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副溶血弧菌的快速鉴定检测方法研究进展
日 17:25:08 Thursday&&
作者：杨芳 李秀娟 徐保红&&&&作者单位：050011 石家庄市，河北师范大学化学与材料科学学院(杨芳);河北省石家庄市疾病预防控制中心(李秀娟、徐保红)
【关键词】& 弧菌，副溶血性;快速检测方法
副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus，VP)是一种革兰阴性嗜盐杆菌，是引起食源性疾病的重要病原之一。该菌主要分布于沿岸海水、海河交界处及海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌。它在海产品上的带菌率高达45.7%[1]，其生长速度是一般细菌(如大肠杆菌、沙门氏菌等)的2倍，因而更易于引起食物中毒。常规的VP的检测方法包括增菌培养、选择性培养、生化试验和血清学反应等过程，耗时长、操作繁琐、检出率低，不适应实际检验工作的需要。随着科学技术的发展，一些快速检测方法以其特异性强、敏感性高、分辨率高、操作简单、稳定性好、耗时短的优点逐渐取代常规的检测方法，在病原菌检测方面有着广泛的应用前景。本文就VP的快速检测方法综述如下。
　　1 聚合酶链式反应(PCR)技术
　　由于PCR技术具有敏感、快速、特异性强、操作简单等特点，在微生物的鉴定检测方面展现了巨大的潜力。以常规的分离培养方法检测VP耗时长，需要4～5 d，而采用PCR法进行检测，只需要10 h，不仅节省了时间，且可提高检测通量，一次可检测多达96份样品。Kim等[2]建立了以toxR基因为靶基因采用PCR方法检测了373株VP和290株其他菌株，结果表明373株VP都携带toxR基因而非VP菌株结果均为阴性。Venkateswaran等[3]针对VP的gyrB基因进行PCR引物设计，扩增片段大小为285 bp，运用该PCR方法检测来自环境、食品和临床样品中的VP，共117菌株，结果表明所有的菌株都能扩增出258 bp的基因片段。除了toxR、gyrB基因外，也可采用tl、tdh、tlh、trh、Fla基因和pR72H片段等[4-8]来检测VP。
　　1.1 多重PCR技术 Bej等[9]针对VP的tlh基因、tdh基因、trh基因用多重PCR方法检测贝类中的VP。检测结果表明：从临床、海产品、环境和牡蛎中分离得到的111份VP菌株，用该方法对所有的VP菌株全部扩增出tlh基因，60份VP菌株扩增出tdh基因，43份VP菌株扩增出trh基因。该方法的灵敏度较高，10 g牡蛎组织增菌肉汤的最低检测量为10～100 cfu[10]。吴彩云等[11]通过对反应体系中各组分含量的优化及循环参数的摸索，确立了同时检测t1和tdh基因的多重PCR技术，结果与常规PCR的一致。该法不仅具有常规PCR的优点，而且还能节省时间及Taq酶、dNTP等材料，还可尽量减少或避免因操作步骤过多因污染所带来的假阳性等问题[12]。
　　1.2 实时PCR方法 实时PCR由于扩增与检测在封闭单管内进行，因此能够避免常规PCR方法易污染的缺点，并且实现了PCR从定性到定量的飞跃，具有很好的应用前景。Kaufman等[13]针对tlh基因建立了检测VP的实时荧光定量PCR方法，结果表明该方法可在1 h之内定量检测出牡蛎中的VP。Takahashi等[14]针对VP的toxR基因也建立了实时荧光定量PCR方法检测海水、贝类中的VP，最低检出限为36 cells/ml。Blackstone等[15]建立的一种基于荧光探针的检测VP的(针对其tdh基因)实时PCR方法。结果表明，只有携带tdh基因的VP能产生荧光信号，并且与携带tdh基因的阴性弧菌或者其他细菌无交叉反应。该方法检测VP的tdh基因特异性强(仅检测携带tdh基因的阳性VP)，灵敏度高(1 cfu/PCR反应体系)，快速(整个实验24 h内就可以完成，检测不到1 h就可完成)。Ward等[16]建立了基于TaqMan荧光探针的多重实时PCR方法检测贝类中VP的tlh、tdh、trh和ORF8基因，结果表明该方法可用于检测基因组DNA和菌纯培养物，其灵敏度分别为200 pg和1&104 cfu/m。
　　1.3 MPN?PCR方法 MPN法(most probable number，最可能数法)采用多管发酵法，通过几率计算，测定样品中细菌的最可能数，达到定量的目的。MPN法与PCR法的结合可达到定量和提高检出限的目的。栾晓燕等[17]根据VP的tdh、trh、tlh基因序列设计了3对特异性引物，通过增菌培养、样品处理、PCR扩增，并且结合了MPN法，实现了对水产品中的VP快速定量检测。该方法的最低检出限为12 cfu/ml比直接进行PCR扩增的最低检出限(1.22&103cfu/ml)提高了100倍，对tlh、tdh、trh基因的特异性强，整个检测过程不超过16 h。Blanco?Abad等[18]分别用A/P(Absence?Presence)?PCR和MPN?PCR法进行鉴定VP，比较了这两种方法的高效性和灵敏性，结果证明MPN?PCR法优于A/P?PCR法，可实现快速、准确检测VP。
　　2 UPPCR?SSCP
　　通用引物PCR (UPPCR)和单链构型多态性(SSCP)相结合进行检测具有很高的灵敏度和特异性，可以将病原菌分辨到种。16s RNA基因因保守性高，又有一定的随科、属、种不同而有不同程度差异的变异区，被认为是分类及临床检测鉴定的最有用的靶基因。以细菌16s?RNA基因保守区设计引物，对其可变区进行PCR扩增后，结合特异性探针杂交、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)或直接测序等手段就可以把病原菌定位至种。彭宣宪等[19]以16s RNA基因为目的片段，采用通用引物PCR配合SSCP分析(UPPCR?SSCP技术)，对弧菌科弧菌属中的VP、溶藻酸弧菌等进行了检测。结果发现SSCP技术能较好地鉴别细菌的不同种，但对同种不同株细菌的区分较困难。结合对不同科属种细菌的UPPCR的结果，可以认为种间差异的SSCP图谱与亲缘关系似乎有一定联系，即亲缘关系越近则差异越小;反之，则差异越大。总之，若建立有关病原菌的SSCP电泳图谱，可用于病菌的快速检测。
　　3 DNA杂交
　　Mccarthy等[20]建立了两个无辐射探针碱性磷酸酶(AP)标记的探针和地高辛(DIG)标记的探针检测VP的tlh基因。对26株VP、88株其他弧菌和10株非弧菌物种用AP标记探针进行特异性实验，结果表明只有26株VP弧菌与AP探针杂交，种属特异性强。对从牡蛎中分离的206株疑似VP的检测结果显示AP标记探针和API?20E鉴定的结果一致性为97%。对584株疑似VP的检测结果显示AP标记探针和DIG标记探针检测结果一致性达98%。基于AP和DIG标记探针的方法，Gooch等[21]通过AP探针(Direct?VPAP)和DIG探针(Direct?VPDig)以及MPN?VPAP3种方法对不同季节和储存条件下的牡蛎中VP进行定量检测，结果经回归分析显示MPN?VPAP方法检测VP与Direct?VPAP、Direct?VPDig方法检测VP的效果是一致的，但灵敏度不同。对0.1 g的样品进行检测结果表明MPN?PCR法的灵敏度为3MPN/g，而其他两种方法的灵敏度为10 cfu/g，因此MPN?PCR法在VP低浓度时表现出高灵敏性。而在VP含量较高时利用Direct?VPAP、Direct?VPDig方法进行检测，则更快速、经济和省力。Banerjee等[22]建立了一种DNA探针快速检测VP的方法。在hydrophobic grid membrane filters (HGMF)方法中，将固定在HGMF上VP?DNA模板与DIG标记的tdh基因探针进行杂交后检测VP。尽管经过富集培养后可以在1 d之内检测出VP，但是由于该方法引入了DNA分离、DIG标记探针的合成、VP引物的设计和克隆杂交，使其操作步骤复杂化。
　　4 LAMP检测方法
　　LAMP(核酸扩增?环介导等温扩增技术)是一种新颖的检测VP的方法。LAMP技术依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条特异性引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件下对核酸进行扩增，具有高特异性、快速简便、高效性等特点。徐芊等[23]针对VP的tlh基因设计四条特异性引物进行LAMP扩增，并对扩增反应进行优化，反应时间为1 h，反应温度为60℃。结果表明LAMP检测VP特异性强、检测灵敏度高、操作简便、检测成本低，有望发展成为快速检测VP的有效手段。
　　5 Transcription?reverse transcription concerted(TRC)方法
　　TRC是用于检测mRNA的一种新研制的方法，它是将目标RNA序列反转录成cDNA，经过dsDNA转录成RNA后插入活性荧光DNA探针(INAF DNA探针)，通过实时荧光检测器在一恒定的温度下定量检测TRC反应中的荧光强度，然后根据反应时间和荧光强度比率作图。在tdh?TRC与trh?TRC方法中反应30 min后，样品的荧光强度比率&1.2认为是阳性，<1.2的为阴性。Masuda等[24]新建立了快速、灵敏的TRC方法定量检测VP中tdh和trh基因的mRNA转录。针对提取来自24株VP，31株其他弧菌属，8株非弧菌属的RNA检测结果表明：用TRC方法分别检测tdh和trh的 mRNA的结果与用DNA克隆技术检测结果一致，灵敏度为100 cfu。但tdh?TRC只检测tdh mRNA;菌株携带任何tdh的不同基因(tdh1?tdh5)都呈现阳性的结果而携带trh基因(trh1或trh2)都呈阴性。同理，trh?TRC方法只对携带trh基因的VP表现出阳性结果。因此，TRC方法检测VP的致病基因具有简单、特异、快速的特点，同时TRC原理也可用于检测其他致病菌。
　　6 免疫学方法
　　6.1 间接免疫荧光抗体方法 樊景凤等[25]建立了VP的间接免疫荧光抗体检测方法，该方法将细菌固定于载玻片上，滴加免疫血清，37℃孵育30用PBST(含0.5%Tween?20的0.01 mol/L，pH=7.4的PBS)洗涤3次，滴加FITC标记的羊抗兔LgG，37℃孵育30用PBST洗涤3次，干燥后滴加PBS缓冲的甘油(PBS∶甘油=1∶9)1滴，加盖玻片，在其上加1滴无自发荧光的香柏油，用落射荧光显微镜进行观察。交叉反应和阻断试验证明该方法的特异性较高，并且该方法具有快速、简单的优点适用于现场的应用推广。
　　6.2 间接酶联免疫吸附法 窦勇等[26]建立了用于VP的间接酶联免疫吸附法。该方法标准化后进行测定，交叉实验与阻断实验表明其具有较高的特异性，并且检测时间短，准确度高，可快速检测VP。王军等[27]用0.5&10-3(V/V)甲醛、30℃作用8 h灭活病原菌制成菌苗。用该菌苗免疫新西兰兔获得特异性抗血清，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为标记第二抗体，对VP进行间接ELISA快速检测，其最低检测极限为5&104 cfu/cm3。现场检测即将大黄鱼肝脏粗研磨后加入5倍体积的无菌0.9%氯化钠溶液继续研磨，取上清液检测;水样直接检测。结果表明间接ELISA检测法可用于VP的快速检测。
　　6.3 斑点ELISA法 斑点ELISA法是一种样品处理上的创新方法，针对VP产生TDH和TRH的特点，将菌株培养液的上清点样于硝基纤维膜上，干燥后以BSA封闭，再在点样处加TDH和TRH抗体，过夜后与第二抗体反应，最后加底物产生颜色反应指示结果。很显然这种方法更适合处理大量样本。臧红梅等[28]用斑点ELISA技术检测VP，通过交叉实验与阻断实验表明该方法的特异性好，重复性好，批内和批间结果相同，无差异。通过免疫血清敏感性试验结果得知，当VP菌量低于104 cfu/ml时，不易检出。斑点ELISA法虽然特异性强，但灵敏度不高，还有待进一步提高其灵敏度。提高灵敏度的方法有：AB(avidin biotin system)?ELISA法;PCR?ELISA法;斑点免疫酶结合试验(DIA)等。
　　7 荧光分析法
　　VP具有代谢阿拉伯糖的能力，在阿拉伯糖? 葡萄糖醛酸盐培养基(AG)培养基上经过选择性增菌后的VP具有较高胰蛋白酶样活性，而其他菌株的胰蛋白酶活性则可忽略，并且VP胰蛋白酶活性不受其他菌株浓度的影响，仅与增菌前VP的浓度有关。高旗利等[29]用此方法检测水产品中是否污染有VP。结果表明该方法灵敏度为20个/g，只需8 h就可完成水产品中VP的初筛检验。操作简便、灵敏度较高，适于快速检测需要。
　　8 传感器技术
　　8.1 电化学技术 抗原?抗体结合前后可导致多种信号的改变，如：重量、光学、热学、电化学等，电化学免疫传感器可通过感应抗原?抗体结合前后的电化学变化来实现对病原微生物的定性和定量检测。Zhao 等[30]将HPR标记VP抗体掺于琼脂糖和纳米金中并修饰于丝网印刷电极的表面，制备一次性电化学免疫传感器来快速检测VP。然后采用循环伏安法表征免疫电极和检测酶促反应，根据免疫复合物屏蔽HRP活性中心引起还原电流的变化来定量检测VP。在优化的实验条件下，免疫电极的线性检测范围为105～106 cfu/ml，检出限为7.4&104 cfu/ml(S/N=3)。该免疫电极具有较好的特异性、重现性(RSD<6%)、稳定性(1周后电流响应为初始值的91%)和准确性(与ELISA符合率为97.5%)，可用于VP的快速筛选。
　　8.2 电子鼻技术 微生物在生长代谢过程中可产生特有的挥发性代谢产物，具有微生物种的特异性，而电子鼻技术是检测挥发性成分的人工嗅觉装置，针对微生物的挥发性代谢产物实现对微生物的检测。胡惠平等[31]利用电子鼻技术对从从南美白对虾中分离的一株VP进行检测。实验采用具有18个金属氧化物传感器的Fox 4000电子鼻对VP经纯培养后产生的挥发性代谢产物进行检测，同时用空白3.5%氯化钠TSB培养液作为对照。将电子鼻获得的样品数据用主成分分析(PCA)、判别因子分析(DFA)、单类成分判别分析(SMICA)等多元统计方法进行分析。结果显示，VP经纯培养后产生了明显不同于空白培养液气味的挥发性代谢产物。可见，电子鼻可应用于纯培养微生物的检测，实现对VP无损、快速检测。
　　9 VP快速测试片
　　许如苏等[32]以法国进口弧菌显色培养基为主要原料，运用微生物测试片专有技术，制成一次性VP快速检测片。并对其检测性能进行测试研究。结果表明该测试片对纯菌的检测灵敏度达到8 cfu/ml，与霍乱弧菌、溶藻弧菌等17种非目的菌无交叉反应;重复性试验结果相对偏差低8%;24 h可完成检验工作。应用该测试片检测人工染菌样品和自然样品，检测结果与GB或SN标准方法一致。因此，VP快速测试片具有敏感度高、特异性强、重复性好、操作简便等优点，可用于食品和水产品中VP的快速初筛。
　　10 基因芯片(Gene Chip)
　　近年来基因芯片技术在微生物检测领域的发展将会充分发挥准确及高通量并行检测的优越性。以基因微阵列为基础的芯片，可大大提高工作效率，减少人为误差，实现微生物的自动化检验。李君文等[33]利用16SrRNA基因作为检测的靶基因，在其恒定区设计PCR引物，在可变区设计检测探针：用1对PCR引物就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来(扩增时1条PCR引物采用荧光标记)，再用每种细菌的特异性探针阵列与标记的靶片段进行杂交反应，杂交后用专用设备读取分析荧光信号，可以定性和半定量地检出致病菌。用这种芯片可以特异地检出水中VP、军团杆菌、李斯特菌等。结果表明基因芯片技术检测水中常见致病菌可以实现高通量、并行检测，一次实验即可得出全部结果;特异性强、敏感性高、操作简便、快速(检测时间约4 h)。
　　以上总结了VP各种快速检测方法，但综合来看，每种方法都有其优缺点，在定性和精确定量方面难以兼顾。微生物鉴定实验需要积累和吸取实验经验，技术含量高，但是随着分子生物学的飞速发展，新的技术、仪器设备不断出现，如基因芯片技术;检测技术也不断完善，特别是各种分子技术的融合与创新，如PCR、DNA杂交、ELISA 三大现代分子生物学技术的联用，为VP的快速检测提供了强大的工具，必将会实现VP快速、准确、灵敏、特异、大规模的检测。
【参考文献】
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溶血相关病种:
什么是新生儿溶血症？
新生儿溶血症是因为妈妈跟宝宝的血型不合，妈妈与胎儿产生抗原抗体的反应，导致胎儿的红细胞被破坏，引起的同种被动免疫性疾病.....
新生儿溶血症怎么办？
如果新生儿黄疸是溶血所致，可以使用一些抑制母亲血型抗体作用的药物，如免疫球蛋白、白蛋白，阻止胆红素进入大脑，减少发生胆红素脑病的机会。
胆红素处于脂溶性状态时很容易进入大脑，当处于水溶性状态时可经尿排出，通过蓝光治疗，使胆红素化学结构发生改变，利于其随尿排出体外。
通过换血，可以换出血中已致敏红细胞及抗体，阻止进一步溶血；减少血清非结合胆红素浓度，预防发生胆红素脑病；纠正贫血，防止心力衰竭。
新生儿溶血症发病原因
由于母亲的血型与胎儿（或婴儿）的血型不合，如Rh血型不合或ABO血型不合引起同族免疫性溶血病，Rh血型不合所致溶血常较ABO血型不合为严重。
ABO血型不合
ABO血型不合最多见的是母亲为O型，婴儿为A型或B型。第一胎即可发病，分娩次数越多，发病率越高，且一次比一次严重。尚可见于母亲为A型，婴儿为B型或AB型，母亲为B型，婴儿为B型或AB型，但少见。婴儿为O型者，可排除该病。
Rh血型不合
Rh血型不合引起的新生儿溶血症在我国的发病率较低。通常是母亲为Rh阴性，胎儿为Rh阳性而血型不合，并引起溶血，一般第一胎不发病，而从第二胎起发病，但如果Rh阴性的母亲在第一胎前曾接受过Rh阳性的输血，则第一胎也可发病。
新生儿溶血症症状
新生儿溶血症宝宝会出现各种症状，主要表现为黄疸、肝脾肿大、贫血等。症状轻的进展缓慢，全身状况影响小；严重的病情进展快，出现嗜睡、厌食，甚至发生胆红素脑病或死亡，所以一定要积极治疗。
one溶血病患儿黄疸出现早，一般在生后24h内出现黄疸。
two溶血病患儿有不同程度的贫血，以Rh溶血病较为明显。
three溶血患儿轻症无明显肝脾肿大，重症可有明显肝脾增大。
four溶血病患儿有不同程度的贫血，以Rh溶血病较为明显。
five溶血病患儿有不同程度的贫血，以Rh溶血病较为明显。
six溶血病患儿有不同程度的贫血，以Rh溶血病较为明显。
新生儿溶血检查
血液生化检查：
红细胞减少，血红蛋白降低，网织红细胞显著增加，涂片中见有核红细胞。
血型检查：
在母婴Rh血型不合时用马血清来鉴定ABO血型会出现错定ABO血型的可能。
特异性抗体检查：
检查有免疫抗体，ABO溶血病时红细胞乙酰胆碱脂酶活性明显降低。
血清胆红素：
溶血病患儿生后黄疸逐渐加深，胆红素水平呈动态变化，需每天随访2～3次。
1、X线检查
见胎头颅骨外软组织晕轮形成透明带，体形变胖，手足不能屈曲或有胎盘阴影增大。
2、超声检查
用超声波检查如胎儿皮肤厚度超过5mm者即示胎儿水肿。超声监测可探及肝脾肿大和周围水肿，并可用经腹壁羊水穿刺检测胆红素在羊水中的存在。
新生儿溶血预防
Rh阴性的女性在生育前，需要输血时，禁止输入Rh阳性的血，避免体内产生抗体，使第一胎发生致命的溶血反应。
对于政策上允许生二胎的Rh阴性的妇女，应当于生下第一胎Rh阳性的孩子三天内，给该妇女接种抗Rh(D)球蛋白，可使第二胎溶血反应下降90%。
凡所生新生儿死于黄胆的妇女，应进行检查。如考虑属于母婴血型不符所致，若再次怀孕后可服中药进行预防，并做好新生儿换血疗法的准备。
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