实验培养微生物实验时需要控制的培养条件有哪些?

微生物的生长繁殖及其控制微生物的
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微生物的生长繁殖及其控制
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[微生物培养基质量控制技术和标准|微生物培养基]摘要:微生物培养基的酸碱度、凝胶强度和选择性等直接影响到培养基的质量,在理化试验方法中采用连接可渗透陶器型液体接头的电极和平头电极或者连接微型探头的电极可分别测定液体和固体培养基的pH值 ,而采用 Gelometer和the LFRA Texture Analyser可测定固体培养基的凝胶强度。在微生物学方法中…… [关键词:培养基 微生物 质量控制 微生物培养基 接种 菌株 生长率]…
摘要:微生物培养基的酸碱度、凝胶强度和选择性等直接影响到培养基的质量,在理化试验方法中采用连接可渗透陶器型液体接头的电极和平头电极或者连接微型探头的电极可分别测定液体和固体培养基的pH值 ,而采用 Gelometer和the LFRA Texture Analyser可测定固体培养基的凝胶强度。在微生物学方法中固体培养基采用倾注平板法、涂布法、划线法(半定量法)、改良的 Miles-Misra法等测定生长情况,液体培养基采用稀释法测定生长率,用目标菌和杂菌的混合菌株评价选择性增菌培养基的选择性,利用OD值评价液体培养基生长率等。ICFMH (国际食品微生物学和卫生学委员会培养基工作组)、ISO、FDA以及我国卫生部等相继制定了培养基质量控制的标准,但目前还没有一个系统的适合我国国情的培养基质量控制国家标准,以致各相关单位采用的标准不一致,所以制定培养基质量控制国家标准非常关键。
关键词:培养基,质量控制 ,标准
我国生产培养基已有相当长的历史,因为培养基种类繁多,生产培养基的厂家也有很多,虽然很多相关单位都有自己的质量控制标准,但到目前还没有一个系统全面适合我国国情的国家标准,以致培养基的质量参差不齐,直接影响到很多微生物学实验结果,所以制定微生物培养基的国家标准非常关键。培养基质量控制方法包括理化试验方法和微生物学试验方法,其中理化试验方法包括 pH值的测定 、凝胶强度的测定等,微生物学试验方法分固体和液体培养基的定量和半定量以及定性试验。本文就培养基的质量控制做一综述,为制定培养基质量控制国家标准提供参考。
1 培养基质量控制方法
1.1 理化试验方法
1.1.1 pH值测定:灭菌前后都应该测定 pH值,采用连接可渗透陶器型液体接头的电极测定液体培养基的 pH,固体培养基可用平头电极 (Radiometer A/S,DK-2400 Copenhagen NV,Denmark)或者连接微型探头的电极(Microelectrodes Inc.,NH03053,U.S.A)测定pH。pH值在灭菌前后均需测定,测量时尽量使培养基温度降到20℃~25℃,校正通常用接近40g/L的NaOH或者接近36.5g/L(约1mol/L)HC1。
1.1.2 凝胶强度测定:凝胶强度也是一个重要指标,灭菌条件特别是pH会影响凝胶强度。Gelometer(Marine Colloids Inc.,2,Edison Place,Springfield,NJ 0708 1,U.S.A.)和the LFRA Texture Analyser(C.S.Stevens&Son Ltd.Dolphin Yard,Holywell Hill,St.Albans,Herts,U.K.)均能提供良好的测量性能。这种利用直径为10mm~25mm的圆柱形金属探头测量压破琼脂表面时所需的压力。
一般理化试验可迅速测出配方中存在的错误,而不需等待微生物培养试验,因此理化试验是培养基质控的有效手段。
1.2 微生物学试验方法
1.2.1 质控菌株的保存:一般细菌保存菌种的制备可从质控菌株接种于含5%羊血的胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (TSA)上,在合适的环境和温度下孵育18—24h,接种以后,通过菌落形态检查纯度和验证一致性。必要时实施生化试验。然后制成冻干菌种,或制成含有10%到15%甘油的防冷冻培养物置于-50%或更低的温度保存备用。在低于-70%的温度下菌株可以无限期保存,在-50℃~-70℃仅能保存1年,通常不应在-50℃以上的温度保存。真菌可用特别制备的马铃薯冷冻琼脂制成斜面,培养后至-20℃能保存1年。
1.2.2 固体培养基的试验方法:(1)改良的Miles-Misra法 :将新鲜菌种用蛋白胨水稀释;将试验和对照培养基做成4mm厚的平板并使平板表面干燥;对试验和对照培养基进行系列稀释度接种,每稀释度各取4滴分别加入4个试验和对照培养基;每l滴的涂布超过1/4平板,并用涂布器从高稀释度开始涂布;培养平板并对数量和菌落形态进行评价。
评价方法:生长率 (productivity ratios,PR) =N8/N0,N0=对照培养基的菌落数,N8=试验培养基的菌落数;m和 M:m表示 80%的菌株需要符合的生长率,M表示100%的菌株需要符合的生长率,满意的生长率见表1。
表1 满意的生长率
培养基种类
满意的生长率
非选择性培养基
选择性培养基——目标菌
(包括非常均感的菌株)
m≯0.00001M
(2)划线法 (半定量) :平板如图 l所示,A、B、C区中4条平行线大概相隔
0.5cm,正常情况下,一环从 A区划到D区。
评价方法:接种以后,评定菌落形态、菌落大小、生长强度和计算生长指数G。每条线都表示1个分数。最大分数是 16。如果只生长到线的一半就认为数值是0.5。没有生长或者只有很少量 (少于一半)的生长,分数0。分数加起来得到G。例如,如果生长到 A区,B区,C区的一半,那么生长分数G就是10。目标菌株的生长指数应该至少是6。如果是非选择培养基G。就应该是更高。另外,目标菌株的生长应该是典型的,非目标菌株应该部分或全部被抑制。
(3)定性质控方法:用1ul的接种环在试验培养基表面上划平行线,接种试验微生物。可以在同一个培养基上不交叉地接种几种不同的试验微生物。
评价方法:接种以后的生长情况:0相当于不生长;1相当于弱生长;2相当于强生长。目标微生物的分数应该是 2并且要有典型的特征,大小和菌落形态。非目标微生物的生长应该被部分或全部抑制(0或1)。
1.2.3 液体培养基的试验方法:(1)目标和非目标微生物的定量稀释方法:选择液体培养基 10mL/管待检;目标微生物的接种:将少量的 (如 10~100cfu/管)试验菌株接种到试验和对照肉汤,并混匀;非目标微生物的接种:将大量的 (&l000 cfu/管)试验菌株接种到试验和对照肉汤,并混匀;接种目标和非目标微生物作为混合菌种:为了得到混合菌种在选择培养基上的生长情况,接种少量的 目标微生物 (如 l0~100cfu/管)到试验肉汤和对照肉汤,并且接种更大量 (&1000cfu/管)的非目标微生物到相同的管中,并混匀;每种肉汤接种培养后涂布到非抑制性培养基平板上。
评价方法:计算目标和非目标微生物的菌落数,用 Pr 和Sf 进行结果的解释。
Pr (同前所述):目标微生物的P 应该不小于0.1。
Sf (选择性因子)的计算如下 :Sf=Do-Ds.
这里Do是对照培养基上至少10个菌落的最高稀释度,Ds是试验培养基上至少 l0个菌落的最高稀释度。Sf, Do和Do采用 log10 。为单位来表示。例如:如果 Do 10 =log 4 =4,而 Ds 10-3=log103.0=3,那么选择性因子就是 Sf =1.0。非目标微生物的Sf至少应该是2。
在混合菌种中目标微生物不应被非目标微生物抑制,也就是说目标微生物应该是占多数。
(2)利用OD值评价液体培养基生长率:一种自动微生物生长分析仪 Bioscreen microbialogical growth analyzer(Labsystems Oy,Helsinki,Finland)用于比较试验液体培养基和对照液体培养基培养后微生物的数量,动态测量 OD值,并将数据转换成生长曲线,该OD值与微生物数量有极好的相关性。这种方法不需作系列稀释,并且减少试验材料的需要,是一种便宜、快速和可靠的方法。
2 培养基质量控制标准
2.1 国外培养基质量控制标准 1984年,国际食品微生物学和卫生学委员会培养基工作组 (The International Committee for Food Microbiology and Hygiene,Working Party for Culture Media)(ICFMH,WPCM)提出生物培养基质量控制的标准方案,制定了检验培养基质量的导则和标准,其后又补充了工作组发表过的一些专题论文和试验方法。
美国食品与药品管理局 (FDA)早在80年代就对培养基制造商建立了生产条例。美国国家临床实验室标准委员会培养基质量控制委员会 (The National Committee for Clinical Laboratory Standards,Subcommittee on Media Quality Contro1) (NCCLS)在 1985 年提出并在 1990年通过了导则“M22-A商品微生物培养基质量控制”的标准,1996年修改第二版,2001年修改第三版。
ISO在2000年制定了一份技术规格标准:“ISO/TS 11133-1食品和动物饲料微生物学——制备和生产培养基的导则 第一部分:实验室制备培养基质量控制的一般导则”。2003年又制定了 “ISO/TS11133-2食品和动物饲料微生物学——制备和生产培养基的导则——第二部分:培养基检验规程的应用导则”。
美国药典和欧洲药典均对液体硫乙醇酸盐和胰蛋白胨大豆肉汤两种无菌检查培养基进行促菌生长试验,规定两种培养基在质控菌少量接种 (10—100cfu)的情况下须生长良好。但没有对其它培养基进行质控要求,而且质控要求也不够系统。
2.2 我国培养基质量控制标准 中国微生物学会培养基学组 1990年以来对培养基的原材料和部分商品培养基相继提出了质控标准。我国卫生部 1993年制定了 “食品卫生微生物检验用于燥培养基生产质控和质量标准”;2002年卫生部医政 司参考 NCCLS标准制定了卫生行业标准:“WS/T232-2002商业性微生物培养基质量检验规程”,紧接着2005年中华人民共和国药典规定了对需气菌、厌气菌培养基和真菌培养基3种无菌检查培养基进行促菌生长试验。
我国卫生行业标准 “WS/T232-2002商业性微生物培养基质量检验规程”微生物生长试验为定性结果,结果的判断可操作性需进一步提高。美国国家临床实验室标准委员会制定的 “M22-A商品微生物培养基质量控制”的标准也有类似情况。而 WPCM将培养基的质控结果定量并分为 5个级别,使结果易于判断,因此建立的质控标准应该尽可能定量。2001年加拿大对 Ontario的124个实验室进行考查,得出的结果是大多数实验室不能完全达到 NCCLS标准的要求,表现为一些培养基根本没有进行质控,另外一些问题是:没有采用要求指定的ATCC菌株、培养的温度和时间不适宜、成品培养基没有物理特性的检查记录、大多数实验室没有供应商的控制报告等。因此制定的试验方法在可得出可靠结果的同时,应考虑我国国情,尽量简单易行,如果要求较高的操作技术水平或昂贵的设备,则标准难以普及执行。此外,质控菌株的选用还应侧重考虑我国食品卫生细菌污染的实际状况。质控标准的试验方法均需要对照培养基进行评价,在我国卫生部 1993年制定了 “食品卫生微检验用干燥培养基生产质控和质量标准”中采取 自配的新鲜培养基为对照培养基尚需进一步斟酌,因自配培养基本身不定因素很多,而选用合适的培养基作对照相当关键。
由于食品微培养基品种较多,而国内可参考的资料不多,国外的一些标准起点可能较高,不一定完全适合我国情况,因此标准和试验方法的制定工作量较大,可以参考 ISO标准,将制定标准分为两步,首先制定一般导则,再制定标准和试验方法。ISO标准的一般导则较为系统,从生产商的产品供应到实验室制备、产品使用、产品销毁和最终产品的质量控制等各方面和各环节均作出了详细规定,可作为我国制定微生物培养基质控标准的重要参考。
作者:吴清平 孟凡亚 蔡芷荷 刘秀梅 杨 宁
参 考 文 献
[1]Curtis G D w.International Journal of Food Microbiology,~20.
[2]NCCLS.NCCLS document M22一A2 (ISBN ),).
[3]Otto V.American Journal of Medical Technology,):345—348.
[4]Appendix A.International Journal of Food Microbiology,3~1 36.
[5]The International Organization for Standardizatin.ISO/TS 03.
[6]Johnston M D.Journal of Microbiological Methods,~43.
[7]International Committee on Food Microbiology and Hygiene(1CFMH).Quality Assurance and Quality Comml of Micro— biological Culture Media。1984.
[8]NCCLS.NCCLS document M22一A3(ISBN l~),)
[9]The International Organization for Standardizatin.ISO/TS 1 1 1 33—1,2000.
[10]陈天寿 .微生物培养的制造与应用 .北京:中国农业出版社,.
[11]国家药典委员会 .中华人民共和国药典第三册 .北京:化学工业出版社,2005.附录 73~75.
[12]Zoutman D,Fleming C,Richardson H.Diagnostic Microbi0l0gY and Infecti0us Disease,~34.
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大曲中的微生物及培养条件控制
11:00&&&&&
& 大曲中的微生物主要通过自然接种、富集而构成复杂的微生物菌系。微生物来源主要依靠原料本身、空气、场地及覆盖稻草,也有的在拌料时接种了少量优质曲母,强化了有益菌株。由于丰富的微生物在大曲中进行生长繁殖,分泌产生各种酶类物质,且分解大曲原料形成较多的代谢产物。因此,培养条件对大曲微生物的生长繁殖及分布情况有直接影响。可以说,大曲质量可进一步影响大曲酒的质量和风格。 一、大曲中的微生物及其作用 扳倒井培养的大曲主要为中高温曲,制曲品温最高达到60℃—65℃。通过我们对大曲微生物的分离检测表明,扳倒井大曲是以细菌、霉菌和部分酵母为主的微生物菌系。 1.酵母 扳倒井大曲中的酵母主要为酵母属酵母,其次还有假丝酵母属、汉逊酵母属和球拟酵母属酵母。 1.1&酵母属酵母 生长作用温度为28℃—32℃,pH值在4.5—6.2之间。一般入房两天便可大量生长繁殖了,其后随着品温的上升而死亡或休眠。 1.2&生香酵母 假丝酵母、汉逊酵母等生香酵母,在培菌前期繁殖也较快。特别是假丝酵母,它与拟内孢霉共同存在于大曲表面层,通常呈现为黄色的小斑点。其繁殖代谢产生的芳香物质,使培菌前期的曲坯带有明显的酯香味。由于其所需温度较低,故主要在“低温培菌期”存活繁殖。当大曲进入高温转化期时,就随着其它酵母菌转入休眠或死亡。 生香酵母的生长繁殖、代谢与以下四个因素有关: (1)温度。起始温度28℃—32℃时,生香酵母生长良好。 (2)酸度。适宜的酸度有利于生香酵母产酯。 (3)高湿度。生香酵母在生长繁殖过程中产生大量酯类物质。这一系列生理过程要求培养基中含有一定量的水分。在大曲培养条件下,较高的湿度有利于生香酵母产酯。 (4)微氧。产酯酵母是好氧性微生物,在有氧条件下,产酯能力强;但供氧过量,酵母呼吸作用加强,则消耗大量酒精及糖分,不利于产酯。 1.3&酵母菌的重要作用 酵母菌在发酵酿酒过程中,具有两个十分突出的作用,即酒化和酯化作用。大曲中的酵母属酵母、汉逊酵母能产生活力较强的酒化酶,能将葡萄糖from:中国酒&业新&闻网通过EMP途径代谢转化成酒的主成分——乙醇,这是曲酒最重要也是最基础的物质。 产酯酵母主要是假丝酵母和汉逊酵母,具有较强的酯合成能力,能代谢产生大量的酯类物质,如己酸乙酯等,可赋予大曲酒浓郁的芬芳。 酵母菌代谢还能产生许多物质,如甘油和其它多元醇等,对酒体的完美与丰满有着重要的作用。 2.霉菌 霉菌是大曲中数量种类最多的菌类。其中,以曲霉最多(曲霉中以黄曲霉最多),其次是根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉等。 2.1&曲霉属 曲霉作用于大曲后,可形成糖化力、液化力、蛋白质分解力及多种有机酸。曲霉的最适生长温度为35℃—40℃。 2.2&根霉属 根霉常和毛霉、酵母菌共存。大曲菌丝的生长情况主要看根霉的着生状态,比如大曲断面是否整齐,就是根霉菌丝的健壮与否。 根霉中常见是米根霉。米根霉产乳酸,最适生长温度37℃—41℃,最适发酵温度30℃—35℃,制曲培菌品温不超过38℃,可达到控制米根霉大量生长繁殖的目的。 2.3&毛霉属 与根霉极相似,所需的生长发酵温度也差不多。毛霉主要着生于大曲培养的“低温培菌”期,特别是温高水大,两曲相靠时更易生长。 2.4&青霉属 喜好在低温潮湿的环境中生长。它对大曲中其它有益菌有极大的抑制力。 2.5&红曲菌属 生长温度为26℃—40℃,最适温度为32℃—35℃,pH为3.5—5.0。生长温度范围大,偏酸性。利用糖、酸为碳源。 2.6&霉菌的作用 霉菌生长代谢能产生多种酶。大曲酒酿造主要利用其代谢产生的液化型、糖化型淀粉酶,作为生产发酵中的糖化剂。 能代谢产生淀粉酶的霉菌有:根霉、曲霉、毛霉等。其中尤以根霉、曲霉产生的淀粉酶活力最强,以此为主体的大曲糖化、液化力也较强。大曲生长的霉菌种类和数量受培曲温度的影响。培养温度高,液化力高,糖化力低;培养温度低,液化力低,糖化力高。 霉菌,特别是毛霉,还能产生一种活性较强的蛋白质分解酶。此酶能催化原料中的蛋白质分子水解为朊、胨、多肽,最后分解形成氨基酸。 3.细菌 大曲中的细菌主要为乳酸菌、醋酸菌和枯草芽孢杆菌。 3.1&乳酸菌属 乳酸菌有三个特点:一是既有同型的,又有异型的;二是球菌居多,占70%左右;三是所需温度偏低,在28℃—32℃之间,并具有厌气和好气双重性。 大曲中乳酸含量不可过多,主要生成区域是在高温转化,是由乳酸菌作用于己糖同化成乳酸,其量的大小往往取决于大曲中乳酸菌的数量,及大曲生产发酵时对品温的控制,特别是顶点品温不足,热曲时间短时,会使乳酸大量生成。 3.2&醋酸杆菌属 醋酸杆菌是好气性菌。发酵温度30℃,偏酸环境,量大时会抑制酵母菌的生长和作用。醋酸菌主要是在大曲发酵前、中期生长繁殖,尤其是在新曲中含量最多。醋酸菌有一致命的弱点,即:在干燥低温的环境下,芽孢会失去发芽能力。 3.3&枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌有厌气和好气两种,一般最适生长温度为37℃,适应于微酸、湿度大的环境。初时,大曲中芽孢杆菌不多,但其繁殖速度较快,特别是在大曲的高温、高水分、曲块软的区域繁殖较快,此时,枯草芽孢杆菌得以大量生长。 3.4&细菌的作用 乳酸菌,具有乳酸脱氢酶和乳酸消旋酶,能进行同型和异型乳酸发酵,一般以同型乳酸发酵为主,将葡萄糖经由HDP途径代谢,产生乳酸。 醋酸菌形成的酶具有较强的氧化能力,能利用葡萄糖生产葡萄糖酸,也能氧化乙醇生成乙酸,是发酵酒醅中乙酸的主要产生菌。 芽孢杆菌具有水解淀粉和蛋白质的能力,有的芽孢杆菌能代谢产生酒中的芳香成分双乙酰等。产气杆菌都有较强的V·P反应(乙酰甲基甲醇反应),与酒中2,3—丁二醇、双乙酰等香味物质的生长有关。 二、大曲发酵机理 1.微生物演化过程 微生物变化规律的主要因素是温度、微生物特性及制曲工艺特点。由于制曲前期采用低温培菌,这使得华夏酒报:邮发代号23-189&当地邮局可订阅需氧量大、生长温度低的霉菌和酵母菌在曲侧表层和曲包表层大量繁殖,特别是生长快的根霉。后来,随着微生物有氧呼吸启动所释放出来的多余能量和翻曲垒坯,使品温迅速升高,不再适应霉菌和酵母菌的生长繁殖。这时,霉菌以休眠体(孢子)状态存在,大部分酵母菌衰老死亡。而高温细菌则利用曲坯生成丰富的营养和水分,在曲坯内大量繁殖。 经过高温阶段的培养,最后形成以细菌、霉菌和部分酵母为主的微生物菌系。 2.酸性蛋白酶的生成条件 能生成酸性蛋白酶菌系有霉菌、放线菌和嗜热芽孢杆菌。 2.1&曲霉 由于曲霉的酸性蛋白酶生成量在品温超过35℃—40℃时逐步下降。因此,在制曲的环境中,并不是酸性蛋白酶生成的主要菌种。 2.2&根霉 随着制曲品温的提高,根霉的酸性蛋白酶活力增强。 2.3&放线菌 放线菌不产淀粉酶,但其酸性蛋白酶生成量却随着制曲品温的上升而不断增长。 2.4&嗜热芽孢杆菌 尽管嗜热芽孢杆菌不生成淀粉酶,却有着极强的酸性蛋白酶活力,并随着品温的上升而增长。因此,经较高温度的大曲培养,嗜热芽孢杆菌是产生酸性蛋白酶的主要菌系。 3.“高湿微氧”是制曲要点 高湿微氧环境是大曲内在品质保障的核心。要营造微生物生长的良好环境,就要保持温暖潮湿的曲坯环境,这就要求在低温培菌期的空气流动必须减弱,如此,水分才不至于被迅速带走。环境空气流动弱,微生物生长繁殖消耗氧气并释放二氧化碳,势必会降低曲坯环境中的氧气浓度,形成微氧环境,也就是说,“高湿”造就“微氧环境”。 在微氧环境中,诱导生长繁殖起来的微生物进入酿酒糟醅体系这一微氧环境中,可再度生长繁殖并进行物质变化。因此说,高湿微氧的制曲环境,有利于调节、平衡各种微生物之间的关系,遵循大曲“前缓、中挺,后缓落”的发酵规律,保证大曲质量。 三、发酵过程的控制 大曲发酵的基本要求是“自然富集,开放作业,堆积生温,翻转调节,排潮降温,总温控制”。 由于大曲发酵是敞式发酵,因此,发酵的控制主要依靠对原始条件和环境条件的控制。 1.粉碎的控制 小麦粉碎前应先润料,使麦皮吸一部分水分,有一定延展性。粉碎后,麦皮呈片状,以保证曲坯有一定的通透性,心部呈粉状,可增加微生物的利用面积。粉碎后的麦粉要“烂心不烂皮”,感观以手捏不扎手为宜。 2.曲坯成型控制 加水量以控制曲坯水分在36%—38%为宜,感观以手捏成团而不滴水为准。 曲坯成型后,应在发酵室外晾汗,以曲坯表面不黏手为准,即可入发酵室。 3.入房控制 曲坯入房后,应立即紧闭门窗,保温发酵。随着温度上升,进行控温排潮。 4.发酵中控制 当发酵几天后,品温达到一定程度,曲坯表皮变硬,即可进行第一次翻曲,其时间应准确掌握。 翻第一次曲以温度的高低为主要依据。当发酵正常时,以曲坯品温达到或将要达到温控上限时翻曲为佳。翻曲应注意调整曲坯位置,使整批曲块同步发酵。翻曲后,品温下降幅度应控制在5℃以内。 当温度达到第二个高峰期时,即翻第二次曲,并注意保温,减少排潮次数,控制品温保持在较高水平。当品温下降到一定程度时,应进行“堆烧”,把曲坯堆拢,保温,即做到“中挺”。 中挺时,不但要控制所需的顶点温度,还要持续持久,借以促进微生物的分泌代谢和产物的积累(如形成氨基酸类物),同时还应排去曲室内的水分和二氧化碳,以供给微生物作用所需的充足氧气。高温转化中,除去微生物自身的代谢和生成其它物质外,关键还在于促使原料中蛋白质的分解,以增加曲香,因为蛋白质分解的最佳温度是60℃。 5.发酵后控制 大火期过后,曲坯中大部分水分已被蒸发,品温也逐渐下降。此时应进行最后一次翻曲——“收拢”,即把曲坯紧靠在一起,交错排列,堆至6层—7层,保持品温,使后火“缓落”,将曲坯心部的水分排除,使出房时保证曲坯含水量在15%以下,即可得到优良的成曲。 (来源: - )
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