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你可能喜欢自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下：A.制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。B.为了得到更加准确的结果，你选用_____ (稀释混合平板法、稀释涂布平板法)接种样品。C.适宜温度下培养。结果分析：（1）测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是_____ A.一个平板，统计的菌落数是23B.两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24C.三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26D.四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25（2）一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL)_____ 。（3）用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量_____ （1分），因为_____ _____ 。（4）某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？_____ （1分），为什么？_____ 。
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自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下：A.制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。B.为了得到更加准确的结果，你选用_____ (稀释混合平板法、稀释涂布平板法)接种样品。C.适宜温度下培养。结果分析：（1）测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是_____ A.一个平板，统计的菌落数是23B.两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24C.三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26D.四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25（2）一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL)_____ 。（3）用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量_____ （1分），因为_____ _____ 。（4）某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？_____ （1分），为什么？_____ 。
自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下：A.制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。B.为了得到更加准确的结果，你选用_____ (稀释混合平板法、稀释涂布平板法)接种样品。C.适宜温度下培养。结果分析：（1）测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是_____ A.一个平板，统计的菌落数是23B.两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24C.三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26D.四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25（2）一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL)_____ 。（3）用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量_____ （1分），因为_____ _____ 。（4）某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？_____ （1分），为什么？_____ 。
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你可能喜欢医学免疫学实验技术
医学免疫学实验技术
免疫血清的制备
抗体的制备大致包括三个阶段，即抗原的制备与纯化、动物免疫和血清分离纯化与鉴定。抗原是制备抗体的先决条件，要制备高质量的抗体，必须首先获得特异性高的抗原性物质。抗体制备的方案视抗原的性质不同而异。
【目的要求】
【实验原理】&
用抗原刺激机体可以使机体产生抗体，抗原与抗体是一对概念，抗原的纯度和活性
，影响着其免疫动物后获得的抗体的特异性和滴度。根据抗体产生的一般规律，视抗原的性质选择不同的途径免疫动物，经初次、再次免疫的过程，使得动物血清中产生足量的特异性抗体，继而分离血清并纯化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗体。&&&
【器材试剂】
细菌菌种(伤寒沙门菌O901)、混合人全血清、健康家兔。
①福氏不完全佐剂：称取羊毛脂5g，逐滴加入石蜡油20ml（羊毛脂:石蜡油可为1:1～1:4），高压灭菌后4℃保存备用。②福氏完全佐剂：于不完全佐剂中加入卡介苗2～20mg/ml，研钵中研磨乳化后即为完全佐剂，冰箱保存备用。
【方法步骤】
伤寒沙门菌O抗原的免疫方案
获得的免疫血清需要进行特异性检测、亲和力测定和效价滴定。针对颗粒性抗原的免疫血清效价，可通过凝集或溶细胞试验（如溶血素效价滴定）检测。可溶性抗原相应抗体的效价和纯度多选用环状沉淀、琼脂扩散和免疫电泳的方法检测。酶免疫测定、放射免疫分析及平衡透析等方法，可用于抗体的特异性和亲和力测定。抗血清鉴定的方法详见后述相应实验。
更加精细的免疫试验需要从抗血清中提取免疫球蛋白，此过程称为抗血清的纯化。纯化的步骤为：50%饱和硫酸铵盐析以沉淀血清球蛋白，应用透析或分子筛法除盐。除盐后的球蛋白过阴离子交换柱（DEAE-纤维素），根据不同类别免疫球蛋白的等电点，选用不同pH和离子强度的缓冲液分别洗脱之；高渗或风于法浓缩免疫球蛋白，若使用冷冻干燥器则可获得干燥制品。
抗体的保存以浓度20～30mg/ml为宜，加入万分之一的硫柳汞或千分之一的叠氮钠防腐，并加入等量的中性甘油，分装小瓶，—
【结果分析】
【注意事项】
免疫血清的制备多选用家兔为免疫对象，若系大量制备或二抗种属特异性的需要，也可选用羊或马。应用的动物必须健康，且以雄性为佳。为了避免个体差异，每种抗原最好免疫3只以上动物。
全血清抗愿应该选择3人以上混合血清，以避免个体差异性；血清应新鲜，以保持血清中各成分的活性。在细菌性抗原制备过程中，应严格无菌操作，保证其纯度和避免对实验者的感染。
佐剂应用于可溶性抗原的免疫，颗粒性抗原的免疫无需佐剂。佐剂与抗原混合研磨时，应充分乳化，否则难以达到预期的免疫效果。在使用佐剂-抗原时，若难以吸入注射器，则可将连同装有佐剂的容器置热水上加热，并选用较粗的注射针头。注射完毕后，剩余佐剂-抗原置4保存。
4．免疫程序并非固定不变，一般而言，不与佐剂一同免疫的抗原，免疫间隔时间较短，可每隔2～3天免疫一次。由于佐剂具有缓释作用，于佐剂一起免疫的抗原可隔1～2周。无论有无佐剂，最后一次免疫一周后采取血清。加强免疫的剂量一般为首次剂量的1/5～2/5。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫；若欲得到高效价的抗血清，则宜采用大剂量抗原长程免疫。由于免疫期限及间隔时间较长，要注意脱敏，尤其在进行静脉免疫时。脱敏的原则是少量多次注射抗原，例如，在静脉注入抗原前，先将抗原少量注入腹腔，lh后再作缓慢静脉注射。&
实验二& 凝集反应
agglutinogenagglutinin①②
凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。
通过以下实验的实践，掌握各种凝集反应的原理，熟悉方法步骤、结果判断以及注意事项。
一& 直接凝集反应
agglutination
slide agglutination test11ABO
2& 7108/mlO
试管凝集试验（tube
agglutination test）为半定量试验，在微生物学检验中常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价（titer），亦称为滴度。在试验中，由于电解质浓度和pH不适当等原因，可引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。
临床上常用的直接试管凝集试验为肥达试验（Widal test）和外斐试验（Weil-Felix test）。在输血时也常用于受体和供体两者的红细胞和血清的交互配血试验。
&&& indirect agglutinationpassive agglutination
hem agglutination testindirect hem agglutination test21
【器材试剂】
图2－2& 血凝反应强度示意图
－：红细胞沉积于管底；
＋：红细胞沉积于管底，周围有散在少量凝集；
＋＋：红细胞形成层凝集，面积较小，边缘较松散；
＋＋＋：红细胞形成片层凝集，面积略多于＋＋；
＋＋＋＋：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘皱缩如花边状
reverse indirect hem agglutination test23HBsAg
11:20-HBs1:20-HBs
3V0.02540/ml
1V840/ml10.025ml
20.025ml107890.025mlHBsAg
30.025ml21
412min371h
HbsAg&1:16
& 80.025ml22780.025ml1:20-HBs0.025ml12min3730min0.025ml371h
24indirect agglutination
inhibition testHCGpreg-
nancy testing
3SPASPACowan
I371824hPBS3000r/min30minPBS20.5%0.01mol/LPBS10%6h5630minPBS30.05%0.1%NaN3PBS10%4
4SPA& SPAPBS1PBS2%PBS1:81:62%SPA3730min43000r/min30minPBS20.05%0.1%NaN32%41
113121SPA31
【目的要求】
precipitation
【器材试剂】
&&& 3& 1.5~3mm
&&& 【方法步骤】
&&& 2120.4ml30.4ml
&&& 3130.2ml20.2ml
&&& 【结果分析】
【注意事项】
2&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&
【目的要求】
【实验原理】&
&【器材试剂】
&2& IgG15g/L
&&【方法步骤】
1& 15g/L4.5ml ,
2& 3mm4 ~ 5mm6
3& IgG142356
4& 5mol/L371~2d24h48h
【结果分析】
【注意事项】
【目的要】求
【实验原理】
&&【器材试剂】
1& IgG10mg/ml
2& IgG16015g/L
【方法步骤】
1& 59ml56℃IgG1ml56℃IgG160
3& 3.5mm10~12mm
10.5ml 1101161、1∶32、1∶40，分别加入另一套孔中，每孔中加10μl，用于制备标准曲线。
将加样完毕的琼脂放于湿盒中，置室温或37℃ 24h后观察结果。
以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标，相应孔中IgG含量为纵坐标，在半数纸上绘制标准曲线。
【结果分析】
2IgGIgAIgM
【注意事项】
【目的要求】
【实验原理】
IgG30~90min
【器材试剂】
2& AFPpH8.6& 0.05mol/L15g/LpH8.6& 0.05mol/L
【方法步骤】
4& 0.05mol/L PH8.62/32.5~3.5mA/cm30~90min
【结果分析】
【注意事项】
【目的要求】
&&& 【器材试剂】
&&& 2& AFPpH8.6& 0.05molL
&&& 【方法步骤】
&&& 1pH8.6& 0.05molL1.5g100ml
&&& 256(56)AFP130
&&& 3(5mm)3mm68mm
&&& 4510204080
&&& 5pH8.6& 0.05molL2324mAcm12h
&&& 610gL10
&&& 【结果分析】
&&& 50.3gm1
&&& 【注意事项】&&
4pH8.6IgGIgApH8.6IgGIgA0.3630minpH8.6
【目的要求】
【实验原理】
(immunoeletrophoresisIEP)
&&& 【器材试剂】
&&& 1& IgG
&&& 2& pH8.6 &0.05molL12gL&&& (0.5g10B 0.1g20ml)
&&& 3& 373mm
&&& 【方法步骤】
&&& 1& 4ml1.5mm3mm(10l)1.52mm
&&& 2& IgG10l
&&& 3& 24mAcm1.0cm(1.5h)
&&& 4& 3724h
&【结果分析】
&&& 1(Alb)IgG
()1040gL10min
&&& 32448h232h371020min
&&& 【注意事项】
【目的要求】
【实验原理】
&&& & (A)IgGIgGIgGAIgG
&&& 【器材试剂】&&&
&&& 1& ()IgG(IgG)
&&& 2& IgGPEG& (PEG 60008000& 4.0gNaF 1.0gNaHPO412H2O 10.15gNaH2PO42H2O 1.0gNaN3& 0.1g100ml)
&&& 3& (721731)
&&& 【方法步骤】
&&& 1& IgGIgG5.5gL11.0gL22.0gL44.0gL()IgG10l410l5
&&& 2& 110(0.1ml+0.9ml)10l
&&& 3& PEGIgG
&&& 4& 37& 30min
&&& 5& 340nm& A
&&& 【结果分析】
&&& 14IgGAIgGIgGIgG
&&& &&& &&&&&&&&&&1&&& &&&&2&&& &&&&&3&&& &&&&4
&&& IgG(gL)& &&5.5&&& &&11. 0&&& &&22.0&&& &44.0
A&&& &&&&&&&&&0.04&&& &0.08&&& &&&0.14&&& &0.26
&&& A&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&0.10
(0.100.08)+11.014.7(g/L)
&&& 3IgG& 8.016.0 gLIgGIgG5.0gLIgG()
&&& 45101h
&&& 【注意事项】
&&& 2PEGPEG&&& 20gL40gL&&& &50gLPEG
实验四& 补体参与的反应
通过以下补体参与的各项实验的操作，要掌握各项实验的基本原理，熟悉操作步骤、结果判断及注意事项；还要进一步增加对补体生物活性的感性认识，
一& 血清总补体溶血活性（CH50）测定
307050CH5050C1
1BBpH7.42000ml& NaCl 85g5.75g3.75gMgCl2 1.017gCaCl2 0.166g2000ml41:5
22SRBC& Alsever4310NS2000rpm5min2500rpm10minSRBCBB22SRBC0.2mlBB5ml0.5cm721542nmT40
3SRBC& BB21:40001:2000
11:20&& 2hBB1:20
250&& 2SRBC2ml8mlSRBC1002.5mlBB2.5ml50
3101231041
50721542nmTmlU/ml
50100U/mlReiterCH50
1、待测标本应无溶血、无污染、无乳麋血。实验器材应清洁。
2、缓冲液、致敏羊红细胞均应新鲜配制。试验中吸取2％SRBC时注意不断轻摇。
3、受检血清必须新鲜，如放置2h以上，会使补体活性下降。
4、补体的溶血活性受多种因素的影响，如绵羊红细胞浓度及溶血素的量等。当每一致敏红细胞吸附的补体分子低于100时，红细胞溶血程度随细胞浓度的增加而减少；当用高浓度抗体致敏时，溶血程度随细胞增加而增加。红细胞浓度增加一倍，可使50％溶血补体量增加25％左右。故在配2％SRBC和2单位的溶血素时，均应尽可能标准化和准确。钙、镁离子的存在可稳定溶血系统，但含量过多时，反而抑制溶血反应。因此，须对反应的各个环节加以控制。
256℃30min60℃3min
complement fixation test52
图4－1& 补体结合试验示意图
&&& 1&& 2%
&&& 2&& 5630min2
&&& 【实验目的】 掌握补体依赖的细胞毒试验的基本原理，熟悉其操作过程和要求。
【基本原理】
带有表面抗原的靶细胞与其相应特异性抗体结合后，在补体存在的情况下，通过经典途径激活补体，导致靶细胞膜损伤，进而细胞裂解死亡，为补体依赖的细胞毒试验。靶细胞的死活可借染料排斥现象（活细胞不着色）加以判断。通过显微镜计数死细胞占总细胞数的比率，判断细胞死亡率。此试验可用于检测细胞的膜抗原或相应的抗体。如在进行同种异体移植时，通过检测淋巴细胞表面的HLA抗原或血清中抗HLA抗体，可用于HLA定型和HLA配型；也可用于已知抗T淋巴细胞血清，鉴定T细胞亚群；还可用于人的淋巴细胞作抗原，检测抗淋巴细胞自身抗体。
本次试验检测小鼠T淋巴细胞表面分子（抗原）。
【器材试剂】
1pH 9.00.05M1mg/L10mg/L0.1ml433min
20.1ml371h
30.1ml370.51h
4TMB0.1ml371030min
6ODELISA450nmABTS410nmODOD2.1
&&& 11mg/L1mg0.1mg43
20.1ml371h
30.1ml373060imn
2& ODTMB450nmOD450
2pH9.09.641824h0.11.010mg/LODOD110mg/L
4OPDTMBABTS1030minH2O2
312.12.1OD2/2OD5032X2SX2S
（三）酶免疫组化技术
酶免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗原相的一类酶标技术，不但可以通过彻底显色判断抗原抗体反应情况，而且还可以结合组织化学形态以获得更多的信息，常在有关科研中采用。本次实验以检测CD3的实验操练免疫组化技术
&& &CD3IgGCD3--ABCCD3CD3
如：5μghGH用2mCiNa125I进行标记，标记率为40％，则
四& 胶体金标记技术
金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。迄今为止，金标记仍主要用于免疫组织化学中。在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等，已是目前应用广泛的简便、快速的检验方法。
dot& immunogold& filtration&& assay DIGFAHCG
HCGHCGHCGHCGNCNCHCGHCGHCG
&图5－5& DIGFA渗滤装置及操作示意图
A：操作示意图B:装置分解图
2& HCG50mU/mlHCG0.02mol/LpH7.2PBSHCGNC
2HCG50mU/mlHCG50mU/ml
3HCG50mU/ml
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&
dot& immunochromatographic& assayDICA6mm70mmHCG
HCGHCGIgGNCHCGHCGIgG
2& HBsAgHBsAg
4Luminol1minLuminol
5．底物的加入，是为了增强化学发光反应强度，但只有当底物分子与酶催化活性中心充分接触时，反应速度才能加快，当反应进行15min达到平衡时，化学发光强度则不再随时间的延长而变化，且1h内保持稳定。因此控制底物与酶反应15min后加Luminol进行化学发光测定。
生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
1BABBRAB& -B*ELISA
3ABC& B*-AB*CAB*CAB*CAgAbAB*C-
其他标记物BAS法& 如荧光BAS法、铁蛋白BAS法、BAR血凝检测法等，是分别以荧光素、铁蛋白、红细胞代替酶作为标记物的方法。
目前国内主要采用BAS-ELISA法。尤其是BA法和ABC法用得较多。至于其它标记材料（如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等）的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据BAS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。
【实验目的】
本实验以BA-ELISA法为例，要求掌握BA-ELISA法的实验原理，熟悉其操作步骤，了解BAS的临床意义。
BA-ELISAELISABA1015M-1
10.1 M NaHCO31g/L-NBNHS20g/L1mlBNHS20μl，混匀后置室温（22℃）反应2h，然后在4℃中对PBS透析24h，滴定工作浓度后即可使用。
10.1ml41824h33min
B-AbB-Ab0.1ml3730~60min
A-HRPA-HRP0.1ml373045min4
5TMBABTS0.1ml371030min2 M H2SO45μl以终止反应。
10.1ml4℃1824h33min
3B-Ab2:1gG0.1ml37℃3060min
5372030min
BAS的临床应用
巨噬细胞及其他辅佐细胞、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞等。各种免疫细胞既有分工、又有协作，共同完成免疫应答及调控。因此，掌握各种免疫细胞的分离对于其功能的测定具有重要的意义。免疫细胞的分离方法很多，主要是根据细胞的表面标志、理化性状及功能等差异而设计。一般根据实验目的及所需要细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。
&&&&&&&&&&&&&&&人外周血单个核细胞的分离
的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法，可以简便迅速有效的分离出PBMC。
【目的要求】
【实验原理】
混合液作为分层液，比重介于1.075-1.092之间。离心后不同比重的血细胞在分层液中呈梯次分布：红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），位于最下层；而单个核细胞的比重为1.075-1.090，位于分层液的上方，层次非常明显。将单个核细胞层吸出，经洗涤后便可用于某些试验。
【器材试剂】
肝素抗凝人全血。
淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺分离液，比重1.075~1.092）、Hanks 液（无钙镁，pH 7.2~7.4）、1000U/ml肝素溶液（采2ml血约需0.025ml，约1滴）、2%的台盼蓝染液等。
水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。
【方法步骤】
加入等量Hanks液，混匀。
至离心管中。用滴管将稀释血液3~4ml沿管壁徐徐加入离心管，使血液平铺于淋巴细胞分离液之上，使二者之间有一清晰的界面。
，取出后可清楚地看到离心管中的不同层面。
滴肝素及Hanks液混匀，离心1500r/min
10min。弃上清，将试管底部细胞混匀，再加入Hanks液，洗涤两次。
，取样分别记录单个核细胞数和淋巴细胞数。计算单个核细胞回收率及淋巴细胞纯度。
取2滴细胞悬液加1滴20g/L台盼蓝水溶液混匀，静置5分钟后取样作湿片镜检。活细胞排斥染料不被着色，但染料可渗入死亡细胞使细胞呈蓝色。正常情况下，活细胞的比例应不少于95%。
【结果判断】&&&
以上，淋巴细胞纯度达90%以上，细胞活力达95%以上。
【注意事项】
，马为1.090等。
&&&&&& &&&&&&
【目的要求】
【实验原理】
由于直接收集动物腹腔巨噬细胞的数量较少，因此通常要用6%的淀粉肉汤、硫乙醇酸钠肉汤、石蜡油、蛋白胨、血清或甘油等作腹腔内注射，刺激巨噬细胞的聚集。本实验采用无菌液体石蜡做刺激剂收集小鼠腹腔巨噬细胞。
【器材试剂】
PBS-H10U/ml10PBS
HanksRPMI-1640的台盼蓝染液等。
无菌剪刀、水平式离心机、显微镜、细胞计数板、CO2
【方法步骤】
2CTLMHC-ICTLMHC
【注意事项】
【目的要求】
(SRBC)SRBC(PFC)()SRBC&&&
【器材试剂】
2SRBC& Gey2.5108m15108m1&&&
【方法步骤】
1& 1825g12.5108m1 SRBC& 1.0ml()
2& 4dGeyGey1107ml(610ml Gey)
(1)0.1gGey20ml5gL48&
(2)SRBC-SRBC0.9mlSRBC 0.1ml
(3)SRBC-37370.1mlSRBC-0.1ml0.8ml0.1ml37 lhPFC
(1)14gL23ml37
(2)5108m1 SRBC0.1ml0.05ml505gL0.8ml373hPFC
【结果分析】
【注意事项】
1GeyEagleHanksDulbecco Gey
【目的要求】
【实验原理】
【器材试剂】
2(CRBC)& Alsever41CRBC35108m1 CRBC
3& 1g10ml24d& 100gL
4& 10RPMI 16404106ml
5& 50gL(1002h)10RPMI 164075Wright-Giemsa(40UmlHanks)
【方法步骤】
(1)1cm()4 6h48h()()2
(2)CRBClmlCRBC0.04ml3730min10min1500rmin5minWright-Giemsa20minpH6.4& 0.015molL PBS200 CRBCCRBCCRBC4
2& 50gL2025g24hCRBClml30min0.2ml35minWright-Giemsa
(1)2025g14ml 905ml2000rmin10minRPMI l6402106ml
(2)lml0.2ml37
(3)1hWright-Giemsa20minpH6.4 0.015molL PBS
【结果分析】
1200CRBCCRBC
62.771.381.0580.049&&&
3450.6180.0346065
【注意事项】
【目的要求】
【实验原理】
【器材试剂】
2& RPMI l64010.4g1000ml3010100Um1100gm1L-50mg60.0g/L NaHCO3pH7.27.6
PHA(RPMI 16405001000gm1)8.3gL&&& NH4ClGiemsa(19)
【方法步骤】
10.1ml1.8ml RPMI l640PHA
0.1ml37(5CO2)3d&&&
28.3g/L NH4C1 4ml3710min2000rmin10min5ml10min0.2ml&&&
342~3&&& Giemsa10&&& 20min&&&
【结果分析】
60.17.6&&&
【实验原理】
在淋巴细胞中加入PHA或特异性抗原培养后，细胞可发生有丝分裂，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdRDNA
【器材试剂】
5.57.41012Bqmmol201 3.7104Bqml&&
3& 4.0g 25-(PPO)0.4g l4(5--2) (POPOP)1000ml
【方法步骤】
172hPHA 120h8h3H-TdR
26ml35.0gL NaCl 2ml
31000rmin 10min2ml4910ml
450.0gL23ml12ml24
65mlcpm&&&
【结果分析】
& &&106/ml cpm
【注意事项】
1RPMI l640pH7.27.4
2()10ml2ml
3()PHA3H-TdR
【实验原理】
&MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑-2，5-二甲基溴化四唑），是一种黄色可溶性物质。在细胞培养终止前4h加入MTT，作为细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，将MTT代谢形成紫蓝色的甲攒沉积于细胞内或细胞周围，家攒可经异丙醇或二甲亚砜完全溶解，可用酶标仪测定细胞培养物的OD值。因家攒形成的量与细胞活化增殖的程度成正比，故可根据OD值反映细胞活化增殖情况。该法也可用某些细胞因子活性测定（细胞因子依赖性的细胞株增殖法）。
该法敏感性不及3H-TdR
【器材试剂】
【注意事项】
加入盐酸异丙醇后要在1h内进行测定，若1h内不能测定，可将未加盐酸异丙醇的培养板置40C保存，测定前取出，室温放置数分钟后再加盐酸异丙醇，以上法测定。
【目的要求】
本试验以-2(IL-2)的检测为例，熟悉细胞因子测定的原理，了解其测定的方法及意义。
【实验原理】
IL-2 IL-2-2(IL-2)T(TCGF)T(CTLL-1CTLL-2CT6NKC3)IL-2IL-2DNA3H-TdRDNAIL-23-(45--)-24-(MTT)DNA(3H-TdR)()IL-2
【器材试剂】
IL-2(RPMI 164010L-20mgm1100Um1100gml)FicollPHA3H-TdR
【方法步骤】
1& CTLL(T)5~10Um1 IL-2(1020 IL-2)37510 CO223d5105m1 CTLLIL-2RPMI 164035IL-21105m1
2IL-2& FicollRPMI 1640PHA(1gm1)2106ml2.0ml375 CO248h1500rmin 20min0.22mIL-220
3IL-2& 96ABC110IL-20.1mlDEF110IL-20.1ml110121415121112 0.1ml
961105ml& CTLL0.1m1
375CO218~24h
43H-TdR& 1824h1.85104Bq(0.5Ci)3H-TdR812h5mlcpm
5MTT& 1824h10lMTT5mg/ml46h0.04mol/L NH4Cl100l10minMTT570nm
【结果评价】
13H-TdRcpmIL-2R(R=IL-2cpm)IL-2RIL-2RR50RIL-21IL-2IL-2132IL-232U/mlIL-2IL-250g/ml50R14050R132IL-2NN50g/ml(32/40)
2IL-2IL-23H-TdRIL-2MTTELISA
【注意事项】
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
BIgEIgEFcFcR1IgE
【目的要求】
2& 200U/ml
21ml40.02~0.03ml
表12-1& 皮试评级标准
OTPPDTOTPPD4872
2& OT2ml120000.1ml5IUPPD0.1ml0.1g
112000OT11ml
21ml4OT 0.1ml
表12-2& OT试验判定标准
1110 0001100 000OT
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
IgIgIgELISAIgERISTRASTELISAELISAIgEIgEIgE
2& IgEIgE-HRPIgEWHOIgE[1mg/ml]3mol/L NaOH
1IgE10μg/ml0.2ml433
2A0.2ml200100502512.56.253.131.560.80.40.20.10.05IU/mlB1101100237 2
3IgE-HRP0.2ml37 2
40.2ml3730492nm
1AAIgEIgEIgE1IU=2.4ng
631±128IU/ml315535ng/ml
337±60IU/ml（312000ng/ml）。
2IgEIgEIgEIgEIgESLE
【注意事项】
1．本试验的检测灵敏度为0.2U/ml3.1350μg/mlIgE
2IgEIgE-HRP
【目的要求】
【实验原理】
CICCICCICPEGPEGHOCH2CHOnH3040g/LPEG 6000CIC
2& pH8.4& 0.1mol/LBBS41g/LPEG4.1g PEG 6000 NaF 1.0g100ml BBS
1BBS130.2 ml0.4ml BBS
&&& 211-1PEG37.3g/L
表13-1&& PEG沉淀法试剂加入表
1A=AACICA0.0430.02XSD100CICIgG(AHG)AHGA2CIC
2PEG20g AHG/mlCICCIC
3CICSLECIC
PEGPEG60002050g/LPEG20g/LPEGCIC40g/L PEGCIC50g/LCIC
24CIC1A0.02
RFIgGIgGIgGIgGRFIgGRF
2& IgGpH8.2
【目的要求】
【实验原理】
MLCHLALDHLA-DDPHLA-D()DPMLCCMLCMLC(HTC)(PL)DDP3H-TdR
【器材试剂】
2& 10ABRPMI 1640
110 ABRPMI l6400.2ml
25CO2376d12
【结果分析】
1&50 MLCLD
3MLCLDLD&&&
【注意事项】
1500170&&&
&& ①专业设计，即从学科专业角度出发，确立课题题目，明确研究目的，确定实验对象、试验技术路线、方法、观察指标，并对预期结果作出正确判断。②统计学设计，即运用统计学原理和方法，控制实验误差，保证专业设计布局的和理性和实验结论的可行性，有助于揭示科学发现的规律性。
&& &1. 题目 实验（或课题）的题目是实验设计的处罚掉和归结点，也是实验内容是我集中体现。因此，题目应确切反应研究内容、范围和特点，用词要准确、具体、简洁、醒目，使人一目了然，引起重视。
&&&&3562NKYac1
410~15min10~15min
1 25TIL-2CD25
①对其他作者的观点、方法和发现表示赞同和尊重；②为读者提供更多相关信息来源。参考文献的一般写法是在正文引用文献处标注一个带阿拉伯数字的方括号角码（以右上标方式写在本局划句号前），在正文末尾“参考文献”下，按序号逐条列出文献目录。一般格式如下：
期刊：著者.文章名.刊物名称,卷或年(期):文章的起止页码
书籍:编著者.书名.版本.出版地:出版者,年份
五 论 文 答 辩
【研究背景】免疫抑制疗法是指应用人工方法减弱或抑制对机体不利的免疫应答，从而达到治疗疾病的目的。主要用于抗移植排斥反应和自身免疫病的治疗。免疫抑制可以通过免疫抑制剂、放射照射、淋巴器官摘除、免疫细胞及免疫分子清除及基因疗法等手段加以实现。目前以免疫抑制剂最为常用。
免疫抑制剂种类较多，主要包括化学合成药物（糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤）、微生物制剂（环孢菌素A、FK-506、雷帕霉素）中药（雷公藤多甙）及抗淋巴细胞抗体等。各种免疫抑制剂对机体免疫功能的作用机制及作用环节不尽相同。一般而言具有以下特点：①大多数免疫抑制剂缺乏选择性和特异性，可影响机体正常的免疫功能的发挥，久用可降低机体抗感染能力，易诱发感染和肿瘤的发生。②往往抑制初次免疫应答比抑制再次免疫应答的效果好。其原因可能是由于发生再次免疫应答的淋巴细胞是已经分化成熟的细胞，故对药物的敏感性较低。③用药于抗原刺激的时间关系对药物疗效有明显影响，这与药物的作用机制密切相关。例如糖皮质激素和抗淋巴细胞抗体等，通常在抗原刺激前24-48h给药免疫抑制作用较强；硫唑嘌呤则在抗原刺激后48h内用药作用最强；而环磷酰胺则在抗原刺激前后用药均有效，但以抗原刺激后48h用药效果最好。④许多免疫抑制剂只有在接近毒性剂量才能产生免疫抑制作用，因此在进行研究或临床应用时应注意研究疗程、给药途径、总剂量及给药次数等。
雷公藤是一种卫矛科植物，广泛分布于我国南方，其雷公藤总甙为根心提取物，研究表明，雷公藤总甙制剂中含有雷公藤内酯甲、雷公藤三萜酸B、雷公藤三萜酸A、orthosphenic
acid和雷公藤三萜酸C等多种成分，属萜类化合物。动物实验证实，雷公藤有抗炎、抗肿瘤、抗生育和免疫抑制等作用。多年来，雷公藤及其抑制剂已成为临床治疗自身免疫性疾病和抗免疫排斥的常用药物。
雷公藤总甙对免疫系统的影响主要表现为：低剂量时，对免疫细胞及其分泌细胞因子的免疫活性有明显的抑制作用；高剂量时，除了能加速免疫细胞如T淋巴细胞的凋亡外，还对T淋巴细胞有直接的杀伤效应。大量实验研究证实，雷公藤的免疫抑制作用主要表现为：①雷公藤在体外能抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖反应，并使培养上清液内IL-2活性降低。②雷公藤总甙能明显抑制PHA刺激的人CD4+、CD8+细胞的增殖，但对CD4+细胞的抑制作用更强。③雷公藤总甙能抑制家兔的局部异体植皮反应及其初次抗体反应。④雷公藤总甙能抑制IL-2，IL-2R，IL-6等基因转录，而且呈剂量-效应关系。
雷公藤总甙的免疫抑制作用不仅范围较广，而且其效应与其使用剂量高度相关。由于其有效抑制免疫作用的剂量与致毒作用的剂量十分接近，因此，有不少研究人员试图将雷公藤总甙的免疫治疗成分与其毒性成分分开，但并没有取得理想的效果。显然，从分子水平上弄清楚雷公藤总甙的药效成分与其分子作用机制之间的关系仍是未来努力的方向。本实验的目的是进一步探讨雷公藤总甙有效成分的免疫调节作用，研究其抗移植排斥效应及其作用机制，为该药的临床应用提供实验依据。
【研究目标】
1．通过本设计性实验，观察雷公藤总甙对机体细胞免疫功能的影响，从而阐明其作用机制和用途。
【实验方案】
1．药物 雷公藤总甙，市售。采用生理盐水配成不同浓度。
实验动物 BALB/c和C57BL/6近交系小鼠，8~12周龄，雌雄兼有。
实验分组 将BALB/c小鼠30只分为3组：生理盐水对照组（10只），用药I 组（10
只）、用药II组（10只）。用药I 组、II组经腹腔分别注射雷公藤总甙12.5 mg/kg.d和25mg/kg.d，连续7d。
&&&& 【观察指标】
1．检测T细胞亚群CD3、CD4、CD8阳性细胞的百分率，并计算CD4/CD8的比值。
检测脾细胞对丝裂原ConA
的增殖反应。
检测脾细胞IL-2的产生水平。
检测混合淋巴细胞反应（MLR）。
观察异基因骨髓移植小鼠的存活期和排斥死亡率。
【实验方法、步骤及技术路线】
1．体内实验
（1）免疫功能测定实验：将BALB/c小鼠30只分为3组，分别经腹腔注射不同剂量的
雷公藤总甙和生理盐水，连续7d。处死小鼠，取脾病制备脾细胞悬液，以间接免疫荧光法检测T细胞亚群，采用MTT比色法测脾细胞对ConA的增殖反应，采用生物活性测定法测定脾细胞IL-2的产生。
(2) BALB/c小鼠30只，于60Coγ射线下全身照射，剂量为8.5
Gy。照射后24h内输入C57BL/6小鼠骨髓细胞和脾细胞。于照射后4d将小鼠分为3组，分别经腹腔注射不同剂量的雷公藤总甙和生理盐水，连续7d。观察动物的存活期和排斥死亡率。
1IL-2BALB/c小鼠10
只，制备脾细胞悬液，置96孔培养板进行培养，并用ConA作为刺激剂，每孔加入不&同浓度的了雷公藤总甙溶液20&l，培养48h、72h后分别测定上清IL-2的含量和脾细胞增殖反应。
&&&& （2）雷公藤总甙对小鼠脾细胞MLR的影响：于96孔培养板每孔加入BALB/c和C57BL/6小鼠脾细胞悬液100&l及不同浓度的雷公藤总甙溶液20&l，并用生理盐水对照，培养24h厚采用MTT比色法或3H-TdR掺入法测定脾细胞增殖反应。
&&&& 【预期结果分析】
&&&& 【可行性分析】
&&&& 雷公藤总甙对免疫功能抑制作用亦有报道。本实验设计方案合理、分组、对照、体内和体外实验兼有；技术方法和技术路线可行，学生通过免疫学基础实验和综合实验学习，已掌握免疫细胞、免疫分子的检测技术；实验所需药品、试剂及动物均较易获得，因此，开展实验条件已经具备。
&&&& 【思考题】
1．请在本实验设计方案的基础上，结合所学知识和查阅文献，进一步补充、修改和完善该实验设计，并结合实验条件加以实施，撰写实验报告和论文。
【研究背景】&&&&&&
【设计提示】
根据细胞因子作用特点，通过建立特定荷瘤小鼠动物模型，观察某些细胞因子如IL-2、IFN、TNF、趋化性细胞因子等荷瘤小鼠免疫功能的影响以及抗肿瘤作用，了解其作用机制和用途。
【目的要求】
通过基础实验和综合实验的学习，除部掌握如何将其运用到设计性实验，提出设计方案；无额定观察指标，主要是与机体抗肿瘤活性相关的免疫学指标；采用的试验方法、手段、步骤及技术路线；所需器材和试剂；预期实验结果也分析；可行性论证等。
【研究背景】
多糖类化合物广泛存在于植物、真菌和细菌中。多糖类化合物作为生命物质的组成成分之一，广泛参与了细胞的各种生命活动及生理过程，如免疫细胞间信息的传递，细胞的转化、分裂及再生活动等。多糖类免疫调节剂包括免疫增强剂和免疫抑制剂。多糖类免疫增强剂能通过多种机制刺激免疫系统，提高机体的特异性和非特异性免疫功能，具有抗感染、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等作用；而免疫抑制剂则具有相反作用，多用于器官移植排斥反应及某些自身免疫性疾病的防治。
【设计提示】
多糖类免疫调节剂的结构与功能的关系，迄今尚未十分清楚。多糖的立体构型、分子量、取代基、溶解度、黏度，给药剂量、给药途径等均能影响其生物学活性。多糖类免疫调节剂对机体免疫功能的影响主要通过以下途径发挥作用：①激活单核-吞噬细胞系统和补体。②激活巨噬细胞和T、B淋巴细胞、NK细胞。③调节红细胞免疫。④通过神经内分泌网络而发挥免疫调节作用。⑤诱生多种细胞因子，包括干扰素、白细胞介素，肿瘤坏死因子、集落刺激因子等。
本设计性实验的关键是构建免疫功能低下模型，探讨多糖类免疫调节剂的最佳作用浓度、给药方式和作用时间；选择适当的试验方法，明确观察指标，分析多糖类免疫调节剂对机体免疫功能的影响。
【目的要求】
1．通过本设计性实验，了解多糖免疫调剂的种类、分离纯化、结构鉴定、作用机制和用途。
【研究背景】
2050196019751980
【设计提示】
1．病例选择及标本收集
（1）病例的选择：收集某一种有代表性的肿瘤病例，如原发肝癌、乳腺癌、肺癌等。
（2）对研究对象定义：符合临床诊断标准和病理诊断标准。
（3）对照组设计。
（4）样本来源、收集、运送、处理与保存。
（5）收集的样本量一定要符合统计学处理所规定的数量。
2．检测指标及检测方法的确定
（1）要认真复习所学过的免疫学和肿瘤免疫学知识，在此基础上，根据所选病例和肿
瘤的发生发展与免疫的关系，并结合试验室条件，讨论确定检测指标和方法。
【目的要求】
1．通过本设计性实验，观察肿瘤患者免疫功能状况在肿瘤发生、发展过程中的变化情
况，以及对肿瘤患者治疗前后疗效的评价。
【研究背景】
自身免疫病（AID）种类较多，不同类型的AID发病机制有所不同。根据AID的发病机制不同，可分为一体液免疫（自身抗体）为主介导的AID和以细胞免疫为主介导的AID，某些患者可能是两者共同参与了发病过程。不管何种类型的自身免疫病，除涉及自身抗原、自身抗体或自身反应性淋巴细胞因素异常外，患者往往还涉及到体内某些细胞因子等相关因素的变化所导致的免疫功能紊乱，故AID患者免疫功能状态的测定应根据不同病种类型，选择不同的研究对象、研究内容和实验方法进行测试分析。
【设计提示】
1．抗体介导为主的AID检测指标确定
重点是对某种AID的自身抗体检测。
2．细胞介导为主的AID检测指标确定
重点是对某种AID的局部炎性损伤部位和血循
环中免疫细胞类型及T细胞亚群的检测。
3．相关指标确定对抗体介导为主的AID，一是观察促进体液免疫效应及炎症损伤反应
的相关因素，如Th2 细胞所分泌的代表性细胞因子（IL-4）及补体的变化；二是从病理学的角度观察靶器官或靶组织局部炎症的反应特点。细胞介导为主的AID，可同时观察Th1/Th2型细胞因子的变化，尤其是观察Th1型细胞因子和技法炎症反应的细胞因子如IL-1、IL-8、TNF 等；同时也可考虑检测IL-10表达是否偏低等。对有些细胞和抗体共同介导参与的AID，应同时考虑选择以上相关指标进行检测分析。
4．检测方法 血循环中自身抗体或细胞因子可取血清用ELISA、RIA或化学发光法等
进行定量检测分析；免疫细胞类型及T细胞亚群数量可用免疫组化技术、荧光抗体技术或流式细胞仪等进行检测分析。
以上观察指标的确定，可因病种不同及实验条件的不同重点选择2~3项指标进行检测
分析，对不同检测标本要注意正确的采集与处理方法，各项检测指标要注意设计对照组。
【目的要求】
参考选题5 新型免疫细胞亚群的分析
【研究背景】
&&& 淋巴细胞和抗原提呈细胞是机体的重要免疫细胞，其中淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，T淋巴细胞又可根据某些表面标志的不同分为CD4+ T和CD8+ T淋巴细胞两个亚群；抗原提呈细胞根据其形态学、功能和表面标志分为巨噬细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞等数种。细胞类型和亚群的分类最终体现了细胞群体功能的差异。各种免疫细胞间及各亚群间的相互作用，构成了复杂而缜密的免疫防御网络的主体。目前，免疫细胞亚群的研究异常活跃，CD4+ T细胞、CD8+T细胞、B细胞和DC细胞，相继发现了众多的新的细胞亚群。如T细胞中的Th1、Th2、Th3和调节性T细胞；DC中的DC1、DC2、PDC和调节性DC等。这些细胞亚群的发现丰富和完善了免疫学理论体系，但这些研究中仍有许多不完善的地方，还有众多免疫细胞亚群没有被揭示，随着研究的深入，各种免疫细胞亚群可能会被重新评价和分类。
【设计提示】
免疫系统是一个充分进化的系统，是一个非常完善和平衡的防御体系，纵观免疫学的发展历史，会发现很多现象是对称或平衡出现的。如：细胞免疫与体液免疫理论体系、自身免疫病与免疫缺陷的并存、免疫识别与免疫耐受、TCR与BCR、Th1和Th2、刺激性DC与调节性DC等等。
近几年的研究提出了调节性T细胞和调节性DC的概念，但目前的证据仅仅说明这些细胞具有一定的抑制作用。那么对于作为免疫系统主体的T细胞和DC是否具有抗原特异性抑制性群体呢？请根据免疫学理论加以分析，查阅文献并进行实验设计来验证你的观点。
【目的要求】