感受态细胞转化实验的阴性和阳性对照 阴性对照的作用

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-07-29 04:28 标签： 质粒转化感受态细胞
感受态细胞制好后转化不成功_百度知道
感受态细胞制好后转化不成功
培养基中加了AMP？是不是不用加IPTG，加这两个的原理是什么，然后用质粒做连接，怎么回事啊？还有我用jm109做感受态细胞，X-Gal了，X-Gal？最好要原理，专业的，没长出菌落，具体点，IPTG
提问者采纳
表明感受态大肠杆菌活性强，同时表达两个片段可融和（α互补）形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶，没有的话是不会长的，菌长成一片，诱导β-半乳糖苷酶表达JM109应该也是lac-突变型的。首先你用的质粒是否有amp抗性,X-gal的LB平板上涂不加其它试剂的感受态大肠杆菌，而大肠杆菌的lac-突变型DH5α可编码β-半乳糖苷酶的C端。外源DNA插入多克隆位点,IPTG，JM109中本身不带有氨苄抗性。阳性对照是在一不加氨苄。IPTG是诱导物，表明抗生素没有问题，插入失活了lacZ基因，没有菌落生长。也可以加带有AMP抗性和LacZ的质粒的大肠杆菌，单独表达这两个片段均无β-半乳糖苷酶活性，IPTG，便于分析是感受态细胞的原因 还是转化的问题等等阴性对照是在含有氨苄，此外你还得做阴性和阳性对照，因此带重组质粒的菌落呈白色，在生色底物X-gal存在时形成蓝色菌落，破坏了α互补：质粒如pUC18上带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸（N端）蓝白筛选的原理，X-gal的LB平板上涂不加其它试剂的感受态大肠杆菌
其他类似问题
为您推荐：
感受态细胞的相关知识
其他1条回答
amp浓度高了，
等待您来回答
下载知道APP
随时随地咨询
出门在外也不愁大肠杆菌转化实验的两个两个阴性对照是什么，作用是什么_百度知道
大肠杆菌转化实验的两个两个阴性对照是什么，作用是什么
一个是检验感受态细胞有没有抗性，另一个是检验抗生素是否有效
知道智能回答机器人
我是知道站内的人工智能，可高效智能地为您解答问题。很高兴为您服务。
其他类似问题
为您推荐：
等待您来回答
下载知道APP
随时随地咨询
出门在外也不愁下面的方法是对Cohen等于1972年发表的方法更为便捷的修改。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆/ug超螺旋质粒DNA。
下面的方法是对Cohen等于1972年发表的方法更为便捷的修改。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5&106-2&107个转化克隆/ug超螺旋质粒DNA。这个转化效率对于方便地进行质粒中克隆已经足够高了。用此方法制备的感受态细胞可以在-70℃冻存。但随着冻存期的延长，转化效率会有所降低。
缓冲液和溶液：
CaCl2.2H2O(1mol/L)：
制备感受态细胞是，取出1 ml贮存液加90ml纯水稀释至100ml，用预先处理的Nalgene滤膜（0.45um孔径）过滤除菌，放置冰上。
或 标准的转换缓冲液（TFB）：
对许多大肠杆菌的在军中，用标注TFB代替CaCl2可获得一致或更好的结果
MgCl2-CaCl2溶液，冰上预冷
B或SOB培养液（培养最初的细胞生长物）：
SOB糖，含20mmol/L MgSO4和适当的。
标准的SOB板含10mmol/L MgSO4
SOC培养液：
每个转化反应约需1ml。
核酸和寡：
质粒DNA（重组质粒）
Sorvall GSA 转头或与之相当的转头
易生物试剂库
专用设备：
聚丙烯管（50mm），冰上预冷
聚丙烯管（17*100mm；Falcon2059），冰上预冷
可调至42℃的装置
易生物仪器库
重要：本方案的所有操作都必须在无菌条件下进行。
制备感受态细胞：
1、从37℃培养16-20h的平板中挑取一个单菌落（直径2-3mm），转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h。一般经验，1OD600约含有大肠杆菌DH1&109个/ml。
为达到高效转化，活细胞数务必少于108 细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于OD600值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20min测定OD600 来监测，用监测的时间及OD600 列一个图表，以便预测培养物OD600值达到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
在菌株和菌株之间，OD600值与每毫升活细胞数见的关系变化很大，因此有必要通过测定特异大肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并将各稀释浓度的培养物铺于物的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞数，从而使读数得到标准化。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至.0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3 转头以4100r/min离心10min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4℃用Sorvall GS3 转头以4100r/min离心10min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管导致1min以使最后的痕量培养液流尽。
8、每50mo初始培养物用2ml用并预冷的0.1mol/L CaCl2（或TFB）重悬每份细胞沉淀。
9、此时，可以按步骤10-16用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于-70℃。
包括阳性和阴性对照
10、用冷却的无菌从每份用CaCl2溶液制备的感受态悬液中西区200ul转移到无菌（17*100mm）中，每管加入DNA（用不超过10ul的体积，其中的DNA小于50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。
11、将管放入预加热至42℃的循环中，恰恰放置90s，不要摇动管。
热激是一个关键步骤，准确地达到热敷温度非常重要。
12、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。
13、每管加800ulSOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
复苏期中应于37℃温和地摇动细胞（用低于50r/min转速的）。
14、将适当体积（每个90mm平板达200ul）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4
和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。
如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平米上（或软琼脂中），可以现在微量哈桑室温离心20s以收集转化菌，加100ulSOC重悬沉淀，轻轻混匀。
重要：玻璃铺菌器需先在乙醇在浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板上。
如检查氨苄青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养的时间按不超过20h。氨苄青霉素抗性的转化体可将&-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间按过长都会导致出血对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60ug/ml提高到100mg/ml,可使情况有所改善，但不能产地根除之。抗氨苄青霉素的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线形比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。
15、将平板置于室温直至液体被吸收。
16、倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。
技术频道 - 生物实验技术资料库！
DNA实验技术交流论坛：
最新发布产品
<input type="hidden" name="content" value=" " />
Copyright &
易生物VIP企业推荐质粒DNA转化试验中的阴性对照是什么?设置阴性对照的原因
不加质粒DNA看感受态细胞有没有污染及抗生素有没有失效.
为您推荐：
其他类似问题
扫描下载二维码质粒转化的阳性和阴性对照是什么
质粒转化的阳性和阴性对照是什么
09-10-14 &
阴性对照涂布的应该是没有转质粒的空菌吧？我觉得可能有三个原因：1，你的amp平板失活，可能是你加抗生素的时候培养基温度太高。如果这样，你的平板就相当于是无抗的。2，无菌操作失误，带入了其他有抗性的杂菌。3，你的空菌被转入质粒的菌污染了。或者你的菌本身有污染。鉴定的方法很简单，重点是你的阴性对照菌。做个菌落pcr看有没有目的带，或者直接挑单菌落用amp培养基（要保证不失活）摇菌过夜看长不长。
请登录后再发表评论!
不同的对照可以说明不同的问题1。双蒸水代替连接产物 检测酶切的好坏，或自连的程度如果是单酶切的产物，就好去磷酸化， 否则会大量自连如果是双酶切的产物，检测是否都已完全切割，特别是对于酶切为点比较近的。2。空载体最好是一定量的，比如1 ng, 0.1 ng的质粒，可检测感受态细胞的效价。我建议做双蒸水代替连接产物 铺抗性 的阴性对照和用已知量的质粒转化的对照。要根据你具体的实验目的设计不同的对照，以防实验失败时，可从对照实验中找原因。
请登录后再发表评论!

我要回帖

更多关于 质粒转化感受态细胞 的文章

 

随机推荐