨＭ第三军医大学博士研究生论文ＭＡ＿Ｐｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ多抗原性肽 主要组织相容性复舍体分钟 质谱 天冬酰胺ＭＨＣｍｌｎｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘｍｉｎｕｔｅｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｎ―ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ ｐｒｏｌｉｎｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎＭＳＮＮＭＰＯｔＢＵＰＮ．甲基吡咯烷酮叔丁氧基 脯氨酸 外周血淋巴细胞ＰＢＬＰＢＭＣＰＢＳ Ｐｍｃ外周血单个核细胞磷酸盐缓冲液２，２，２，７，８?ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ－６一ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｎｅａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｖｅｒｓｅ―ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ ｒｏｕｎｄｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ ｓｅｒｉｎｅ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ２，２，２，７，８－五甲二氢萘一６－磺酰 谷氨酸胺 精氨酸反相高效液相 每分钟转数 丝氨酸ＱＲＲＰ．ＨＰＬＣ ｒｐｍ ＳＴ御ｔＢｕ ＴＣＲ苏氨酸抗原呈递相关转运蛋白ｔｅｒｔ―ｂｕｔｙｌ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｉｔｙｌ ｖａｌｉｎｅ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ叔丁基 Ｔ细胞抗原受体三氟乙酸嗽ＴｎＶ三苯甲基缬氨酸ＶＵＳＷＹ病毒样颗粒色氨酸 酪氨酸ＩＩ第三军医大学博士研究生论文ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原ＨＬＡ＿Ａ２限制性ＣＴＬ表位鉴定及其分子修饰的实验研究＋前常见人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａ言ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）型别分为良性型ＨＰＶ６、１１型和恶性型ＨＰＶｌ６、１８型等。ＨＰＶ感染后可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤（ｃｅｒｖｉａｌｉｎｔｒａｃｐｉｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａ，ＣＩＮ）和宫颈癌等疾病，特别是恶性型ＨＰＶ与宫颈癌发生密切相关。目前临床上应用的干扰素等抗病毒治疗效果不确切，迫切需要寻找一种有效清 除ＨＰＶ感染以防止尖锐湿疣复发和宫颈癌发生的方法。 ＨＰＶ基因组中Ｅ区可分为８个开放读码框，分别参与ＤＮＡ复制、转录、翻译、 调控等。其中，Ｅ７主要与细胞转化功能及致癌有关，作为一种理想的靶抗原在研究中 倍受重视。细胞毒Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍ曲ｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）属ＣＤ８＋Ｔ细胞，其表面 受体与靶细胞上ＨＰＶ抗原特异结合后，在ＭＨＣ Ｉ类分子的介导下，可对靶细胞发挥 溶解杀伤作用。Ｅ７抗原的ＣＴＬ表位可以被ＨＩ．Ａ－Ａ２、ＨＬＡ―Ａ３分子递里，而我国 ＨＬＡ．Ａ２阳性人群高达５３％左右，故鉴定Ｅ７抗原的ＨＬＡ－Ａ２限制性表位，为制备针 对ＨＰＶ感染的治疗用肽疫苗提供候选表位，是一项极为重要的研究工作。 研究发现，慢性ＨＰＶ感染者外周血或局部组织中存在特异性ＣＴＬ，这些ＣＴＬ可 以识别ＨＰＶ编码蛋白中一个或多个表位。基因重组或人工合成的ＨＰＶ蛋白多肽，可 在体外刺激ＣＴＬ细胞，增强其溶解ＨＰＶ感染的靶细胞，且使用的多肷浓度远远低于 体内ＨＰＶ抗原表达的水平。虽然ＣＴＬ在识别ＨＰＶＥ７抗原并清除ＨＰＶ感染中起重要 作用，但即使在ＨＰＶ感染者体内可以稳定地检测到ＨＰＶ特异性ＣＴＬ克隆时，病毒仍 然难以被机体有效清除。因此，尽管感染者体内存在特异性ＣＴＬ克隆，但其功能存在 一定缺陷，可能受到体内或病毒本身因素的抑制。从ＣＴＬ发挥作用的原理来看，推测 可能与变异或可溶性的抗原多肽与ＣｒＬ的表面受体结合阻止ＣＴＬ与被感染的ＨＰＶ靶 细胞发生反应，或者与表位竞争结合靶细胞表面的ＭＨＣ Ｉ类分子，使ＣＴＬ不能发挥 功能有关。Ｅ７抗原可能含有与表位竞争结合的抑制性多肽序列，其结合力高于表位本 身，但不具备相应的抗原性。因此，探讨Ｅ７抗原所包含的对表位起抑制作用的多肽序 列，并据此对表位进行提高结合力的置换修饰，以期鉴定出结合力更高又同时保留原 有抗原性的新表位具有重要的临床意义。’国家自然科学基金资助项目（ＨＰＶ感染致ｃＴＬ功能缺陷的分子基础，编号：３００７０６９８）１第三军医大学博士研究生论文表位抗原性可以通过相关的体外实验和体内实验来确定，包括人外周血单个核细胞体外分离培养诱导特异性ＣＴＬｓ产生、小鼠体内注射合成肽诱生ＣＴＬｓ以及人体内的临床试验等。本研究避开以往鉴定ＣＴＬ表位的常用技术方法，如酸洗脱法与合成重 叠肽筛选ＣＴＬ表位等繁琐、费时、耗资大的方法，分别采用以下方法对ＨＰＶｌ６Ｅ７抗 原ＨＬＡ―Ａ２限制性ＣＴＬ表位进行研究。①计算机软件预测表位，初步确定研究范围。 ②结合分子模拟方法初步探讨置换修饰多肽成为表位的可能性。③对高纯度合成肽， 体外细胞毒实验选用乳酸脱氢酶释放法和５１Ｃｒ释放法来筛选和鉴定表位。④运用荷瘤 小鼠动物模型进行体内实验进一步确定表位的特异性ＣＴＬ诱导作用，以证实ＨＰＶｌ６Ｅ７ 抗原ＨＬＡ．Ａ２限制性ＣＴＬ表位及其氨基酸置换修饰多肽的抗原性。２第三军医大学博士研究生论文第一章ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原ＨＬＡ．Ａ２限制性ＣＴＬ表位的预测、合成与鉴定刖蟊人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）作为一种常见的病原体，感染后可导ｉｎｔｒａｃｐｉｔｈｅｌｉａｌ致尖锐湿疣、宫颈上皮内癯（ｃｅｒｖｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａ，ＣＩＮ）和宫颈癌等疾病。常见ＨＰＶ型别分为良性型ＨＰＶ６、１１型和恶性型ＨＰＶｌ６、１８型等。后两者不仅可致 尖锐湿疣，也常与宫颈癌发生密切相关。ＨＰＶ基因组中Ｅ区可分为８个开放读码框， 分别参与ＤＮＡ复制、转录、翻译、调控等，Ｅ７主要与细胞转化功能及致癌有关，‘因此 在研究中倍受重视。目前临床上应用的干扰素等抗病毒治疗效果不确切，迫切需要寻 找一种有效清除ＨＰＶ感染以防止尖锐湿疣复发和宫颈癌发生的方法。对Ｅ７抗原的细胞 毒Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉＣＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）表位进行预测，在国内外相关研究基础上鉴定抗原性更强的表位，进行多肽的表位修饰和制备相应的多抗原肽疫苗无疑是 一项有重要意义的研究工作。Ｅ７抗原的ＣＴＬ表位可以被ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３分子递呈“～， 而我国ＨＬＡ－Ａ２阳性人群高达５３％左右“１，故预测Ｅ７抗原的ＨＬＡ－Ａ２限制性表位具有重 要的临床意义。本研究采用超模体方案、多项式方案与量化模体方案等对Ｅ７抗原的 ＨＬＡ―Ａ２限制性ＣＴＬ表位进行预测，综合考虑预测结果，以确定筛选表位所需的合成肽 序列。对已经预测出的ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位，采用固相合成法合成多肽，产物经反 相高效液相层析（ＲＰ―ＨＰＬＣ）纯化、分析，并进行质谱分析鉴定。对合成、纯化和经过质 谱鉴定的多肽，避开以往筛选鉴定ＣＴＬ表位常用的酸洗脱法０４１或合成重叠肽分别诱导ＣＴＬ的方法筛选ＣＴＬ表位”。１，采用细胞毒实验――ＬＤＨ释放法进行筛选和鉴定分析执”’，为制备针对ＨＰＶ感染的治疗用肽疫苗提供候选表位。第一节ＨＰＶｌ ６Ｅ７抗原ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位的预测１材料与方法１．１靶抗原由Ｇｅｎｂａｎｋ获得的ＨＰＶ １６ Ｅ７抗原由９８个氨基酸组成，其序列如下：ＰＴＬＨＥＭＨＧＤＴＹＭＬＤＬ ＱＰＥＴＴ ＤＬＹＣＹ ＥＱＬＮＤ ＳＳＥＥＥ ＤＥＩＤＧ ＰＡＧＱＡ ＥＰＤＲＡ ＨＹＮＩＶＱＫＰＴＦＣＣＫ ＣＤＳＴＬ ＲＬＣＶＱ ＳＴＨＶＤ ＩＲＴＬＥ ＤＬＬＭＧ ＴＬＧＩＶ ＣＰＩＣＳ３第三军医大学博士研究生论文１．２预测方案１．２．１超模体方案超模体是指在同一ＨＬＡ家族，甚至不同家族的ＨＬＡ同种异型分子接纳的抗原肽具 有相同或相似的锚着残基构成的肽模体。根据ＨＬＡ―Ｉ类分子接纳抗原的肽模体，ＨＬＡ―Ｉ 类分子可分为４个超模体家族，即Ａ２、Ａ３、Ｂ７和１３４４。超模体主要作用的锚点残基是 位于肽链２位氨基酸残基及羧基末端９位氨基酸残基。当肽链２位氨基酸残基为亮氨 酸（Ｌ）或蛋氨酸，羧基末端９位氨基酸残基为缬氨酸（Ｖ）、异亮氨酸（Ｉ）或亮氨酸 （Ｌ）时，肽链与ＨＬＡ―Ａ２分子亲和力较高。 １．２．２多项式方案 当某残基Ｒ出现在某肽的第ｉ位时，在不考虑其他肽序列的情况下，该残基对于 整个肽与ＭＨＣ Ｉ类分子的结合自由能提供了一常量Ｒｉ，用在第ｉ位为残基Ｒ的大量多肽的ＩＣ＊的负ｌ０９１０值的平均值来估计此常量。ＩＣ。被定义为待测肽将对照肽一＾ＩＨＣ 复合物中５０％的对照肽转换下来的浓度。２０种氨基酸残基分别在九肽１－９位的Ｒｉ值 列于表１。预测表位中系数越高的多肽成为表位的可能性越大，据此初步确定候选表位。 表１多项式系数Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ也ｅ ｐｏｌｙａｏｎｍｉａｌ ｍｅｔｈｏｄＲｅｓ Ａ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ Ｋ Ｌ ＭＮ１ 一２．３８ 一２．９４ 一３．６９ 一３．６４ 一１．８９ 一２．３２ 一２．６７ 一１．６５ 一２．５１ 一２．３２ 一０．３９ 一３．２１ 一３．６ｌ 一２．７６ 一１．９２ 一２．３９ 一２．８９２ ―３．２２ ―１５．０ ―１５．０ ―１５．０ ―１５．０３ ―２．８ ―２．５８ ―３．４６ ―３．５１ ―２．３５ ―３．０４ ―２．５８ ―２．８ ―３．６５ ―２．０９ ―１．７９ ―３．３１ ―２．９７ ―２．８１ ―３．１４４ ―２．６６ ―１．９６ ―２．７１ ―２．６５ ―２．５ ―２．６３ ―２．５８ ―３．４４ ―２．９３ ―２．４９ ―３．０ｌ ―２．２２ ―２．６４ ―２．６３ ―２．６１５ －２．８９ ―３．２９ ―２．２６ ―３．３９ －Ｉ．３４ ―２．５６ ―２．０５ ―２．７４ －３．３４ ―２．７１ 一３．４３ ―２．３６ ―２．４２ ―３．０６ ―３．０５ ―２．８３ ―２．１７ ―２．４９６ －２．７ ―２．２２ －２．６３ ―３．４１ －２．４３ －２．３ ―３．３２ －２．７９ －３．７７ ―２．６３ ―１．３８ －２．３ －２．３１７ －２．３５ ―２．９７ －３．６１ －３．２Ｉ －２．１８ －３．１３ ―３．１３ －２．２ ―２．９７ ―２．６２ ―１．３３ －３．１４ －１．８３８ －３．０７ ―２．３７ －３．０３ －２．６３ 一１．７Ｉ －２．９６ ―２．１６ －２．６９ ―３．２７ －２．０１ ―０．９７ ―３．３１ －２．４２ ―３．０５ ―３．０２９－２．４７ ―１５．０ －１５．０ －１５．０一１５．０―１５．０ ―１５．０ ―２．１ ―１５．０ ―２．７４ ―２．９６ ―１５．０ －１５．０ ―１５．０ ―１５．０ ―１５．０ ―３．７ ―１．７ ―１５．０―１５．０―１５．０ ―２．５５ ―１５．０ ―１．７ ―１．３９ ―１５．０ 一１５．０ ―１５．０ ―１５．０ ―１５．０ ―３．５８ＰＱＲ Ｓ ＴＶ―２．８４－２．１２ －３．７６ ―３．４３―２．０４―２．１２ ―２．６ ―２．６８ ―２．４８ ―３．２９－３．０４―２．７３―２．０２ －２．５８ －２．２５ ―２．６７ ―２．６８ ―３．１４ ―２．８ ―２．１３一２．４４―２．６４Ｗ一０．１４―１５．０一１．０ｌ一２．９４一１．７７―２．７７―２．８５１二！：塑：！！：！二！：！！二！：！４二！：丝：！：塑：！：！！：！：！！：！！：１第三军医大学博士研究生论文１．２．３量化模体方案 量化模体法的原理是与ＨＬＡ－Ａ２分子结合的抗原肽侧链效应（锚定、抑制或中性） 主要取决于相应氨基酸残基在肽中所处的位置，而受相邻氨基酸残基影响较小。这在 一定的范围内可以假设在一个多肽序列中，每个氨基酸残基相互独立且影响整个肽与ＭｔｔＣＩ类分子的结合，而该抗原肽的结合能就是每个位置氨基酸残基结合能的综合。基于这种假设，１９６３年Ｐａｋｅｒ等用肽结合实验分析１５４个九肽与ＨＬＡ－Ａ２分子的亲和 力，并得到一个包含１８０个系数的结合矩阵（见表２），其中每一个系列反应了相应氨 基酸残基在该位置时的相应结合能。对于某测定多肽各位置相应氨基酸残基结合系数 相乘再乘标准系数０．１５１，即为该肽与ＨＬＡ－Ａ２的结合力。当结合系数大于或等于５可 以确定为与ＨＬＡ―Ａ２分子结合稳定，反之认定为结合不稳定。本研究采用ＨＬＡ－Ａ２分子 的结合矩阵，对超模体法预测出的ＣＴＬ表位进一步采用量化基序进行验证，以寻求结 合最好的表位。表２ Ｉ儿Ａ－Ａ２分子限制九肽综合系数Ｔａｂｌｅ ２ Ｎｏｎａｐｔｉｄｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｃｆｆｉｃｌｅｎｔｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ－Ａ２ ｍｏｌｅｃｕｌｅＡ。曲。ｄｄ――――――――』墅坐巴垫型堂坠哟班些Ｌ―――――一ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９第纛擎黩走掌媾±磷究生谂盘２．缝粜２．１超模体方案根据超模体方案，扫描Ｅ７抗麟的氨基酸序列，预测出１６个候 选表整丸效，分裂楚：ＤＴＰＴＬＨＥＹＭ暖７４～ｔ２）、ＴＩＭＥＹＭＬＤＬ（嚣７７－１５）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ４５＞、ＲＡＷｆｌ《ＩＶＴＦ（Ｅ气§一并）、ＴＬＲ嫩Ｑ鼹＜塞‰～７２）、ＲＬＣＶＱＳＴＨＶ（Ｅ７繇一７４）、（Ｅ７１１―１９）、ＭＬＤＬＱＰ嚣疆（Ｅ７１２―２０）、ＤＬＱＰ嚣ＴＤＬ（Ｅ７１４―２２）、ＥＩＤＧＰＡＧＱＡ（Ｅ７３７―ＣＶＱＳＴＨＶＤＩ（Ｅ７６ｓ一７６）、ＳＴＨＶＤＩＲＴＬ（Ｅ７７１―７９）、Ｄ球１１葚ＤＬＬ（Ｅ７７５―８３）、ＴＬＥＤＬＬＭＧＴ （Ｅ７７８一鼬）、ＤＬＬＭＧＴＬＧＩ（１拜戳一８９）、毛鞠疆ＧＴＬＧＩＶ（Ｅ７８２．９０）、ＧＴＬＧＩＶＣＰｌ（Ｅ７ｓｓ一９３）。２．２多项式方案预测出ｌＯ个候选表位九肽，分别是：ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（Ｅ７７－１ｓ）（一２１．５１）、Ｙ氧旺黔№争基零《至浮ｎ―１９）（－２１．３６≥、ＭＬＤＬＱＰＥＴＴ≤Ｅ７１２一∞）（－２３Ａ６）、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｅ７，９一ｓＴ）（－２１。４８）、ＴＬＲＬＣＶＱＳＴ（嚣７６４―７２）（＊２３。８７）、ＲＬＣＶＱＳＴＨＶ（Ｅ７菇一７４）＜－２２．１２）、ＣＶＱＳＴＨＶＤＩ（Ｅ７ｕ．奄）（一２３。８１）、ＤＬＬＭＧＴＬＧＩ（ＥＴｓｌ－辨）（－２３．３１）、ＬＬＭＧ帆ＧＩＶ（Ｅ７ｓ２―９０）（?２０．７６）、ＧＴＬＧＩＶＣＰＩ（Ｅ７ａ５。９３）（－２３，１０）。２。３曩纯挨髂方案预测爨３令搂迭表盈丸敖，矗｝蘩是：ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（Ｅ７７－１５＞（２８８．１７）、Ｒｌ￡ＶＱＳ｜弱［量Ｖ（Ｅ？蕊，辩）（７４．６２）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ≤Ｅ７芎２一粥）＜７．８４）。第二节ＨＰＶｌ ６Ｅ７ ｊ究原ＨＬＡ－Ａ２限制性０ＴＬ预测表位的合成１．材料慧方法 １．１实验糖瓣 １．１．１主簧试熬、 试裁援号殿簇采滚ＥＤＴ５３Ｈ４３１２Ｓｉｇｍａ Ｓｉｇｍａ Ｓｉｇｍａ转铁蛋瞧 薄甲硫醚ｌＯ｝港１４３２６Ｈ３１６０豫五氟９９ｉ２潞７１１２０９委国曼秘豫Ｄ琏ＭＥＲＣ装Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬＨｙＣｌｏｎｅ ＨｙＣｌｏｎｃ雌二醇 ＲＰＭｌｌ６４０培养基 ＩＭＤＭ蜷葵基 黢牛盎瀵 胰懿氨基酸般∞ｌ００３４ＡＦＭ６３１７ＦＡＧＥ７《｛５ｅＡ｜薹Ｍ９８９０∞ｌｌＯ梦１８Ｅ９Ｄ１１９ＨｙＣｌｏａｏ燕国ＰＥ公司矗第三霉落犬学博士研究生论文Ｉ－ＩＭＰ树膳甲醇 暇淀ＤＭ慷ＰＨＯＢｔＡ７翻８９０１０１０２４ Ｅ９８２差２ Ｅ５Ｃ０９１荚厘疆公司荧国ＰＥ公司蓑国ＰＥ公司奖国ＰＥ公司Ｏｌ既ＯｌｌＡ９Ｈ３０４Ｊ９（：－１４１焚萤ＰＥ公司 荧国ＰＥ公司 美国ＰＥ公司 美国ＰＥ公司 上海康迭氮基酸厂 上海试剂三厂 上海化学试剂采赡供应港分装 上海试剂二厂 徐媸万邦生携缘学剑蘸厂 苏州正必化工研究所 黢翔化学试奏ｑ礤究所ＮＭＰ ＤＣＭＤＣＣＯ∞５００３ｏ壤氦酸 Ｌ．哭冬酰胺 氢化可的松 褰蔗糖．泛影葡胺分层液 中性壤岛索溶液ＤＭＳＯＯｌ∞钟９９０６１４９８．Ｏ＆ｌＯ９９１０１０００１１０６９９１０２２ｂ签氨酰胺 １．１．２主要仪器 质谬仪 多胶合成仪 ＨＰＬＣ仪ＨＰＬＣ制备柱００１２１２ＡＰｌ２０００跫ＡＢｌ４３１Ａ型荚屋ＰＥ公司美国ＰＥ公司Ｄｅｌｔａ６００型Ｄｅｌｔ美国Ｗａｔｅｒｓ公霹 美国Ｗａｔｅｒｓ公司 美国Ｗａｔｅｒｓ公司美国Ｗａｔｅｒｓ公词 美国Ｗａｔｅｒｓ公司Ｓｉｇｍａａ－Ｐ矗狲Ｃ４ＴＭＳｙｍｍｅｔｒｙＣ８鼢ｔＣ分析柱２４及９６孔培养 二躐化碳孵箱电子天平 净化工作台ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｌｅｄ糯ＲＰ８Ｄｅｌｔａ－Ｐ矗眦Ｃ４ＢＢＢｌ６型 ＦＡｌｌ０４掇Ｈｅｒａｅｕｓ上海天平仪器厂ＳＷ．ＣＪ．１Ｆ型苏净集团苏州蜜泰空气技术有限公司１．１．３合成多肽序列 经越模体方案、多颂式方案和量纯模体方案相结合预测的候选ＣＴＬ九肤表位，分别是ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（Ｅ７ ７―１５）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（Ｅ７ ｌ卜１９）、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｅ７ ４９．－－５７）、ＲＬＣＶＱＳＴＨＶ（Ｅ７ ６６―７４）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（Ｅ７ ８２―９０）。１．２实验方｛虫７蕺兰军医夫学博士研究生论文１．２。１多歉合成 运用标准Ｆｍｏｃ方案在ＡＢｌ４３１Ａ型多肽合成仪上进行九肽的合成，精氨酸采用两 次偶联。起始树脂为０．２５ｍｍｏｌＨＭＰ树脂，氨基黢的量为Ｌ０ｍｍｏｌ，比例为氨基酸：树脂＝４：ｌ，按照序列使肽链从羧基端向氨基端照｛枣。各种氨基酸的保护基团分别 是：§氮萋为Ｆｍｏｃ基嚣操护；英衾铡链爨护基溺为Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｏｌｕ（ＯｔＢｕ）、 Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｔｈｒ（ｔＢｌｌ）和Ｔｙｒ（ｔＢｕ）。第一个氨基酸焉ＤＭＡＰ连接到辩 脂上，氨基酸的活化用ＨＯＢｔ和ＤＣＣ，偶联后用２０％哌啶溶液去除Ｆｍｏｃ保护基团。 冰浴后的合成物加入处于冰浴条件下的１０ｍｌ切割液中。待切割混合液濑度上升至室 温后持续搅摔，反应１．５ｈ使肽链从树脂上裂解下来，间时去除保护基团。反应后的混 合滚经Ｇ４玻砂瀑斗滤簿耱疆，炎瓣溪约ｌｍｌ Ｔ＇ＦＡ、５－１０ｍｌ ＤＣＭ冲洗爱疯藏、耱驻襄 漏斗。褥滤波在常温下低压蒸发懋１－２ｍｌ，搬入５０ｍｌ已预冷酶乙醚沉淀多肢，４℃放 置过夜，经Ｇ６玻砂漏斗过滤，囊空抽干３ｈ，所得糨产品肽于－－２０＂（２储襻。 １．２．２多肽的纯化与纯度分析 将各驮躅ＤＭＳＯ溶解，浓度为２０ｍｖｊｍｌ，经０．２２ ｌ纤维滤膜过滤蜃，猩Ｄｅｌｔａ６００型ＨＰＬＣ土滋磐缝纯窝缝度努掇，滋动摇遥震乙氯滚波（含０．１％ＴＦＡ）。梯发洗魏熬乙氰溶滚赣辩酝懿。洗脱时阕为３０ｍｉｎ，漉动稳流速巍１．０ｍｌ／ｍｉｎ，少量多次缝纯，收集主峰。经积分运算，各肽主峰面积占所有峰面积的酉分数为多肽纯度。 １．２－３多肢的质谱分析与鉴定 纯化后多肽的分子量测定农ＡＰＩ 值援镣舍霹，濒褥多获郊为嚣标款。 ｌ。２０合成款翁ｌ｜芟集 纯化收黎液在常温下低压蒸发至完全干燥，用５０ｍｌ岂预冷的乙醚沉淀、Ｇ６玻砂 漏斗过滤收熊沉淀、真空干燥，所得九肽纯品于．２０℃储存。２．实验缭慕２．１２０００型质谱仪ｔ进行，当分子黛测定值与理论ＲＰ－瓣∽分辑结粟经积分运黛，各肽主峰面积占所有峰面积的百分数都达到了９５％ｐＡ点，分别为Ｐｌ（Ｅ７ ７．１５）９８。２１％、Ｐ２（Ｅ７１１．１９）９６，４７％、Ｐ３（Ｅ７ ４９―７）９８．７３％、Ｐ４（Ｅ７ ６６．，４）９７．１８％和Ｐ５（Ｅ７ ８２．９０）９６．９６％。（如图１．５所示）８第三军莲太学藩±醛襄生避文露ｌＰ１反程高效滚攫色谱匿Ｆｉｇｕｒｅ １．ＲＰ－ＨＰＬＣ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐ１Ｆｉｇｕｒｅ ２。ＲＰ?ＨＰＬＣ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｌＸ：ｐｔｉｄｅ Ｐ２９蓊兰警医天学簿±骚巍生论文器３Ｉ＇３反裾高效液糊色谱匿Ｆｉｇｕｒｅ ３．ＲＰ－ＦＩＰＩ．，Ｃ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐ３Ｆｉｇｕｒｅ ４．ＲＰ―ＲＰ―ＨＰＬＣ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｃ Ｐ４１０第三军医大学博士研究生论文图５Ｐ５反相高效液相色谱图Ｆｉｇｕｒｅ ５．ＲＰ―ＨＰＬＣ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐ５２．２质谱鉴定结果各多肽的分子量测定值与理论值相符（表１）。质谱分析，见图６一１０。表１Ｔａｂｌｅ １多肽分子量测定值与理论值Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｉｏｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ第三军隧天学博士磷究生论文暮 詈哥１１３， ．５８２８０６０．Ｊ，ｊ－ｋｌ山、ＩＬ＾Ｌ“ｄ监Ｌ▲｜ 丑“越。．１１唧即硼ｒ孵１＿丌”？”’ ！■ｒ叩ｆｒ■０图６ Ｐ１质谱图 Ｆｉｇｕｒｅ ６．Ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ１ＦｉｇｕｒｅＰ２质谱凝 ７．Ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰ２图７?１ｌ裂 ．Ｓ辑＿●●｜｜Ｐ】Ｏ１１１６１ｔ２０ｎ～１１２５ｉｍａＳＳ图８Ｐ３质谱图图９Ｐ４质谱图Ｆｉｇｕｒｅ ８。Ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ３Ｆｉｇｕｒｅ ９．Ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ４１２第兰摹暇太学博士研究擞论文疆ｌＯＰ５痰谱耀Ｆｉｇｕｒｅ １０。Ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ５第互节ＨＰＶｌ ６Ｅ７抗原ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位的筛选与鉴定｛，糖瓣每穷法 １．１蜜验材料、试剂和仪器 １．１．１燕骚实验毒孝辩 ＨＬＡ｛必荦挽干授 ２４及９６孔培养板 １．１．２囊矮试剂 ＲＰＭｌｌ６４０培养基 ＩＭＤＭ培养基ＡＦＭ６３１７ＦＡＧＥ７４ｔ５Ｃ ＧｉｂｃｏＢｌｔＬ ＨｙＣｌｏｎｅ ＨｙＣｌｏｎｅ ＡＳＮＴ２Ｄ天津罄普艇物技寒卷陨公司Ｓｉｇｍａ疑譬焱滤越戳９８粥癌珏，２２０００１２０９第三军越大学全军兔缝研究所 篇三军医大学全军免疫研究所配细胞薷量攀激大学博士研究擞论文ＬＤＨ试剂盘 １．１．３童要仪器： 二鬣弦碳孵 电子天平 台式冷冻离心桃 酶舔仪 净化正作台 ＳＷ。ＣＪ．１Ｆ型 ＢＢｌ６黧 ＦＡｌｌ０４礅 德鏊Ｈｅｒａ＿ｅｕｓ公筏 上海天平仅器厂 德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司 美鏊ＢＩＯ．ＲＡＤ公谜 苏净集龋苏州安豢警气技术 有限公霹 １．１。霹瓣搽获 经过人工合成、纯他和鉴定的多肽序列，分别为：ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（Ｐ１，Ｅ７７－－１５）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（Ｐ２，Ｅ７ ｊ１．ｔｇ）、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｐ３，Ｅ７Ｅ７ ６６一铷）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（Ｐ５，Ｅ７４９０７）、ＲＬＣＩｖＱＳ删（Ｐ４，８２―９０）。对照瘸廷关获Ｉ－ＩＢＶｃｉ８－２７（ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ）由全军兔痰研究所提供。 １．２方法 １．２．１效液缨稳静潮餐 取Ｓ例健康献血者静脉血各３ｍｌ，用免疫磁球分离法分离Ｔ细胞，采用ＡＳＮ７２Ｄ 泰萨鸯一爽攀壳整捷体予鬏，运瘸徽爨漤巴缨鼹繇实验检出ＨＩＡ－Ａ２＋挺本。取经过簿 逡符合簧求豹献盘考嚣菰纛２００ｍｌ，舔矮密凄撵浚离心法分蘧ＰＢＭＣ，分装麓６令珞 养瓶进行熔莽，用含ｌＯ％胎牛血清的１６４０培养撩调节细胞密度为ｌｘｌ０６／ｍｌ，分别加 入上述５耱多默和对照熙无关默，多敖浓度为１０ ｊｇ／ｍｌ，共３次割激，每次瓣矮聪藏 为１簿，簿次裂激蘸均潜洗涤和茧懋ＰＢＭＣ著加入ｌＬ．２（浓魔为１００＂／ｍＩ），簸后一次 刺激３天艨收集效应细溅。 １．２．２獠镪腮的毒《冬于检测翁一周复苏朔培养就缁臌，使用前羽备多歇包技，每１０６俄细胞加入多肽１咄。ｌ，２。３褒姣嚣簿选 按照ＬＤＨ释放法试制盒说明步骤进行操作，检测的效靶魄分潮为１２，５：１、２５：１、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝――――一第三军医大学博士研究生论文５０：１和１００：１，每组作３个复孔。细胞毒性百分率计算公式如下：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ－Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ－Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ－Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ其中，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝实验组吸收值一培养基背景吸收值，Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ＝效 应细胞ＬＤＨ自释放值一培养基背景吸收值，ＴａｒｇｅｔＳｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ＝靶细胞ＬＤＨ自释放值 一培养基背景吸收值，Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ＝靶细胞ＬＤＨ最大释放值一体积校准对照吸收 值。 １．２．４表位的鉴定 对筛选出的表位ＨＰＶｌ６Ｅ７ １１－１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）和Ｅ７４９．５７（ＲＡＨＹＮＩＶ田再次运用ＬＤＨ释放法进行鉴定，以上述两个表位分别刺激形成的效应细胞与无关肽包被的靶细 胞检测特异性杀伤作用来确定表位的抗原性。靶细胞宫颈癌细胞株Ｃａｓｉｋ（ＨＬＡ－Ａ２＋， Ｉ－ＩＰＶｌ６Ｅ７＋）由第一军医大学珠江医院肿瘤研究所提供，效应细胞与靶细胞的比例以 筛选时杀伤率最高一组相同。 ２．结果２．１表位筛选结果各实验孔ＯＤ值分别如表１－３所示，不同多肽诱导的ＣＴＬ在不同效靶比时特异性 杀伤率如表４所示。结果显示ＨＰＶｌ６Ｅ７ １１－１９（ＹＭＬＤＬＯＰＥＴ）和Ｅ７ ４９．５７（ＲＡＨ”盯啊日分别刺激形成的效应细胞的杀伤作用特别明显，而其余三种多肽以及对照用无关肽刺激形成的效应细胞无明显杀伤作用（图１）。表１各孔ＯＤ值（非实验组）Ｔａｂｌｅ １ Ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ｎｏｎ―ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ）嚣墨葶藩大学蒋圭蘩究生论文表２备扎ＯＤ值（实验组Ｐｌ、Ｐ２与Ｐ３）Ｔａｂｌｅ ２Ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ｅｘｐｅｔｉｍｃｎ掘ｌ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆＰｉ，Ｐ２ ａｎｄ Ｐ３）旁瞪毙与国谯实验缀ＰｌＯ?５８０Ｏ?５７５Ｏ?８７２ｏＤ僚Ｏ?５７９ １２?５：１袈斑蕊Ｏ，８７０Ｏ?８６３Ｏ?９６６０－９６００?９５１臆鑫释０。３１３放０Ｄ假 实验组０．３８３０．３８９０．４００＆４０３０；３９５融４０７０。４１１０．４１２…０．４０４ ｏＤ馕０．３８５０．３９０１．０６２１．０５７１＋０５５１．０５５１．０４５ｌ。０４４ ～２５：ｔ效瘦壤 魏自释０。５５６ 放ｏＤ值 实验组０．．５４９ ０．５５４ ０。４４２ ０．３９９ ０。４ｔ４ ０。４３１０。４３４０。４１９∞馕５现ｌ…．。０．５８５０。５９３０，５８７１。３０２ｌ。００６１。３０４１．１８２一ｌ。１７６１．１８６ 一效度缨胞自鞯０．３９８０。４１３０。３９６０．４３００。４２８０。４３５０。４３３０．４３３０．４３９放∞值实验组∞馕…．０．６ｔ３０。５９８０＋６０２１．１８５ｌ’１７７１，１８４１，１２２１．１１０。１．１２６１００；ｌ效藤缨施自释０．４２０ 放∞德０．４０２０。４１３０．４４３０．４４５０。４５００．４３６０．４４２０．４４０１６第三军医大学博士研究生论文表３Ｔａｂｌｅ ３Ｐ４、Ｐ５与Ｐ６细胞毒实验各孔ｏＤ值Ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｐ４，Ｐ５ ａｎｄ Ｐ６）实验组 ｏＤ值１２．５：ｌ０．５ｅ９０．弱７０－５６３ｏ．５８３ｏ．５７８ｏ．５６９ｏ－鼹７ｏ．５４００．５４７效应细 胞自释 放０Ｄ值 实验组 ０Ｄ值ｏ．册３０．５８８ ｏ．３８６ ０．３８８ ０．３９２ ｏ．３９９ ｏ．３９１ｏ．研ｏ．３８３０．３８６０．３９５ｏ．册１０．５９９Ｏ．６１ｌｏ．６０２０．５６５０．５９８ｏ．５９５２５：ｌ效应细 胞自释 放ｏＤ值 实验组 ＯＤ值０．印１０．６００ Ｏ．５９４ ０．６１０ ｏ．６０３ ｏ．６０８ Ｑ５６６ ｏ－５６４ ０．５６００．３鸲ｏ．４０１ｏ．４１２０．４２１０．４２２Ｏ．４０９０．４０２０．３８９０．勰３５０：ｌ效应细 胞自释 放０Ｄ值 实验组０－４２５ ０．４１８ ０．４３４ ｏ．６１０ ｏ．６１５ ０．６０８ ０．５９４ ｏ．５８６ ０．５ｓ１４ ０．４２ｌ ｏ．４２３ ｏ．４１４ ０．４２ｌ ０．４３０ ０．４１３ ０．４０４ ０．４１１ ０．３８６ｏＤ值１００：ｌ效应细 胞自释 放∞值ｏ．５７９ ｏ．５８６ ０．５８４ ０．４２９Ｏ．４３９ｏ．４２７ｏ．４０９０．４１１０．４０６１７苎三兰垦查兰苎主要塞生丝圭表４靶细胞的溶破率（％）Ｔａｂｌｅ ４ Ｌｙｓｉｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓ（％）Ｐ４ Ｐ５ Ｐ６效靶比Ｐ１Ｐ２Ｐ３１２．５：ｌ２．４３６．２４５．８０．８１．１―２．１２５：ｌ一１．２５８．１５４．４２．０１Ｉ ７Ｏ．１５０：１１．９７２．９６９．６ｌ－ｌ一Ｉ．６―０．９ｉ００：ｌ２．８６８．４６１．７―１．６０．９１．５图Ｉ靶细胞溶破率（％）Ｆｉｇｕｒｅ １．Ｌｙｓｉｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ２．２表位鉴定结果 鉴定比例为５０：１，ＨＰＶｌ６Ｅ７ １１．１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）和Ｅ７ ４９－５７（ＲＡＨＹＮＩⅥＲ分别刺激形成的效应细胞对靶细胞杀伤率分别为５７．２％和５４．Ｏ％，对照肽无明显杀伤作用（杀伤率为Ｏ．６％）。结果与筛选时的特异性杀伤作用较为一致，由此确定ＨＰＶｌ６Ｅ７ １１．，９（＇ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）和Ｅ７４９．５７（ＲＡＨＹｌ＇ｎＶｍ具有较强的抗原性，属于Ｅ７抗原的ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位（图２）。１８第三军医大学博士磅巍釜潦文港 蔽 塞＾辞爨２表锭釜建懿靶蘩熬涔技搴（篱）Ｆｉｇｕｒｅ２。迎ｓｉｓ ｒａｔｅｏｆｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ耗ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ讨论一、ＨＰＹｔ６Ｅ７撬豢ＨＬＡ－Ａ２黻裁瞧镰Ｌ嶷毯豹蹶溅秀法皲意义 懑燕型｝璎Ｖ嚣ＨＰＶｌ６稳ＨＰＶｌ８熬感染掰罨数熬颓露瞧受镌滋痣、塞残生皮蠹癌（ＣＩＮ）彝絮蔹薅端疚瘸，瞧臻渡黪投葵毯难盼攒。ＨＰＶｌ６基鞭筑审粉溪塞生翳等缨熬转毽动辘及致瘀毒哭，在癌缨腿及葵髑基缨飑审麸感染旱嬲至黔薅形残瓣蟛埘持续捻测戮鄹撬骤瓣表达，毽ｌ｝ｌ：该撬嚣成必灸痰浚疗理想瓣靶撬舔ｆ１４＿蜘。锋辩特器蛙袭迭的Ｅ７抗骧豹受疫治疗是一辩霹供选撵戆渗疗方褰。渡疗法以主动兔痰方蕊激漕凳波系绕，诱导产囊特冥经缎戆毒魏ｌ漤墨缎黪，募痿黪凝缎熬，释对爱鬻键缀缀熬簿 蠢羧害，所以在研究中售受荚注ｌ拍】。糨美的多骏疫蘸骚究尽游测鬟予Ｅ？抗原及冀ＣＴＬ 菠擞的蘩定Ｈ７１。 ＣＴＬ在机髂缨臌内感浆鞫抗艘瘪免疫巾发撵饕极为爨瑟豹拣髑。靶抗原需终经抗 缀掇里途掇戳“捷骤黢～酗Ｈｃ ｌ类分子”熬复食貔澎式星骥手ＡＰＣ装载缀腿表露，方 Ｉ类分子结合的摭原欺鞠为ＣＴＬ Ｉ类分子与挠菔默檩嚣搀麓溅律黪试谖。熊被表达鸯特异性ＴＣＲ豹ＣＴＬ所识别，摆威的与姗ｅ淡擞。秘笑骚钵皱梅学静遴艘搬深了对潮ＧＭＨＣＩ粪分子由一条重链私§：微球蛋囱组成，黛镶ｎ。嗣ｑ：结构域中豹两个珏螺旋靼一个８冀屡的§援鬟共瞬擒成了一个嚣搂辩闭懿敦绫台糟（ｇｒｏｏｖｅ），冀内袄次努蠢整 Ａ―Ｆ６个幽甄基酸侧链形成的口袋（ｐａｃｋｅｔ），其巾程与抗原欺结合中起主要信用的怒Ｂ第篡颦臌丈学博士研究生论文嚣Ｆ秀令掰袋。髓手菜蘩ＭＨＣｌ粪分予，它象缝杂瓣靛器获在特定蕴悫上零癫褒菜尼个特定氨蒸酸残基，它们在结合中越潜锚点作用““”３。以往鉴定ＣＴＬ表傥的技术路线 为：用酸洗脱法将肿瘤细胞上与ＭＨＣ Ｉ类分子络含的抗原肽洗脱下来，观察奠在体外 是否戆诱嚣鼹己爱瘟。蔟至寿入：ｉ爨遭逐一舍威鬟黧获分裂诱导ＣＴＬ夔办法袋戆选ＣＴＬ 表位。这麓方法繁瑗、爨隧、耗瓷大。遥年来骧麓对ＭＨＣ｛类分子与撬瓣敬结合怒捧 及结合模体ＣＢｉｎｄｉｎｇｍｏｔｉｆ）认识盼深入，根据结食横体预测ｃＴＬ表位的新方法已逐步 被采用及推广，现在已产生了多秘模体预测方法：（１）简单模体法：１９９１年Ｆａｌｋ等采 孺获涟溺垮法，发瑶大部分与辩ＬＡ－－Ａ２分子有较麓萦和力熬丸获，其第二佼缀基酸残 基为Ｌ或Ｍ，第九位为Ｖ、Ｉ或Ｌ，蕊于此建立的液位预测法其准确率为３０％灰右，但 潺捡率及镁辍性均较高渤’２１｝ （２）翅熙模体法：｝｛潍一Ａ２分子续合的多黢申氨基酸残 纂频率静统诤分援，遥甥多默与ｌｌ潍－－Ａ２分子瓣蠢效缝合不仅奄篱单搂髂鸯荚，还毒 ＝级锚点的存在和～些不利于结合的甄基酸残基缺失有关，建嶷在这一基础上的延展 模体法准确率达到了７６％脚’２３］Ｏ（３）越模体法：Ｒｓｍｍｅｎｓｅｅ综合了一些常见的ＭＨＣ分子 凝结会瓣敖，礁定了大爨簌攘髂。缀深入逆较磷究嚣，发理苓乡震予弱一Ｈ躲家庭， 甚至不裁容纛熬ＨＬＡ嚣秘异型分予激缨会豹抗缀歉是有穗蘑或稠钕的镶着模体，都旗 律。该方法豹建立大大降低了漏梭攀洲。（４）多项式法：１９９４奄置Ｐａｒｋｅｒ替掇懑假设： 在一个抗原肽中，每个羝基酸相奠独漱她以一定结合能影响着该肽与ＭＨＣ分子的亲和 力。毽秘麓多获结合实簸努辑了１５４令丸获与嚣激一矗２分子懿寨释力，：簿餐滋一令包 禽１８０个系数的距阵，其中每个系数殿映了相应氨基酸在该位黛肘与ＨＬＡ―Ａ２分子的 结合毖。１９９７年Ｇｕｌｋｏｔａ等认为德单模体和延展模体对于某欺砖ＭＨＣ分予的缝合并不燕充分纛努瑟瓣，纯霞遁过分辑４６３令丸放与｝ｌ潍一矗２鹣绩会煞力，进一步试骥了“系数距阵”鹣合理褴，并擒出跌该方法颡测表位其肖商灵敏发跌疑能够缀好稚除强弱性 的特点，敞优于模体法，可作为它的补充０５’…。 本磷究采用超模钵麓多项式方絮缝合鲍方法，以及量化模俗方寨瓣於宠，颡溅结果褒疆，蠢３个毽论上薅｝ｌ酞一Ａ２分子有较麓亲和力豹丸教表谴，分羽怒Ｅ７，一（ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ）（２８８．１７）、Ｅ７。一。（ＲＬＣＶＱＳＴＨＶ）（７４。６２）和Ｅ７。。（Ｌ翻ＧＴＬＧＩＶ）（７．８４）。 综合考虑，确定合成序砌为：ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（Ｅ７㈧ｓ）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（Ｅ７。。§）、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｅ７＊“，）、ＲＬＣＶ豁零珏Ｖ（Ｅ７一“）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（Ｅ７≈一。）。在羧涮豹表位中，蕤与鞋强 一Ａ２分予高度亲和的肽段并不一定能被抗原呈递细胞（ａｎｔｉｇｅｎ―ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ，ＡＰＣ）的抗原多肽转运蛋白（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ 维合，觚露不疑进入经焚瓣ＭＨＣｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＴＡＰ）选择性ｌ炎途径，或势苓存在理想的缩合与ＴＣＲ律鼹，数并不一定是冀覆戆ＣＴＬ表僚。这些镞逡袭位有符逡一步终俸癸实验筛选与鍪宠。 二、菪肽台成、纯化及其鉴定的祭件要求２行第三军医大学博士研究生论文在对人乳头瘤病毒１６型Ｅ７抗原ＣＴＬ表位的研究中，合成的目标肽为预测后所确 定的多肽序列，避免了盲目合成和不必要的浪费。本次实验采用标准Ｆｍｏｃ方案合成多 肽，多肽切割、去除侧链保护基团选用酸性溶液，并加入能捕获阳离子的清除剂以尽 可能避免氨基酸的侧链保护基团Ｂｏｃ或ｔＢｕ所导致的色氨酸和蛋氨酸的叔丁酯化８“…。 由此获得较高纯度的九肽产物是后续实验研究的前提和基础。 合成实验中肽的纯化通过反榴高效液相（ＲＰ―ＨＰＬＣ）进行，根据不同九肽疏水性的差 异选择不同的流动相以达到满意的分离提纯效果。在目标肽中ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（Ｅ７，一）、ＲＡ｝｛ＹＮＩＶＴＦ（Ｅ７。。）、ＲＬＣＶＱＳＴＨＶ（Ｅ７。－－７４）和ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（Ｅ７。一。）的亲水性较好，ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（Ｅ７¨－。。）疏水性极强。乙氰作为流动相具有很好的分离效果，根据疏水性 的不同，临时配制了不同浓度的乙氰，使分离迅速有效。分离过程中保持了较高的湿 度，使样品易于与固定相作用，不易被洗脱下来，同时保持适当的流速以避免因缩短 分离时间而引起的分离效果下降。 对合成肽进行分析、鉴定，常采用的方法是进行纯度分析或氨基酸组分分析，后 者因为有的氨基酸残基在进行氨基酸组分分析时无法检测到，因而在鉴定多肽时作用 有限。此外，也可运用质谱进行定性鉴定啪１。对５种合成、纯化的九肽，运用ＲＰ―ＨＰＬＣ 分析的纯度均大于９５％，经质谱测定分子量，所得测定值与理论值相符合，确定所获 九肽为高纯度的目标肽。合成ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原的预测ＣＴＬ表位，为后续研究中表位的抗 原性比较和分析、寻找更多新的表位、优化组合设计多抗原肤疫苗以及临床试验奠定了可靠的实验基础。三、表位鉴定的方法与意义 既往对Ｅ７抗原的表位筛选多采用酸洗脱法或合成重叠肽分别诱导ＣＴＬ的方法筛选 ＣＴＬ表位，前者通过发现细胞表面与主要组织相容性抗原Ｉ类分子结合的肽段寻找相 关表位，其效率不高，容易造成漏检，而且能与ＭＨＣ Ｉ类分子结合的肽段不一定都是 表位，需经过鉴定才能确定。后者需要合成数百种肽段并逐一进行筛选与鉴定，所耗 费的时间、人力、物力和财力都是巨大的，而且重叠肽间隔４～８个氨基酸残基，同样 可以造成漏检啪’川。本研究在对人乳头瘤病毒１６型Ｅ７抗原ＣＴＬ表位的研究中，运用 细胞毒性实验（ＬＤＨ释放法）对５种合成并纯化的九肽进行表位的筛选和鉴定。其原 理主要在于靶细胞被相应的效应细胞杀伤以后，释放的乳酸脱氢酶明显高于未杀伤细 胞，通过比较不同组别的ｏＤ值，运用相关公式计算去除影响因素，杀伤率高的样本组 多肽可初步定性为ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位，经过特异性杀伤实验对照研究确定其特异 性的抗原作用。该方法敏感性和特异性较高，操作简便，没有同位素所引起的污染“’ ”１。通过初步筛选和后续鉴定，确定ＨＰＶ１６ Ｅ７ＩＩ－１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）和ＨＰＶ１６Ｅ７４９－５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）为ＨＬＡ―Ａ２限制性ＣＴＬ表位。实验结果为优化组合设计针对ＨＰＶ感染的第三军医大学博士研究生论文治疗性肽疫苗以及临床应用试验奠定了可靠的研究基础。四、小结本研究对人乳头瘤病毒１６型Ｅ７抗原ＣＴＬ表位的研究中，拟合成与筛选的目标肽 经超模体方案、多项式方案和量化模体方案相结合预测，综合考虑后确定Ｅ７ｔ。、Ｅ７ＩＩ－ｔ９、Ｅ７。，、Ｅ７＋，。和Ｅ７ ｅ。。作为合成对象，准确的预测缩小了合成目标肤的范 围，为表位鉴定奠定了可靠的理论基础。实验中采用标准Ｆｍｏｃ方案合成多肽，根据不 同九肽疏水性的差异选择不同的流动相达到了满意的分离提纯效果，通过ＲＰ－ＨＰＬＣ进 行纯化并获得纯度高于９５％的九肽产物，对合成肽运用质谱仅迸行鉴定后确定所得多 肽符合实验要求，经质谱测定分子量所得测定值与理论值相符合。对成功合成的 ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原预测表位运用敏感性和特异性较高的细胞毒性实验（ＬＤＨ释放法）进行表 位鉴定，经过特异性杀伤实验对照研究其特异性的抗原作用，确定ＨＰＶ１６ Ｅ７Ｉ Ｌ－１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）和ＨＰＶ １６ Ｅ７。。，（ＲＡＨ．ｊⅢＩｖＴＦ）为ＨＬＡ―Ａ２限制性ＣＴＬ表位。实验结果对于ＨＰＶ感染治疗性肽疫苗分子设计以及临床应用试验奠定了可靠的研究基础。参考文献１Ｃｏｎｎｏｒ ＪＰ，ＦｅｒｒｃｒＫＤａｎｅ ＪＰ，ｅｔ ａｔ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ’ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａ［Ｊ］．ＧｙｎｅｃｏｌＯｎｃｏｌ，１９９９，７５（１）：１３０―１３５．２Ｒｏｅｔｚｓｃｈｋｅ Ｏ，ＦａｌｋＫＳｔｅｖａｎｏｖｉｅ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｍｏｔｉｆ ｏｆ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄｍＡ ｃｌａｓｓＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｎＣＯｍｐａｓｓ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ［Ｊ］．ＥｕｒＪ １．ｍｍｕｎｏｌ，１９９２，２２（９）：２４５３．２４５６．３Ｂｏｇｎｄｎｉ、‘Ｉａｃｏｐｉｎｏ Ｐ’Ｑｕａｒｔｕｃｃｉｄ ＪＲ，ｃｔ ａ１．Ｂｕｓｃｈｋｅ ａｎｄ ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ ｔｕｍｏｒｓ（＃ａｎｔｃｏｎｄｙｌｏｍａ５０１．５０４．ａｃｕｍｉｎａｔａ）ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｎｅｒｖａ Ｇｉｎｅｃｏｌ，１９９９，５１（１２）：４Ｓｉｄｎｅｙ Ｊ，ＧｒｅｙＨＭ，ＫｕｂｏＲＴ，ｅｔａ１．Ｐｒａｄｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ５ Ｇｕｌｕｋｏｔａｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ，１９９６，１７（６）：２６１?２６６．Ｋ Ｓｉｄｎｅｙ Ｊ，Ｓｅｕｅ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｗｏ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｐｒｐｆｉｄｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］．Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ，１９９７，２６７（５）：１２５８－１２６７．６ Ｐａｒｋｅｒ ＫＣ， Ｂｅｄｎａｒｅｋ ＭＡ，Ｃｏｌｉｇａｎ ＪＬ．Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｒａｎｋｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＨＬＡ―Ａ２２２第三军医大学博士研究生论文ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｏｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓｉｄｅ?ｃｈａｉｎｓ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９４，１５２（１）：１６３－１７５．７Ｒｅｓｓｉｎｇ ＭＥ，Ｓｅｔｔｅ Ａ，Ｂｒａｎｄｔ ＲａＭ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎｐａｐｆｌｌｏｍａｖｉｍｓ ｔｙｐｅ１６Ｅ６ａｎｄ Ｅ７ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｒｉｖｅａｎｄｉｎｖｉｔｒｏ １９９５，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ＨＬＡ－Ａ＋０２０１－ｂｉｎｄｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］．ＪＩｍｍｔｍｏｌ，１５４（１１）：５９３４－５９４３．８ Ｖａｎ ＳＨ，ＲｅｓｓｉｎｇＭＥ，ＫｗａｐｐｅｎｂｅｒｇＫＭ，ｅｔ ａ１．Ｎａｔｕｒａｌ Ｔ?ｈｅｌｐｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ１６（ｒｅ，ｖ１６）Ｅ７－ｄｅｒｉｖｅｄＨＰＶｌ６。ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ３ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｎ ｃｌａｓｓ Ｈ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ９ｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．ｈａｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００１，９１（５）：６１２．６１８．Ｒａｍｍｅｎｓｃｅ ＨＧ，Ｆｒｉｅｄｅ Ｔ’Ｓｔｅｖａｎｏｖｆｉｃ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ：ＦｉｒｓｔｌｉｓｌｉｎｅｄＪ］．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，４１（４）：１７８－２２８．１０ ＲｅｓｓｉｎｇＭＥ，Ｓｅｔｔｅ～Ｂｒａｎｄｔｔｙｐｅ １６ Ｅ６ＲＭ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ＣＴＬ ｅＤｉｔｏｐｅｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓａｎｄＥ７ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓｏｆ ＨＬＡ－Ａ＋０２０１一ｂｉｎｄｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１５４（１１）：５９３４－５９４３．１１Ｆｕｊｉｅ Ｔ’Ｔａｈａｒａ ＫＴａｎａｋａ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ａ ＭＡＧＥ－１－ｅｎｃｏｄｅｄ ＨＬＡ－Ａ２４一ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｃｐｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８０（２）：１６９－１７２．１２Ｔａｎａｋａ Ｅ Ｆｕｊｉｅ Ｔ＇Ｔａｈａｒａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈａＭＡＧＥ－３。ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ－Ａ２４１１］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９７，５７（２０）：４４６５－４４６８．１３ Ｏｉｓｏ Ｍ，Ｅｕｒａ Ｍ，Ｋａｔｓｕｒａ Ｅ ｅｔ ａ１．Ａ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ＭＡＧＥ．３．ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｐｉｔｏｐｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙ ＨＬＡ－Ａ２４－ｍｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ｈａｔＪ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８１（３）：３８７―３９４．１４ Ｂｒｉｓｔｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅＪ凡ＳｃｈｌｏｍｅｐｉｔｏｐｅＪ，Ａｂｒａｍｓ ＳＩ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈａｔ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓａｍｕｒｉｎｅ ｍｕｔａｎｔｒａｓＣＤ８＋ＣＴＬｖａｒｉａｎｔｅｎｈａｎｃｅｄＭＨＣｃｌａｓｓＩｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｃｎｉｃ１５ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０（５）：２４３３．２４４１．Ｍ，Ｍａｎｕｇｕｅｒｒａ ＪＣ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｔＯＴｏｕｒｄｏｔ Ｓ，Ｏｕｋｋａｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉａｆｆｉｎｉｔｙ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９７，１５９（５）：２３９１―２３９１．１６Ｍａｎｉｃｉ Ｓ，Ｓｔｕｍｉｏｌｏ Ｔ’Ｉｍｍｒｏ ＭＡ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｓｅｎｔＣＤ４＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ２３ａＭＡＧＥ．３ ｅｐｉｔｏＤｅｔｏｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ第三军医大学博士研究生论文ＤＲｌｌ［Ｊ］．Ｊ１７ＥｘｐＭｅｄ，１９９９，１８９（５）：８７１―８７６．ａＣａｓｔｅｌｌａｎｏｓ ＭＲ，Ｈａｙｅｓ ＲＬ Ｍａｉｍａｎ ＭＡ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ７７．８３．ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｔｙｐｅ－１８［Ｊ］．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２００１，８２（１）：１８Ｄｕｐｕｙ Ｃ，Ｂｕｚｏｎｉ ＧａｔｅｌＤ，Ｔｏｕｚｃ气ｅｔａ１．Ｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｒｐａｙｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ １６（ＨＰＶ?１６）ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｗｉｔｈ ｔｈｅ ＨＰＶ－１６ Ｌ１ ｇｅｎｅｅｌｉｃｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖａｇｉｎａｌ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈｎｏｄｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖ＇ｔｒｏｌ，１９９９．７３（１１）：９０６３―９０７１．１９ ＲｕｄｏｌｆＭＰ，Ｍａｎ Ｓ，Ｍｅｌｉｅｆ ＣＪ，ｃｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏＨＩ．Ａ－Ａ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｈＪ曲ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｅｐｆｉｄｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ－１８ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅ６ ａｎｄＥ７［Ｊ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００１，７（３ Ｓｕｐｐｌ）：７８８ｓ一７９５ｓ．２０ＫａｓｔｗＭ，Ｂｒａｎ＆ＲａＭ，Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ矾ｅｔａ１．Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ?Ａ２．１ ｒｅｓｔｒｉｃｅｄｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｅ７ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｔｙｐｅ１６ Ｅ６ａｎｄｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｎｐ］．ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，１９９３，１４（２）：１１５－１２０．２１Ｆｅｌｔｋａｍｐ ＭＣ，Ｓｍｉｔｓ ＨＬ＇Ｖｉｅｒｂｏｏｍ ＭＰ，ｅｔａＩ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ们ｔｈａｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ２２ｅｐｉｔｏｐｅ?ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔｔｕｍｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎｐａｐｉＵｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ１６－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９３，２３（９）：２２４２?２２４９．Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ Ｃ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ ＤＭ．Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍａｍｒａｌｅｙｔｏｔｏｘｉｅｉｔｙ【Ｊ】．Ｊ２３ ＴｉｍＩｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３，６４：３１３－３１４．ｔｏＭ．Ｒａｐｉｄ ｅｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ２４ａｎｄ ｅｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３，６５：５５―６３．ＪＬ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＡＥ，ｅｔ ａ１．Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｓａｆｅｔｙ ｓｔｕｄｙＧｉｌｓｏｎ ｌＵ，Ｓｈｕｐａｃｋｕｓｉｎｇ ｉｍｉｇｕｉｍｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｏｐｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆａｎｏｇｅｎｉｔａｌｗａｒｔｓ ｉｎＨＩＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＡＩＤＳ，１９９９，１３（１７）：２３９７―２４０４．２５Ｍａｄｒｉｇａｌ ＭＡ，Ｒｕｉｚ ＪＡ，Ｐａｌａｃｉｏｓ ＯＪ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ百ａｎｔ ｖｕｌｖａｒ ｃｏｎｄｙｌｏｍａｔａａｃｕｍｉｎａｔａ ｃｏｎｂｉｎｉｎｇ Ｃ０２ ｌａｓｅｒａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｕｒｇｅｒｙ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ Ｍｅｘ，２０００，６８（１）：２７―３０．２６ Ｐｅｒｒｙ ＣＭ，Ｌａｍｂ ＨＭ．Ｔｏｐｉｃａｌ ｉｍｉｇｕｉｍｏｄ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓｕｓｅｉｎ ｇｅｎｉｔａｌｗａｒｔｓ［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ，１９９９，５８（２）：３７５?３９０．２７Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＨＳ，ＤａｖｉｅｓＭＩ々Ｈｏｌｄｉｎｇ飓ｅｔａ１．ＰｈａｓｅＩｓａｆｅｔｙａｎｄ ａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆＴＡ－ＧＷ：ａＶａｃｃｉｎｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ６ Ｌ２Ｅ７ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｏｎｔ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌｗａｒｔｓ［Ｊ］．１９９９，１７（１）：４０－４９．２４第三军医大学博士研究生论文２８ＢｒｏｗｎＤＲ，ＳｃｈｒｏｅｄｅｒＪＭ，Ｂｒｙａｎ ＪＴ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｃｏｎｄｙｌｏｍａｔａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ｌｅｓｉｏｎｓ ｆｌ＇ｏｍ ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ２９ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７（１０）：３３１６―３３２２．Ｚｈａｎｇ／２，ＺｈｏｕｗｉｔｈｏｕｔＪ，Ｃｈｅｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＨＰＶ６ｂ ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｒｃ：ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｉｎａｄｊｕｖａｎｔｍａｎ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００，１８（１１?１２）：１０５１?１０５８．ＭＡ，Ｃｔ ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ３０Ａｒａｎｙ】，Ｔｙｒｉｎｇ ＳＫ，Ｓｔａｎｌｅｙｉｎｌｎｌｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｉｔａｌ ｗａｒｔｓ ｔｒｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｏｐｉｃａｌ ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ｃｒｅａｍ５％ｆＪ】．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ＆ｓ，１９９９，４３（１）：５５―６３．３１ Ｏｐａｎｅｙｅ ＡＡ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｌｎｕｎｅ ｃｙｓｔｅｍ ｉｎ ｆｅｍａｌｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｗａｒｔｓ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｏｒｗｉｔｈｏｕｔ ｇｅｎｉｔａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｊ Ｓ＇ＦＤ ＡＩＤＳ，１９９９，ｌＯ（１萄：８１５－８１６．３２Ｖａ饿ｌｅｒｂｕｒｇ Ｓ耳Ｒｃｓｓｉｎｇ ＭＥ，Ｋｗａｐｐｅｎｂｅｒｇ ＫＭ，ｅ￡ａ１．Ｎａｔｕｒａｌ Ｔ－ｈｅｌｐｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙａｇａｉｎｓｔｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１６（Ｉ－ＩＰＶｌ６）Ｅ７－ｄｅｒｉｖｅｄｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎｐａｆｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＰＶｌ６－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ３ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ ＩＩ―ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ３３ＪＣａｎｃｅｒ，２００１，９１（５）：６１２－６１８．ｅｔＭｕｄｅｒｓｐａｃｈ Ｌ’Ｗｉｌｃａｙｎｓｋｉ Ｓ，Ｒｏｍａｎ ｋａ１．Ａ ｐｈａｓｅＩ ｔｒｉａｌ ｏｆａｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ（ＨＰＶ）ｐｅｐｔｉｄｅ ３柏６－３４１６．ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ?ｇｒａｄｅ ｃｅｒｖｉｃａｌａｎｄ ｖｕｌｖａｒｉｎｔｒａｅｐｉｔｈａｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ｗｈｏ ａｒｅ Ｉ－ＩＰＶ １６ｐｏｓｉｔｉｖｅ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００，６（９）：始ｉｉ翠鞭大学饕±研囊垒论定第二章ＨＰＶＩ ６Ｅ７。。．耵的置换修饰、分子模拟及其抗膘性鉴定靛 言ＦＩＰＶ感染餍部援害内戆病毒潦｛２｛被有效清除，墩锼尖锐浸瘥反复发整帮尚豁缝织 癌变。ＣＴＬ属ＣＤ８１细胞，其袭黼受体（Ｔ ｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴｃＲ）与艴细胞上ＨＰＶ抗原特异结合爝，在ＭＨＣ Ｉ类抗原的介导下，可对靶细胞发挥溶解杀伤作用。作为 鲴恕免疫反应驹主要效应细骢，ＣＴＬ在瘸毒感染对邋避蓉锯被感染豹细臌蕊在清豫瘸 毒纛隘壹爨絷慢性亿孛莛关键俸霸。鸯于ＨＰＶ墓染爱不戆产生奢效戆镙护幢撬髂，袭缨腥免疫特箍ｌ是ＣＴＬ效应在抵拣｝帮ｖ感染免疫应誉孛瓣律用倍受重视嘎磷究发瑰，慢性Ｉ－ＩＰＶ感染者外周血或局部组织中存在特异性ＣＴＬ，这些ＣＴＬ可以识别ＨＰＶ编码蛋白中一个娥绺个表位【２】。基因藏组或人工合成的ＨＰＶ蛋白多默，可在体外刺激ＣＴＬ细胞，增强其游解ＨＰＶ感染的靶鳃胞，且使用的多款浓度远远低于体内ＨＰＶ抗原表 述耱瘩平；受鬟襄豹是，ＣＴＬ胃谈鄹缨臆巍表达熬ＨＰＶ抗藤，莠慰遮鼗袭迭拣嚣懿缨貔有溶解捧惩。毯魏，ＣＴＬ程谤除ＨＰＶ感染孛藤蘩簧律震掰。迸一渗研究发现，ＨＰＶ１６Ｅ７鬻囱的多个区段表位撼ＣｒＬ的强免疫原１４㈡ｌ。 虽然ＣｒＬ猩识别ＨＰＶ抗原，特别是Ｅ７抗原和满除ＨＰＶ感染中起煎越作用，但即使在ＨＰＶ感凝者体内可以稳定地检测判ＨＰＶ特异的ＣＴＬ尧隆对，病搬仍然难以被 极露奏效演豫。莲筵，瑟警惑聚豢终蠹存在将雾缝ａ阻蠢隆，毽箕功挠鸯一定较鏊，霹能受要谗漆藏瘸毒本身蠢素煎掷嬲。鼹ＣＴＬ发簿臻耀的覆瑾来看，攘灞弩能与变异 或可溶性的抗艨寝位与ＣＴＬ的ＴＣＲ结合，阻止ＣＴＬ与被感染酶ＨＰＶ靶细胞发生反 应，或者与袭位竞争结合靶细胞液筒的删ｃ Ｉ类分予，使ＣＴＬ不能发挥劝能有关。Ｅ７抗原可能含祷母袭位竞争结舍的撺制性多驮序列，其结含为高于表位本身，但不其备 提应嚣抗蒙魏。嚣魏，掇嚣基７撬骧掰整含兹霹表藏超瓣键作爱黪多歉露魏，并撂照薅表豆遴霉器菇精会力筑置换签镣，基蠢重要蘸舔藤意义洚枷。 在前面辩ＨＰＶｌ６Ｅ７抗原袭德的研究中发现，从谜论上分析与ＨＬＡ－Ａ２结合力极 高的Ｐ１、Ｐ４和Ｐ５，并不具备相斑的抗原性。因此，本部分实验采用纲腮姆实验中对他细胞同时包被表位和另外一条努肽的方法，观察多胱是否影响表位诱搏特异性ＣｒＬ杀巍靶绥夔ｅ安验表鼹，Ｉ－ＬＰＶｌ６Ｅ７４９．ｓ７箨灸ＨＬＡ－Ａ２鼹裁缝表位虽然麓够诱导蒋异整 ＣＴＬ杀霞鬻缀臆，蓬与ＨＬＡ－Ａ２瀚续台力赁显不离。瓣魏，本磅究禳攥ＨＬＡ－Ａ２疆裁 性９肽表位的２个主要锚点是位予歇链第２位敢氯基酸残基和第９位的戳凝酸残基（露 羧基末端），巍然２位的氨基酸臻弑为亮氨酸（Ｌ）或激氮酸（Ｍ），第９能的氨基酸残第三军医大学博士研究生论文基为亮氨酸（Ｌ）、缬氨酸（Ｖ）或异亮氨酸（Ｉ）时，多肽与ＨＬＡ－Ａ２分子亲和力较高， 成为ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位的可能性极大这一理论基础１１２’１引，对ＨＰＶｌ６Ｅ７４９研采 取氨基酸置换修饰的方式，以期鉴定出结合力更高又同时保留原有抗原性的新表位。置换修饰初步得出多肽序列以后，运用量化模体法比较其与ＨＬＡ．Ａ２分子的结合力，选出量化积分靠前的多肽。基于对多种ＭＨＣ Ｉ类分子晶体结构的认识，大量ＣＴＬ 表位的鉴定及多肽与ＭＨＣ Ｉ类分子结合的结构要求资料的积累，可藉ＭＨＣ Ｉ．肽复合物结构初步筛选ＭＨＣ Ｉ类分子限制性表位这一理论【”‘２１】，本研究应用计算机分子模 拟的方法【２“，从理论上了解多肽与ＨＬＡ．Ａ２的结合情况，以避免盲目合成多肽。对经过模拟初步证实的置换肽序列，根据标准Ｆｍｏｃ方案采用固相合成法合成多肽１２３１，经 ＲＰ―ＨＰＬＣ纯化、纯度分析，用质谱进行定性鉴定。之后，采用与第一章相同的方法， 运用细胞毒实验鉴定已经合成、纯化和鉴定的多肽序列的抗原性，以期鉴定出新的 ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位。第一节ＨＰＹｌ６Ｅ７抗原预测表位多肽间的竞争抑制作用１．实验材料与方法 １．１实验材料和仪器 １．１．１多肽序列 Ｉ－ＩＰＶｌ６Ｅ７抗原ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位Ｐ２［Ｅ７１１．１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）］、Ｐ３［Ｅ７ （ＲＡＨｎ盯ｖ］陌）】以及另外３条Ｅ７来源的多肽ＰＩ［Ｅ７ ７－１ｓ（ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ）］、Ｐ４［Ｅ７ （ＲＬＣＶＱＳＴＨＶ）】和Ｐ５［Ｅ７ ８２．９０（ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ）】。 １．１．２主要实验材料ＨＩ．Ａ４９－５７６６－７４Ｉ类单抗干板ＡＳＮ７２Ｄ天津舒普生物技术有限公司Ｓｉｇｍａ２４及９６孔培养板 １．１．３主要试剂 ＲＰＭｌｌ６４０培养基 ＩＭＤＭ培养基 胎牛血清ｒｈＩＬ一２ＡＦＭ６３１７ＦＡＧＥ７４１５ＣＧｉｂｃｏ ＢＲＬ ＨｙＣｌｏｎｅ ＨｙＣｔｏｎｅＡＨＭ９８９０２０００１２０９第三军医大学全军免疫研究所 第三军医大学全军免疫研究所ＮＥＮ＇ｒ”Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．Ｔ２细胞Ｎａ５１Ｃｒ０４１．１．４主要仪器：第三军医大学博士研究生论文ＦＨ４６３Ａ－自动定标器 二氧化碳孵 电子天平 台式冷冻离心机 ＦＴ．６０３．井型Ｙ闪烁探头 净化工作台ＢＢｌ６型北京核仪器厂 德国Ｈｅｒａｃｕｓ公司ＦＡｌｌ０４型上海天平仪器厂 德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司 北京核仪器厂Ｓｗ．ａ．１Ｆ型苏净集团苏州安泰 空气技术有限公司１．２主要实验方法 １．２．１效应细胞的制备 取５例健康献血者静脉血各３ｍｌ用免疫磁珠分离法分离Ｔ细胞，采用ＡＳＮ７２Ｄ泰 萨奇一类单克隆抗体干板、运用微量淋巴细胞毒实验检出ＨＬＡ．Ａ２＋标本，取经过筛选 合乎要求的献血者静脉血２００ｍｌ并运用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，分装 为３个培养瓶进行培养，用含１０％胎牛血清的１６４０培养基调节细胞密度达ｌｘｌ０６／ｍｌ， 分别加入上述Ｐ２、Ｐ３和对照用无关肽Ｐ６共３次刺激，多肽浓度为１０］ｇｌｍｌ，每次刺 激均需洗涤和重悬ＰＢＭＣ并加入白细胞介素ＩＩ（浓度为１００＂／ｍ１），时间间隔为１周， 最后一次刺激３天后收集效应细胞。 １．２．２靶细胞的制备 于检测前一周复苏和培养Ｔ２细胞，使用前用多肽单独或同时包被分组为：Ｐ２、 Ｐ２＋Ｐ１、Ｐ２＋Ｐ４、Ｐ２＋Ｐ５、Ｐ３、Ｐ３＋Ｐ１、Ｐ３＋Ｐ４、Ｐ３＋Ｐ５和无关肽，每１０‘ｒ２细胞分别 加入各多肽１０、ｇ。包被后的靶细胞在细胞毒实验进行前１ ｈ开始５１ｃｒ标记，于３７条 件下，用含有１００ｍＣｉＮａ２ｓ１Ｃｒ０４的ＦＣＳ０．５ｍ１分别孵育标记上述靶细胞１ｈ。１．２．３细胞毒实验 在９６孔Ｖ型底细胞培养板中，每孔加入靶细胞１００１（靶细胞密度ｌｘｌ０５／ｍ１）， 效应细胞根据效／靶比５０：１加入，每组９个复孔；对照组效应细胞用无关肽ＨＢ