针对老年痴呆中Aβ42靶点的单链抗体及其分子机制的研究--《吉林大学》2014年博士论文
针对老年痴呆中Aβ42靶点的单链抗体及其分子机制的研究
【摘要】：阿尔茨海默氏症（Alzheimer’s disease, AD）是一种神经退行性疾病，其病理特征是渐进性的Aβ42的聚集与沉积、神经突触丢失和神经纤维缠结，临床表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍。对于AD的发病机理有多种观点，其中普遍认同的是Aβ42毒性学说。现已证明，由β-淀粉样肽（Aβ42）单体聚集形成的Aβ42寡聚体是引起AD的主要致病因子。
有关AD的被动免疫治疗报道中，多数采用的是人源化的多克隆抗体或单克隆抗体，但这些抗体因分子大不易穿过血脑屏障或特异性差易引起副作用而限制了在临床上的应用。为克服这些限制，从构建小分子人源性抗体或抗体片段出发，筛选特异性识别和结合Aβ42寡聚体的单链抗体成为目前诊断或治疗AD的热点。
本论文利用分子生物学和细胞生物学等方法，通过β-淀粉样肽（Aβ42）抗原的构象设计和组装，利用Aβ42寡聚体为抗原特异性筛选，获得抗Aβ42寡聚体的单链抗体（scFv）基因，并表达出该单链抗体。所获得的单链抗体具有Aβ42寡聚体构象靶向性高、分子小、易实现脑转运等突出特点，并显示出了用于治疗和预防老年痴呆症（或称阿尔茨海默氏病，Alzheimer’s disease, AD）的有效性和可行性：（1）分离提取人外周血淋巴细胞，获得外周血淋巴细胞RNA并反转录合成cDNA。采用PCR扩增方法从人外周血淋巴细胞cDNA中获得重链可变区VH及轻链可变区VL，进一步以SOE-PCR方法获得scFv基因。以pET41b为载体，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建单链抗体库。（2）利用Aβ42寡聚体作为抗原筛选阳性克隆，最后获得了四株与抗原有较强结合的阳性克隆。对筛选出的阳性克隆进行序列测定，将所测得的scFv基因序列与GeneBank中的免疫球蛋白基因序列进行比对分析，分析结果显示所获得的四个克隆均为编码scFv的DNA序列，分别包含了编码抗体重链可变区（VH）、轻链可变区（VL）的DNA序列。（3）通过Dot-blot及Western blot方法，证明了获得的单链抗体能够特异性识别Aβ42寡聚体。（4）通过间接ELISA方法，测定单链抗体对Aβ42寡聚体的结合力。结果显示，测得四种单链抗体均可在稀释度为0.625nM仍有结合能力，因此确定四种单链抗体均可在nM级别水平发挥作用。进一步检测了四种单链抗体的亲和力常数KD，由KD值可以看出，获得的单链抗体与Aβ42寡聚体具有较强的亲和力。（5）ThT-F方法和电子显微镜观察等实验方法分析得出获得的单链抗体能够抑制Aβ42的聚集或纤维化、并能够诱导Aβ42聚集体解聚。（6）通过MTT及LDH释放实验分析发现，四种单链抗体能够明显提高细胞存活率，并且其抑制Aβ42寡聚体对细胞的毒性作用呈浓度依赖性。然而，单链抗体对Aβ42单体及纤维抑制作用不显著。进一步分析单链抗体对Aβ42毒性作用的抑制和中和作用。结果显示，四种单链抗体均具有抑制及中和Aβ42寡聚体及原纤维对细胞的毒性作用。并且，四种单链抗体的抑制Aβ42寡聚体及原纤维毒性作用均显著于中和作用。（7）通过应用人脐静脉血管内皮细胞HUVEC及胶质瘤细胞C6进行共培养的方法，建立体外血脑屏障模型，检测单链抗体跨血脑屏障得的转运效率。结果显示，四种单链抗体穿透血脑屏障随时间增长而增加，并且在60min后穿透率达到峰值并呈现稳定。
上述结果为设计和研制免疫预防与治疗老年痴呆（或称阿尔茨海默氏病，AD）的新型小分子抗体药物提供了依据并奠定了基础，作为临床诊断和AD治疗的免疫制剂具有广阔的应用前景。
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：R749.16【目录】：
摘要4-6Abstract6-13第一章 绪论13-29 1. 阿尔茨海默病13 2. 临床症状和神经病理学13-15 3. APP切割及Aβ形成15-16 4. Aβ聚集及神经毒性16-18 5. 遗传因子和风险因子18-20 6. 淀粉样蛋白级联假说20-21 7. AD 的诊断和治疗21 8. 构象依赖性抗体21-22 9. 治疗 AD 的 scFv22-29
9.1 人工scFv23-24
9.2 天然重链抗体24-25
9.3 scFv的脑转运机制25-29第二章 人源性的单链抗体库的构建、鉴定及抗 Aβ42 寡聚体特异性单链抗体的筛选29-47 引言29 2.1 实验材料29-30
2.1.1 质粒载体与菌株29
2.1.2 工具酶及主要试剂29-30
2.1.3 主要仪器30 2.2 方法30-40
2.2.1 外周血淋巴细胞 RNA 提取及反转录合成 cDNA30-31
2.2.2 编码 VH 与 VL 的 DNA 片段扩增31-32
2.2.3 编码 scFv 的 DNA 片段的拼接和扩增32-33
2.2.4 编码 scFv 的 DNA 片段与原核表达载体连接33-34
2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）34
2.2.6 质粒的转化34
2.2.7 阳性克隆的筛选34-35
2.2.8 单链抗体基因的 DNA 序列测定35
2.2.9 单链抗体的诱导表达35
2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）35-36
2.2.11 表达产物的纯化36
2.2.12 蛋白印迹（Western blotting）36-40 2.3 实验结果40-45
2.3.1 人源性单链抗体库的构建40-42
2.3.2 阳性克隆的筛选42-43
2.3.3 单链抗体的表达和制备43-45 本章小结45-47第三章 抗 Aβ42 寡聚体特异性单链抗体的功能研究47-73 引言47 3.1 实验材料47-48
3.1.1 细胞株47
3.1.2 试剂47
3.1.3 主要仪器47-48 3.2 实验方法48-55
3.2.1 细胞培养48-50
3.2.2 Dot-blot 检测单链抗体与 Aβ42 寡聚体的结合特异性50
3.2.3 Western blot 检测单链抗体对 Aβ42 寡聚体的识别50
3.2.4 单链抗体对 Aβ42 寡聚体结合力的检测50-51
3.2.5 单链抗体亲和力常数的测定51-52
3.2.6 单链抗体对 Aβ42 聚集的抑制作用52
3.2.7 透射电镜观察单链抗体对 Aβ42 聚集过程及聚集体形态的变化的影响52
3.2.8 四唑盐（MTT）法检测单链抗体抑制 Aβ42 对细胞的毒性作用52-53
3.2.9 单链抗体对 Aβ42 细胞毒性的抑制和中和作用53
3.2.10 LDH 法检测单链抗体抑制 Aβ42 对细胞的毒性作用53-54
3.2.11 体外血脑屏障模型建立及单链抗体穿透血脑屏障的检测54-55 3.3 实验结果55-72
3.3.1 Dot-blot 检测四种单链抗体与 Aβ42 寡聚体的结合特异性的分析55
3.3.2 Western blot 检测单链抗体对 Aβ42 寡聚体识别的分析55-57
3.3.3 单链抗体对 Aβ42 寡聚体结合力的检测57
3.3.4 单链抗体亲和力的测定57-59
3.3.5 单链抗体对 Aβ42 聚集抑制作用的分析59-60
3.3.6 单链抗体对 Aβ42 聚集抑制作用的形态学分析60-61
3.3.7 单链抗体抑制 Aβ42 对细胞的毒性作用61-65
3.3.8 单链抗体对 Aβ42 细胞毒性的抑制和中和作用分析65-69
3.3.9 单链抗体抑制 Aβ42 毒性作用的细胞形态学分析69-70
3.3.10 单链抗体跨体外血脑屏障模型效应的分析70-72 本章小结72-73讨论73-78全文总结78-79参考文献79-91作者简介91博士期间发表的学术论文及其他科研成果91-93致谢93
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血脑屏障及药物通过血脑屏障方法研究进展
来源：青年人()&更新时间： 15:44:46 &【字体： 】
摘　要：目的：介绍血脑屏障及药物通过血脑屏障的方法，为研制透过血脑屏障药物和临床合理应用中枢神经系统疾病治疗药物提供参考。方法：根据最近的中外文献中有关血脑屏障定义、组成、结构研究及药物通过血脑屏障方法的研究。结果：血脑屏障是一保护性屏障，但并非不可开启，目前大约有10多种方法可以可逆性开放血脑屏障，使药物透过率增加。结论：根据药物性质和种类情况的不同可选用不同的开启血脑屏障方法以提高药物疗效，同时也可根据某些方法开启血脑屏障的机制开发新的复方制剂。关键词：血脑屏障；药物▲
　　血脑屏障是在脑和脊髓内的毛细血管与神经组织之间存在的一个调节界面(regulatory interface)。研究认为这个界面不单纯是被动保护性屏障，还能选择地将脑内有害或过剩物质泵出脑外，保持脑的内环境恒定。血脑屏障包括：①血-脑脊液屏障(简称BLB)；②脑脊液-脑屏障(简称LBB)；③血-脑屏障(简称BBB)；④脑脊液-脑肿瘤屏障和脑脊液-淋巴屏障等［1～3］。　　研究发现，BBB有3层结构：脑毛细血管内皮细胞(BMECs)、基膜和胶质细胞足突。构成屏障作用的主要是BMECs，其功能、形态特色：BMECs膜上无孔，细胞间有闭锁小带，细胞吞饮泡很少，细胞内含有丰富的酶系统，但缺乏收缩蛋白。BBB按作用方式分为：机械屏障、酶屏障［1］。
1　物质通过BBB的方式
　　物质透过BBB主要有4条途径：小分子直接经细胞间隙扩散；脂溶性分子的融膜扩散；特异受体介导的吞饮；特异载体通道和酶系统的激活。
1.1　被动扩散
　　也称简单扩散，脂溶性小分子药物可以通过被动扩散通过BBB入脑。由于BBB是一类脂质膜，脑毛细血管内皮细胞的“有效”孔径为1.4～1.8 nm。凡小分子药物其直径小于1.8 nm者均可通过BBB，而这些可以透过BBB的小分子药物在性质上至少有部分的脂溶性，因此决定小分子药物是否通过BBB的主要因素是生理pH值(7.4)时其脂肪/水的分布系数及电离常数。大多数碱性的脂溶性药物很容易进入脑内，具有这类特性的药物有：强效镇痛剂、苯噻嗪类、三环抗抑郁剂以及一些抗胆碱和抗组织胺类药物。另外，许多挥发性麻醉药如环丙烷和氧化亚氮以及静脉麻醉药硫喷妥钠等，均可非常迅速地进入脑内。β受体阻断剂普萘洛尔在脑内的浓度也较高，而季铵类化合物和胍乙啶在生理的pH值下，具有较高的解离度，而未解离药物的脂/水分布系数又很低，故不易透过BBB。　　电解度影响药物被动扩散的机制是由于脑毛细血管内皮细胞间的紧密接合含有带负电荷的胶质。血管对脑来说电位又较高，故对离子的扩散具有一定的阻挡作用。根据同性电荷相斥、异性电荷相吸的原则，带正电荷的碱性药物或电中性的药物比带负电荷药物易透过BBB。在生理pH值时，呈弱阴性的磺胺类药如SD就比呈阴性的SM2，SM′2，SIZ，SMZ等易通过BBB。　　被动扩散的机制也有人用pH梯度学说来解释，pH梯度学说认为：血液与脑脊液(CSF)的pH存在差异，健康人血液pH为7.4，CSF为7.32∶1，两者之差0.08即构成血脑间的pH梯度。Milne等认为，一般药物是被动地以非离子扩散形式进入脑内的，由于不解离的分子是亲脂的又不带电荷，故易于通过类脂膜进入脑内，离子则相反，因此决定药物在血脑间分布的动力乃是两侧分子浓度差，当这两侧的pH不同时，可根据Henderson-Hasselbalch方程式(简称H-H方法)。　　　　注：antilog是反对数，pKa为酸解常数的负对数，其意义是当药物50%解离时的pH。　　从H-H方程不难理解弱碱类药物在pH值越高或弱酸类药物在pH值越低的条件下，其解离度越小易通过BBB，弱碱类在pH值越低或弱酸类在pH值越高条件下，其解离度越大，难通过BBB。　　众所周知蛋白质是难以通过BBB的，所以凡是与蛋白质结合的药物都不能通过BBB，但近期的研究表明［4～6］，药物蛋白质结合率和BBB转运之间没有直接的关系。一些与蛋白质结合的激素和药物能有较高的脑摄入指数，其机制认为可能是药物-蛋白质复合物可在脑微血管中的解离增加［7］，所以不能单纯以未结合的药物浓度来推测药物的脑转运。
1.2　特殊转运
　　包括易化扩散和主动转运。特殊转运必须先与屏障界面中的载体或酶系统形成复合物，然后再将复合物从血转运入脑或从脑内转运入血，在转运释放药物的瞬间复合物即开始解离。易化扩散和主动转运的共同特点是①需要载体和酶系统参与：由于载体和酶系统有一定的数量和活力，所以当药物浓度达到一定高度时血脑间的转运即趋于饱和和达到极限。②有竞争性：由于载体对药物有特异的选择性，转运能力有一定限度，如果两结构相似的药物均由载体转运，则存在竞争性抑制作用。例如3-O-甲基葡萄糖和右旋葡萄糖结构相似，在通过BBB时，前者可抑制后者的通过。③有专一性：载体有明显的立体结构的特异性，能专一性地和相应药物结合。例如载体转运葡萄糖通过BBB时，右旋体比左旋体快；而亮氨酸的左旋体却比右旋体快。1.2.1　易化扩散：又名中介转运。它除上述特点外，与主动转运的区别是顺浓度差转运，不需消耗能量。其机制是通过镶嵌在BBB界面上的蛋白载体或离子通道来进行的。由于BBB“紧密结合”的结构特点，很少有收缩蛋白，从而限制了膜的活动性，所以在中枢神经系统(CNS)易化扩散转运药物的活跃程度较外周弱。1.2.2　主动转运是一类需要能量和载体蛋白参与的逆浓度差和逆电化学梯度的特殊转运方式。在电镜下发现，脑毛细血管内皮细胞中有较丰富的线粒体，其数量是骨骼肌细胞的5倍，这样有可能为主动转运系统提供足够的能源。　　BBB的主动转运过程与分泌活动也有密切关系。表现在血-脑、血-CSF，脑-CSF之间有活跃的质子泵活动。当CSF分泌增加时，离子泵转运就可增加；反之，当离子泵抑制时，CSF生成也就减少。离子泵这种活动，一方面可将药物主动内输入脑，同时也可将药物主动由脑逆回血流。如青霉素的被主动转运可被丙磺舒抑制，在流脑时服用足量的丙磺舒，不仅可减少青霉素在肾小管的分泌排泄，而且也可大大提高血浆和CSF中的有效浓度。1.2.3　BBB载体运送大致有下列几种系统：①己糖载体：是易化扩散型的，转运葡萄糖及其类似物，如2-脱氧-d-葡萄糖、甘露醇、半乳糖等。葡萄糖透过BBB的速率是每克脑组织1.9 μmol。min-1。因脑解剖部位的不同，局部葡萄糖需要量及血流量不同，此载体的动力学特性也不同。②一羧基载体：主动转运乳酸、丙酮酸和酮体。③氨基酸载体：一般来说，一部分必需氨基酸是通过载体运送方式透过BBB，而一些非必需氨基酸(除苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和色氨酸外)则不经过高摄取载体运送［1］。氨基酸载体又分为(a)大分子中性氨基酸系统(LNAA)，或称亮氨酸系统：运送多种氨基酸，但对大分子氨基酸优先。(b)丙氨酸优先系统：仅存在于BBB的腔面。(c)必需氨基酸系统：转运精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸。④胺类载体：转运胆碱及其类似物。⑤嘌呤化合物载体：对腺嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤具有不同的亲和力和运送能力。⑥其它：据报道BBB还存在硫胺载体、运送甲状腺激素的载体以及运送肌醇的载体［8］。
1.3　酶屏障
　　经组织化学研究表明，位于脑血管内皮细胞中的部分酶系统可使某些药物降解转化，构成所谓酶屏障，阻止相应药物入脑，如多巴脱羧酶、单胺氧化酶、γ-氨基丁酸(GABA)转氨酶等。前者使L-多巴或L-5羟色氨酸分别脱羧生成L-多巴胺及L-5羟色胺。然后再被单胺氧化酶降解。后者阻止γ-氨基丁酸和其它某些氨基酸透过BBB。治疗帕金森病时使用多巴胺加外周的脱羧酶抑制剂是基于上述原因的。　　由于单胺氧化酶的降解，肾上腺类药物也不易通过BBB。
1.4　脑特殊区域的药物转运
　　蛋白质、大分子药物以及各种染料，由于脑毛细血管内皮的屏障功能而不易透过BBB。但CNS的毛细血管并非全部都有“紧密接合”的内皮细胞层，少数区域的接合疏松，呈网络样。其特点为血窦多，窦外无胶质突，仅有嗜银网状纤维包裹，毛细血管内皮有小孔，基膜不连续并与邻近胶质突分开，有较大的通透性，称之为“脑的特殊区”。它包括脑极后区(Area Postrema)、下丘脑正中隆起，松果体、后联合下器官(sub-commissural organ)、垂体后叶、脉络丛等。在这些特殊区域可允许某些大分子化合物，如激素和一些毒物少量进入，这可能具有它特殊的生物学意义。例如，在血中毒物浓度增高时，可影响到接近呕吐中枢和催吐化学感受区的延脑极后区，在必要时可以呕吐的方式排出毒物。
2　促进药物通过BBB方法
　　要使药物在脑组织中发挥作用，首先药物必须能够透过或绕过BBB，并在脑细胞外液达到有效的浓度。BBB限制了许多药物进入脑实质，研究药物通过BBB的方法十分重要。
2.1　鞘内或脑室穿刺直接给药
　　此法使药物不经过BBB，直接将药物注射于脑内，效果是肯定的。但由于技术操作要求较高，又容易感染，限制了此法的应用。
2.2　皮下植入贮器法
　　Ommaya提出一种皮下植入贮器(Ommaya reservoir)的方法以增高药物脑浓度，贮器与侧脑室一侧相连，但由于这种技术外科手术复杂，又有感染的危险，没有被广泛地应用，目前仅用于化疗药物［9］。另外有人发明一种可生物降解的供内植的聚合物，它可被直接植入到大脑中，给患者持续的药物释放。222个恶性脑瘤复发的患者，外科手术切除肿瘤后，把含卡氮芥(每次最大量62 mg)的聚合物圆片和安慰剂圆片植入肿瘤部位，结果卡氮芥组的存活期明显延长(从23周到31周)。
2.3　利用鼻腔输送治疗脑部疾病的药物
　　美国明尼苏达州瑞金斯医院的研究人员发现，由于人体嗅觉系统中提供了大脑与外部世界的直接联系，因此利用鼻腔、采用滴鼻剂的方式，可有效地解决药物的输送问题。研究人员对12只鼠实施麻醉后，在其中6只鼠的鼻腔内滴NGF(神经生长因子)0.5 h，另6只鼠通过注射方式输入NGF，不到1 h，采用鼻滴方式鼠的脑海马区、扁桃体区及其它与嗅觉非常相关的区域都发现了NGF。与此相反，采用后一种方式鼠脑内NGF含量极少。研究人员又用“胰岛素生长因子Ⅰ”进行实验，获得相同结果。
2.4　利用具有芳香开窍作用的中药开启血脑屏障
　　中药薄荷、冰片具芳香开窍作用，可提高BBB通透性。大庆市第二医院杨加文在用利福平等治疗结核性脑膜炎时，加用冰片0.2 g内服。经急性期和恢复期标本采集测定表明，实验组如用冰片后，使脑脊液中利福平浓度明显升高，特别是在结核性脑膜炎恢复期炎症好转，血脑屏障重新建立的情况下，利福平仍能透过BBB并保持较高的浓度。广东医学院的徐伟等［10］的研究表明：薄荷醇滴注10%薄荷醇石蜡油液15 ml。kg-1)及冰片(滴注10%冰片石蜡油液15 ml。kg-1)可明显延长磺胺嘧啶在大鼠体内分布相半衰期，增加磺胺嘧啶在大鼠脑内的浓度。
2.5　利用高渗透性开放BBB
　　能形成高渗压开放BBB的物质有：甘露醇、阿拉伯糖、尿素、果糖、乳酰胺、甘油等。Rapoport等［11］发现BBB的开放及药物转运的增加主要取决于高渗溶液的浓度、注射时间和速度，并且这种开放是有时间性和可逆性的。但若高渗溶液浓度过高，则会损害大脑［12］。
2.6　血管活性物质开放BBB
　　Cross［13］研究了组胺对BBB的影响。组胺经颅内动脉注射后，检测了同位素标记的蔗糖从脑血管向脑的转运率明显增加，且增加呈剂量依赖性，在2 h内可逆。机制是通过胞饮实现。RMP-7是一种缓激肽酶激动剂，它能通过激活内皮细胞上的β2受体而使BBB安全有效地开放。Sanovich［14］的研究表明，RMP-7开放BBB是短暂的和可逆的，停止用药数分钟，BBB的屏障功能恢复正常，RMP-7在较低浓度(＜17 nmol。L-1)即能开放BBB，开放程度与剂量相关。RMR-7可增加水溶性物质如右旋糖酐和carbopation的通透性，而不增加脂溶性物质如BCNU的通透性。另外，在病理状态下，白三烯X4能开放BBB，但只能让小分子通过，这提示BBB的开放是经闭锁小带分开所致。
2.7　细菌葡萄糖肽开放BBB
　　细菌葡萄糖肽是细菌细胞壁的一种成分，脑膜炎时，存在于蛛网膜下腔的细菌葡萄糖肽可引起BBB通透性增高。这种葡萄糖肽经静脉注射，亦可引起兔的BBB通透性依赖于时间和剂量的可逆性增高，从而增加青霉素和MPI的造影剂透过BBB进入脑实质。Spellerberg［15］研究表明，细菌葡萄糖肽开放BBB是通过增加跨细胞转运实现的，而不是使内皮细胞的紧密连接疏松，因此只能使相对分子质量小的物质通透性增加，而限制了较相对分子质量大的物质通透。
2.8　抗菌抗体开放BBB
　　百日咳杆菌的丝状血凝素(FHA)是一种220000的无纤毛的表面蛋白。Tuomanen等［16］的实验表明，抗FHA单克隆抗体能诱导与剂量相关的可逆性BBB通透性增加，并且通过静脉给药途径，增加治疗性药物进入脑实质。静脉注射这种抗体4～5 h内，BBB通透性增加，超过这个时间则BBB的完整性重新恢复，BBB的开放只维持1～2 h。抗FHA抗体开放BBB的明确机制还不清楚，可能因为抗FHA抗体与存在于血管内皮上的CR3配体存着相似性，这种抗体与内皮上的配体相似作用，从而导致内皮细胞间的紧密连接得到疏松。
2.9　油酸开放BBB
　　Sztriha［17］研究表明，10-6 mol。L-1的油酸从颈内动脉注射后，BBB通透性无改变，10-5 mol。L-1浓度注射后，可使注射大脑半球伊文思蓝的浓度成10倍的增加，且在90 min后，BBB通透性恢复正常。因此，油酸开放BBB是可逆的，且存在剂量依赖性。油酸引起BBB通透性的改变可能是由于脂与膜之间相互作用的结果。
2.10　改变药物的化学结构
　　制成前药或使用化学传运系统，这是增加CNS药物转运常用的一种方法。通过改变药物的化学结构，制成前药或使用化学传运系统，以改变其生理-生化特性。根据不同的情况，又分以下几种。2.10.1　将药物载于趋脑性前体脂质体中透过BBB　脂质体当以静脉注射的方式给予机体时，将选择性浓集于机体的某组织如肝脏网状内皮系统的吞噬细胞、肾、骨髓、体循环中的巨噬细胞等。王江雁等［18］选用特异性趋向脑组织的脂质体包裹青霉素，然后静脉注射于新西兰白兔中，结果注射脂质体包裹青霉素后，脑脊液和脑组织中青霉素含量较对照组分别增加230.4%和203.7%，二组间差异极显著。2.10.2　利用化学传运系统(chemical delivery system，CDS)运载药物透过BBB　化学传运系统是一种能载送药物通过生物屏障，经过两次或多次生物转运在活性部位释放药物的药物运输联合体，其基础是二氢吡啶与吡啶盐的氧化还原体系。在该体系中，药物与烟酸结合体(D-Q+)先被还原成极性小的二氢吡啶复合物(D-CDS)。给药后在脑内和全身分布，D-CDS先氧化成D-Q+在外周很快被代谢，而在CNS，D-Q+被滞留，作为药源需缓慢释放药物［19］。可以利用BBB独特的结构设计向CNS的CDS：首先，它必须有足够的亲脂性以易被脑摄取；再者，其分子必须在酶的催化或经其它转换后久留CNS，但同时还要加速其外周消除；最后，停留于CNS的中间产物必须能降解而释放出久留的活性化合物。2.10.3　改变药物的化学结构制成前药(prodrug)　为了能使具有-OH，-NH2，-COOH结构的药物进入CNS，可采用酯化、酰胺化、氨甲基化、醚化、环化/开环化等化学方式进行修饰，以增加其亲脂性而更易透过BBB；一旦进入CNS，其亲脂性基团被水解而释放出有活性药物。但是，简单的前药仍受到某些重要条件限制，如在增加脂溶性而改善透过BBB的同时，也增加了被其它组织的摄取，这种无选择性的运送作用强大的药物(如细胞毒药物)引起非靶向部位毒性的不利因素；又如增加药物的亲脂性，既使它易入CNS，但外溢也增多而不能久留，生物活性消失迅速；最后，前药可由一种途径转变为有作用的药物，亦可能有其它转化途径使它产生有毒性的物质。因此，将活性药物制成前药也要考虑周全。
2.11　利用多药耐药性(MDR)逆转剂提高脑内药物转运
　　研究表明，人脑内存在物质外排系统，如丙磺舒敏感的阴离子外排系统，特别是近年来发现存在于脑毛细血管内皮细胞膜上的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)，其结构与肿瘤细胞上的P-gp类似，具有ATP依赖性的药物外排泵的功能。P-gp是Juliano和Ling等首先发现的，是与多药耐药性(multidrug resistance,MDR)密切相关的糖蛋白，相对分子质量为170000，是MDR基因表达的产物。脑毛细血管内皮细胞上的P-gp主要特征是：一是P-gp对底物作用的特异性低，易与多种底物结合。二是P-gp的外排功能是ATP依赖性的。三是两种底物可以与P-gp竞争性的结合。因此，当有两个亲和力不同的底物同时存在时，亲和力大的底物易与P-gp结合后被泵出细胞膜外，亲和力小的底物与P-gp结合的少，在细胞内容易蓄积。P-gp的底物称作MDR逆转剂。目前发现MDR逆转剂多为生物碱或天然产物，如环孢菌素、利血平、长春新碱、阿霉素等，钙离子拮抗剂和钙调蛋白如维拉帕米、尼莫地平、硝苯地平等，还有内源性的甾体类物质如孕酮、睾酮等。　　利用MDR逆转剂可以改变脑内药物的浓度。Tsuji等［20］用牛脑微血管内皮细胞培养液在37℃pH为7.4时，长春新碱(vincristine,VCR)在牛脑微血管内皮细胞上的累积呈时间依赖性的摄取，在60 min达到稳态。当有MDR逆转剂维拉帕米时，牛脑微血管内皮细胞对VCR的摄取显著增加，而且当维拉帕米的浓度从5 μmol。L-1到50 μmol。L-1时，牛脑微血管内皮细胞对VCR的吸收呈剂量依赖性的增加，如果加入其它MDR逆转剂如奎尼丁、氯丙嗪、甾体激素时，也能使牛脑微血管内皮细胞对VCR的摄取增加。　　脑毛细血管内皮细胞上的P-gp是ATP依赖性的，降低脑内ATP的含量能够改变脑内细胞膜上P-gp的外排功能。Sakata等［21］采用四动脉结扎法造成大鼠短暂性的前脑缺血模型，使大鼠脑内的ATP含量降低，结果与对照组比较环孢菌素A在脑内的通透性增加了2.7倍。　　MDR逆转剂不仅可以增加脑内的药物浓度，而且还可以改变药物在脑内的药物动力学参数。Sanderine等［22］用大鼠研究了P-gp抑制剂SDZ PSC833对秋水仙素的药动学的影响。结果发现秋水仙素在大鼠脑内的通透性增加了10倍。环孢菌素A与依托泊苷合用后，依托泊苷的AUC增加了80%。t1/2延长了2倍，清除率减少了46%。同时依托泊苷的不良反应也增加。这可能是环孢菌素A抑制了血脑屏障上的P-gp的功能使依托泊苷在脑内的浓度增加。Wang等［23］用微透析的方法研究了环孢菌素对罗丹明-123在脑内的药动学特征影响，结果表明合用后罗丹明-123在脑内的AUC增加了3倍，而血浆中的AUC几乎没有改变。因此在药物制剂方面，可以采用复方制剂提高药物通过血脑屏障的转运，增加脑内的药物浓度，提高药物的生物利用度。■
作者单位：赵志刚（北京100050北京天坛医院临床药理室）　　　　　　龚凌志（北京100050北京天坛医院临床药理室）
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