一粒小麦、节节麦叶片表皮蜡质组成及β-酮脂酰辅酶A合成酶KCS基因的克隆与功能分析--《西北农林科技大学》2015年硕士论文
一粒小麦、节节麦叶片表皮蜡质组成及β-酮脂酰辅酶A合成酶KCS基因的克隆与功能分析
【摘要】：植物的表皮层是覆盖在陆生植物表面的重要屏障。表皮蜡质是由一类超长链的脂肪酸及其衍生物组成的混合物的总称,在限制植物非气孔性的水分散失和抵御环境危害方面起着重要的作用。β-酮脂酰辅酶A合成酶(Ketoacyl coenzyme A synthetase,KCS)是超长链脂肪酸延伸过程中的关键酶,负责蜡质成分的前提合成。本文利用气相色谱离子化火焰检测器(Gas Chromatography-Flame Ionization Detector,GC-FID)跟踪测定了一粒小麦和节节麦苗期、拔节期、抽穗期和灌浆期叶片蜡质的组成,比较了两者蜡质组成的差异,利用扫描电镜(Scanning Electronic Microscopy,SEM)观察各生育期蜡质晶体形态的变化,发现了这两个物种中蜡质组成的差异。以一粒小麦、节节麦叶片的cDNA为模板,分别克隆了TaKCS1、Ta KCS2和TaKCS4的同源基因,通过氨基酸序列的差异分析,最终将一粒小麦和节节麦中的TaKCS2和TaKCS4的同源基因转入番茄品种“Micro Tom”中,来阐述KCS的过量表达对番茄蜡质组成的影响,从而验证小麦的两个基因组的供体种中KCS的功能,为揭示小麦蜡质的合成机理奠定基础。主要研究结果如下:1.对一粒小麦和节节麦不同生育期叶片蜡质各组分的含量测定表明:随生长发育的进行,蜡质总含量不断积累,其中初级醇的比例降低,烷烃的比例升高,一粒小麦中二酮的含量稍微上升,节节麦的基本不变,脂肪酸和醛的变化规律不明显。一粒小麦与节节麦叶片蜡质组成的主要差异:占主导地位的初级醇的碳链长度不同,即在一粒小麦中C28醇占主导地位(45.75%-78.58%),而在节节麦中是C26醇(62.16%-80.09%)。2.对一粒小麦、节节麦叶片的蜡质晶体扫描电镜观察结果表明:一粒小麦和节节麦叶片的近轴、远轴面蜡质晶体形态无明显差别。一粒小麦苗期为片状;抽穗期除了大部分为片状形式,开始出现棒状晶体,且晶体的密集程度变稀疏;灌浆期的蜡质晶体仍以棒状和片状两种形式存在,其中棒状晶体增多,晶体密集程度稍变稀疏,膜状蜡质层增多。节节麦叶片的近轴、远轴面蜡质晶体形态一直为片状;与苗期相比,抽穗期的蜡质晶体的密集程度比苗期稀疏;灌浆期变得更加稀疏。3.根据生物信息学分析,分别从一粒小麦、节节麦中成功克隆了3个TaKCS的同源基因,然后对其进行了小麦染色体的初步定位、基因序列长度、编码框长度和氨基酸的个数进行了统计分析,并比较了其核酸和氨基酸序列的差异。利用农杆菌介导的方法将氨基酸具有差异的基因TmKCS2、AtaKCS2、TmKCS4和AtaKCS4成功导入番茄品种“Micro Tom”,经过抗性筛选和PCR鉴定,分别获得阳性植株若干。转基因植株的蜡质检测结果显示:与对照相比,转基因植株的蜡质组分的碳链长度的分布并没有发生改变,但是蜡质总量、总的初级醇的含量升高,其中C24:0-OH、C26:0-OH、C28:0-OH和大多数烷烃的含量都呈现出不同程度的增加。
【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S512.1【目录】：
摘要6-8ABSTRACT8-12第一章 文献综述12-26 1.1 蜡质的概述12-18
1.1.1 表皮蜡质的形态结构、功能与组成12-14
1.1.2 植物表皮蜡质的生物合成14-18 1.2 植物表皮蜡质相关基因的研究进展18-22
1.2.1 蜡质合成相关基因的研究进展18-21
1.2.2 蜡质合成调控基因的研究进展21-22 1.3.蜡质基因在抗旱中的应用22-23 1.4 小麦方面的研究进展23-24
1.4.1 小麦的进化起源23
1.4.2 小麦蜡质方面的研究进展23-24 1.5 本研究的内容和目的意义24-26
1.5.1 研究的内容24
1.5.2 研究的目的、意义24-26第二章 一粒小麦和节节麦叶片表皮蜡质的分析26-41 2.1 材料与试剂26
2.1.1 材料26
2.1.2 试剂26 2.2 试验方法26-27
2.2.1 蜡质提取26
2.2.2 气相色谱分析26
2.2.3 扫描电镜观察26-27 2.3 试验结果27-38
2.3.1 一粒小麦、节节麦叶片表皮蜡质的化学成分27-28
2.3.2 一粒小麦、节节麦不同生育期叶片表皮蜡质组成的变化28-35
2.3.3 一粒小麦、节节麦叶片表皮蜡质的形态结构35-37
2.3.4 一粒小麦、节节麦蜡质组成主要的差异分析37-38 2.4 讨论38-41第三章 一粒小麦、节节麦叶片表皮蜡质 β-酮脂酰辅酶A合成酶KCS基因的克隆与功能分析41-64 3.1 材料与试剂41-42
3.1.1 植物材料、菌株及载体41
3.1.2 试剂41-42 3.2 方法42-49
3.2.1 小麦中KCS同源基因的筛选42
3.2.2 一粒小麦、节节麦叶片总RNA的提取42-43
3.2.3 一粒小麦、节节麦TaKCS同源基因全长cDNA的获得43-44
3.2.4 植物表达载体的构建44-46
3.2.5 农杆菌感受态的制备及冻融法转化农杆菌46-47
3.2.6 农杆菌介导番茄的遗传转化47-48
3.2.7 番茄转基因植株的PCR鉴定48-49
3.2.8 番茄转基因植株蜡质组成的检测49 3.3 结果与分析49-62
3.3.1 小麦中KCS同源基因的筛选49-51
3.3.2 一粒小麦、节节麦中TaKCS同源基因cDNA的获得51-52
3.3.3 植物表达载体的构建52-53
3.3.4 一粒小麦、节节麦中TaKCS同源基因的序列差异分析53-56
3.3.5 农杆菌介导的番茄的遗传转化56-57
3.3.6 转基因番茄植株的蜡质组成分析57-62 3.4 讨论62-64第四章 结论与创新点64-66 4.1 结论64-65 4.2 创新点65-66参考文献66-72附录72-76致谢76-77作者简介77
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植物GST、DCL基因和泛素蛋白酶体途径对植物抗性的调控功能分析
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你可能喜欢2015年11月开始，很多农户反映小麦出现发黄现象。济南禾雨农药有限公司邀请山东省农科院植保所李长松研究员到滕州、嘉祥进行实地调查。经专家查看，小麦发黄的原因可以分为三大类：一、&&&&&&&&&&&&&&&小麦病害，一些茎基部病害如根腐病、纹枯病都会使小麦发黄。二、&&&&&&&&&&&&&&&冻害，11 月中下旬至 12 月中旬，最低气温骤降 10℃左右，达－10℃以下，持续 2～3 天，小麦的幼苗未经过抗寒性锻炼，抗冻能力较差，极易形成初冬冻害。现死苗死蘖现象，冻死小麦主要是弱苗和旺苗。另外，整地质量差的麦田，特别是近年旋耕未镇压的麦田以及沙土地麦田极易发生冻害三、&&&&&&&&&&&&营养供应不足①土壤前期整地工作没有做好，土壤之间有空隙，使得种子与土壤不能充分接触，不能满足作物根系的生长要求，造成小麦发黄；②秸秆还田过程中，秸秆粉碎不彻底，腐熟镇压工作不到位，内部疏松，导致小麦种子播种后根系直接依附于秸秆表层，无法与下部土壤接触，进而吸收不到土壤养分。&以上两点形成的悬空苗，也极易遭受冻害。&针对这些田间情况，2016春季麦田管理应注意以下事项：1、药害问题：&&&&&& 2016年前、年后天气多雨雪，温度低，导致防治节节麦的除草剂大多是在年后打，在打节节麦除草剂的时候，一定要查看3天内的天气预报，温度低于10度应避免打节节麦的药，针对可能产生的药害，一定跟用户说清楚：今年天气特殊，打上去有可能会发黄，也有可能防效差。避免麦子发黄的方式有：（1）降低节节麦药的用量或者降低使用浓度。（2）晚点打，等到3月中旬以后，麦子彻底返青，麦子自身抗性增强的时候再打。（3）不能加有机硅等助剂。&&&&& 如果使用二甲四氯、2,4—滴等激素类除草剂，最好在3月下旬，温度高、分蘖末期使用，这样效果好，对麦子的安全性高。2、为了确保除草效果，金马一套兑1桶水，打7分地，春收一瓶兑1桶水，打7分地，把袋子里和瓶子里的药刷干净，避免浪费药，均匀喷雾。根据以往的药效投诉，大多是用药量少，或者喷雾不均匀导致，在2016年推荐的时候，应着重强调剂量和用水量，确保用量足、喷匀喷透，袋子里的药清洗干净。3、万一打了除草剂，麦子发黄，要及时喷施生物刺激素，来增强麦子在受胁迫下的抗逆能力。当遇到小麦发黄，农户首先要做的是判断是什么原因导致的小麦发黄。首先观察麦田麦苗发黄是否大面积发生，如果随机小面积分布，则是病害，挖出小麦，在茎基部会有明显病斑。大面积发生考虑是冻害和营养供应不足，冻害的叶片一般扭曲，在叶片幼嫩叶尖或叶片中间位置发黄，而营养供应不足小麦从老叶叶尖开始萎蔫发黄。2016年2月中旬，山东各地小麦陆续返青，可是田间出现了的过多的“金灿灿”。针对于此，济南禾雨农药有限公司制定了一系列管理套餐，力求2016年小麦保产、增产。进口产品方案一：（1）返青期，结合除草剂金马或春收的使用，加入至亮10g兑一桶水，均匀喷雾。至亮成本低，用户容易接受，预防效果好。（2）7天后，如果麦子依然发黄，可以用甘美30毫升兑一桶水喷雾，有助于小麦从越冬期过渡到生长期，为增产打好基础。（3）4月中下旬的孕穗期、扬花期，打1—2遍杀菌剂和生物刺激素，治病增产。可以用至亮10g+甘美30ml兑一桶水，均匀喷雾。至亮有效防治白粉病、赤霉病，同时甘美可以提高小麦灌浆能力，为增产起决定作用。如果此时田间白粉病发生严重，建议用壮亮一套+甘美30毫升兑30斤水，可以有效防治白粉病、纹枯病、锈病、赤霉病。&进口产品方案二：（1）返青期，酷思特10毫升兑一桶水，可以与除草剂混用，均匀喷雾。（2）7天后，可以用艾富莱25毫升兑一桶水，或者用瑞思佳30克兑一桶水，促进小麦起身，长势旺。扬花期，用酷道组合（酷思特10毫升+道立锋15毫升）一套，单打即可。病害发生轻，则酷道组合兑2桶水，病害发生重，酷道组合兑1桶水，每桶水加上艾富莱25毫升，或者瑞思佳30克，均匀喷雾。如果作物出现缺素症状，建议每桶水加上艾尚微5—10克，解决微量元素的缺乏症状。对于白粉病、锈病、赤霉病2天见效。艾富莱、瑞思佳可以促进小麦籽粒灌浆，增加千粒重。一、美国富美实公司--至亮1、定位分析：&&&&至亮由咪唑类杀菌剂和三唑类杀菌剂按照2:1的最佳比例复配而成，不仅触杀作用强，更具有优良的内吸传导作用，从而能快速控制病害蔓延，又能长效防护，适合在小麦、花生、辣椒、大姜等作物上推广。2、使用技术纹枯病属于土传性病害，在植物生长弱情况下容易侵染，在防治中抓住一个“早”字，苗期小麦未封垄，可以喷到小麦茎基部病害发生部位。(1)、年后返青期3月份用量：至亮1包/1桶水，可与常规的除草剂混用，纹枯病发病严重的地块适当增加用药量和用水量，保证喷匀喷透，药液能渗透到小麦茎基部。(2)、扬花期4月份推荐用量：麦子4月20号扬花期遇雨水容易发生赤霉病，至亮1包/1桶水，可以有效防治花期赤霉病、锈病等病害，可以跟其他药一块混用。二、美国富美实公司--至壮至壮是最新一代强壮型杀菌剂,收获好品质至壮特点：杀菌谱广 –苯醚甲环唑是三唑类杀菌最广谱成分使用范围广- 花生、果树、蔬菜、小麦、玉米等保护和治疗-强强联合，双效杀菌内吸性强，持效期长，省工省时增加作物抗逆能力，改善作物品质，提高作物产量至壮优势：壮抗早衰，所以叶片可以更长久的保持青绿更绿的叶片能够更有效的进行光合作用，更能应付干旱条件下氮同化更有效从而使作物对氮的利用和吸收得到改善更长，更有效的光合作用时期可以生产出更多碳水化合物，很多的碳水化合物就意味着更高的产量&三、以色列安道麦公司--道立锋& & & &1、产品特点：（1）安道麦在全球最新推出的内吸保护复合型杀菌剂。具有内吸治疗作用，也有较好的触杀保护作用。（2）调节作物生长作用，保护叶片叶绿体的作用，施药后，叶片亮绿，生长势强。成熟期青枝蜡杆，叶青籽黄。（3）粮食作物上用可以提高灌浆率和籽粒饱满度，平均亩增产10%--15%。2、使用方法（1）第一遍，对于年前的小麦根腐病、纹枯病引起的死苗有优异的防效，这主要是因为丙环唑的内吸作用较强，对根腐病特效，15毫升/桶水；（2）第二遍，年后3月份可以在浇过返青水后，随着除草剂等一块打一遍，可以有效预防纹枯病引起的白穗。（3）第三遍，4月20号左右的扬花期，可以配着蚜虫药一块打，真正可以做到防治纹枯病、白粉病、锈病、赤霉病四大病害。在第三遍的时候，如果加上酷思特，将会效果极其优秀，增产显著。在小麦上，只打这三遍道立锋（加上酷思特），可以防治除了全蚀病以外的所有病害，增加持效期，减轻劳动力的投入，增产显著。四、以色列安道麦公司--酷思特1、产品特点（1）以色列开发的独特混剂配比，具有治疗，保护和铲除作用。（2）两个有效成分配比独特，剂型先进，环保安全。独特的内吸传导性，使药剂分布更均匀，从而提高防效。（3）防治多种真菌病害，具备前期预防，保护和中后期治疗，铲除效果，是一个全程通用性杀菌剂，能延缓衰老，促进光合作用，改善农作物品质，提高商品性。2、使用方法酷思特针对纹枯病、白粉病、锈病防效很优秀，一般是在3月份随着除草剂的使用一块喷雾，防治白穗，在扬花期随着蚜虫药一块喷一遍，治疗白粉病、锈病，持效期长。如果遇到赤霉病发生严重的区域，可以跟道立锋混配，所有病害，一剑封喉。五、美国富美实公司--甘美1、成分：腐植酸30.6g/L；N 27.4g/L，P2O5257.3g/L，K20 224.7g/L产品特点：&本品原料来源美国优质高品位的风化褐煤，采用先进的生化工艺，将腐殖酸、黄腐酸与胡敏酸按照特定比例有机地的结合，由刺激作物生长发育的大、中、小分子量的有机功能物质组成；独特之处：（1）原材料属于资源产品，不可模仿。（2）复合有机酸里面本身含有氮磷钾，更有利于吸收，因此效果更好功能：（1）刺激植物生理生化反应，促进植物生长；（2）维持根系的生长活力；（3）高效供应植物生长所需的有机物质与营养元素；（4）提高植物抗逆、抗病性；提高产量与品质；2、使用方法：（1）针对气候不规律、苗弱麦田，年前和返青期喷除草剂时每亩地搭配使用甘美50ml，全田喷雾，激发并增强作物对营养元素的吸收与利用，促进作物根系生长发育，增加作物抗逆抗病能力。（2）由于药剂混用或使用不当出现药害，首先田间取样，再观察受害程度，如果叶片发黄面积小于30%，每亩地使用甘美50ml兑两桶水，全田喷雾，缓解对小麦伤害，尽快恢复长势；发黄面积大于50%，心叶正常，可以使用甘美尽量补救，不至绝产。六、西班牙--艾尚微产品特点：1.富含多种微量元素，如：硼、锰、铜、锌、铁、钼等，提供全面而均衡的微量元素，有效提高品质。2.获欧盟有机认证，进口品质保证。3.艾尚微可有效增强作物的生长活力，抗病力和抗逆性，增产增收！让作物叶片浓绿、果实膨大、提高品质。4.持效期长达15--20天！5.艾尚微不含激素，是特别工艺螯合态矿物源肥料！安全性好，高效！&七、埃及-艾富莱&组成成分百分含量多肽550克升45%（38%）游离氨基酸200克升16.7%（10%）螯合态(铁+锰+锌)20克升1.7%（2%）作用特点：1.防非生物及生物危害2.抗非生物及生物危害（防冻，冷，抗旱，抗寒）3.解药害，解肥害4.伤病后快速恢复，提高根系抗逆性和吸收能力5.早熟，早上市。八、意大利原装进口-瑞思佳瑞思佳-生物刺激素生物刺激素既不是农药，更不是传统肥料。生物刺激素的靶标是农作物本身。它可以改善植物的生理生化状态。生物刺激素提高农药效果和肥料的利用率，改善农作物抵抗逆境的水平，当然生物刺激物也改善农作物的最终产量和农产品品质。技术参数：物理形态: 液态 – 深棕色悬浮液20°C密度: 约 1,20 g/mlpH (1%水溶液): 7.0 + 0.5兼容性: 减少剂量与微量元素产品进行测试 ,与所有植物检疫兼容良好瑞思佳功效：促进植物生长帮助作物克服生物和非生物压力条件提高种子质量和发芽率缓解除草剂或农药过度施用产生的药害提升作物抗逆性促进肥料和其它叶面肥的吸收一年之计在于春，经营之计在于勤，2016的麦田，首战要必胜，准备好了吗？&&禾雨科学种植(jinanheyu)　
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