GPX和SOD协同作用模拟和新含硒肽的抗肿瘤作用--《吉林大学》2007年博士论文
GPX和SOD协同作用模拟和新含硒肽的抗肿瘤作用
【摘要】：
活性氧(ROS)是具有高度反应性的O_2的代谢产物,可以被生物体内的抗氧化系统(非酶抗氧化剂和抗氧化酶)及时清除,维持体内自由基的平衡。抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。任何一种抗氧化酶都不能清除所有类型的活性氧,需要多种酶的协同作用才能完成。而且过量的SOD单独使用,可能会产生大量的H_2O_2毒害机体。因此,SOD与其他过氧化物清除酶如GPX结合使用是十分必要的。
GPX是一种含硒酶,其中的硒成分除了构成GPX这种重要的抗氧化酶之外,还被认为是一种有效的抗癌剂。含硒化合物依布硒等已表现出抗肿瘤的生物活性,而且它还是典型的GPX模拟物,因此我们希望了解其它的GPX模拟物是否也具有抗肿瘤效果,以及GPX的抗氧化与抗肿瘤的关系,这在现实生活中具有极其重要的意义。
目前抗肿瘤的硒化合物:亚硒酸盐、甲基硒代半胱氨酸和依布硒等或者毒性较大,或者溶解度差,我们希望应用人体的天然硒成分-硒代半胱氨酸(Sec),但是Sec溶解度也很低,代谢时间短,不宜直接应用。因此,我们利用Arg-Gly-Asp (RGD)三肽与α_vβ_3整合素具有较高亲和力的特点构建并合成了Sec-RGD肽,最终得到的是其氧化形式Asp-Gly-Arg-Sec-Sec-Arg-Gly-Asp,即Se8P。活力和动力学分析显示Se8P同时也是GPX模拟物。细胞学研究表明,Se8P对H_2O_2诱导的非洲绿猴肾vero细胞损伤有明显的保护作用。
肿瘤细胞学研究表明,Se8P能够诱导人黑素瘤A375细胞凋亡,凋亡由ROS的生成而启动,并且线粒体膜受到损伤。我们还发现谷胱甘肽(GSH)对Se8P诱导A375细胞凋亡起到抑制作用,说明GPX模拟物Se8P在诱导肿瘤细胞凋亡时需要克服自身的抗氧化功能。含硒肽Se8P的这种能够诱导肿瘤细胞凋亡的能力使其有望开发成为抗肿瘤新药。
在生物体内,SOD、GPX和CAT相互协同清除各种活性氧,并且这种协同作用对机体的正常代谢至关重要。我们利用罗贵民实验组开发的SOD模拟物17CuP和GPX模拟物15SeP ,构建了并合成了双功能酶前体多肽32P,再经硒化和鳌合铜得到最终产物Se-Cu-32P。活力测定证实了Se-Cu-32P是一种新的双功能酶多肽模拟物。细胞学研究表明,在H_2O_2和XOD/Xanthine/ Fe~(2+)两种活性氧产生体系中,Se-Cu-32P可抑制活性氧对非洲绿猴肾vero细胞的损伤,而天然SOD在XOD/Xanthine/ Fe~(2+)损伤体系中可加剧活性氧对vero细胞的损伤。我们的结果证实了抗氧化酶的协同作用对维持细胞正常功能的重要性。Se-Cu-32P作为一种新的双功能酶模拟物有望被开发成为有前途的治疗活性氧自由基引起的相关疾病的新药。
【关键词】：【学位授予单位】：吉林大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：R730.5【目录】：
第一章 本论文立论依据15-23
第二章 含硒肽模拟谷胱甘肽过氧化物酶23-47
第一节 序言23-24
第二节 硒代半胱氨酸及其衍生物的合成24-30
一、实验材料24-25
1、药品和试剂24-25
2、实验仪器25
二、实验方法25-28
1、β－氯－丙氨酸的合成25-26
2、硒代胱氨酸(Selenocystine)的合成26-27
3、H-Sec(PMB)-OH 的合成27
4、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的合成27-28
5、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的质谱分析28
三、结果和讨论28-30
1、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的合成28-29
2、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的表征29-30
第三节 具有 GPX 活性的硒肽的合成及性质研究30-42
一、实验材料30-32
1、药品和试剂30-31
2、肽合成主要试剂的配制31-32
3、实验仪器32
二、实验方法32-35
1、含硒肽合成32-33
2、合成硒肽的表征33-34
3、GPX活力测定34
4、稳态动力学研究34-35
5、最适温度和最适pH35
三、结果与讨论35-41
1、硒肽的合成与纯化35-36
2、硒肽的质谱分析36-37
3、含硒多肽的硒含量检测37
4、Se8P 的GPX 活力37
5、Se8P的稳态动力学37-39
6、Se8P 的最适pH 和最适温度39-41
四、讨论41-42
本章小节42-43
参考文献43-47
第三章 含硒肽诱导人黑素瘤 A375 细胞凋亡47-73
第一节 序言47-48
第二节 含硒多肽诱导黑素瘤细胞凋亡48-57
一、实验材料48-49
1、主要试剂48
2、主要仪器48
3、试剂配制48-49
二、实验方法49-53
1、细胞培养49-50
2、细胞形态学观察50
3、MTT 法测细胞存活率50-51
4、细胞胞浆酶—乳酸脱氢酶(LDH)含量测定51-52
5、二苯胺(DPA)法分析细胞内的DNA片段化52
6、统计学分析52-53
三、结果与讨论53-56
1、细胞形态学分析53
2、Se8P对人黑素瘤A375细胞的生长抑制53-54
3、Se8P对A375细胞的毒性作用54-55
4、A375细胞DNA片段化分析55-56
四、讨论56-57
第三节 含硒多肽诱导黑素瘤细胞凋亡的机制57-69
一、实验材料57-58
1、主要试剂57
2、主要仪器57
3、试剂配制57-58
二、实验方法58-62
1、细胞培养58-59
2、A375 细胞内活性氧的荧光检测59
3、A375细胞内活性氧的流式细胞仪检测59
4、A375 细胞内线粒体跨膜电位的荧光检测59-60
5、A375 细胞内线粒体跨膜电位流式细胞仪检测60
6、细胞胞浆谷胱甘肽过氧化物酶活力检测60-61
7、细胞内谷胱甘肽含量的检测61
8、GSH，DTT和SOD对Se8P诱导A375细胞凋亡的影响61
9、统计学分析61-62
三、结果和讨论62-67
1、Se8P 诱导细胞内活性氧(ROS)的产生62
2、Se8P 诱导的细胞内活性氧(ROS)的流式细胞仪检测62-63
3、Se8P诱导A375细胞内线粒体跨膜电位(△Ψm)变化的荧光检测63-64
4、Se8P 诱导的细胞内线粒体跨膜电位的流式细胞仪检测64-65
5、Se8P 引起A375 细胞内GPX 和GSH 的变化65-66
6、GSH，DTT 和SOD 对Se8P 诱导A375 细胞凋亡的影响66-67
四、讨论67-69
本章小节69
参考文献69-73
第四章 具有SOD和GPX活力的双功能含硒多肽73-92
第一节 序言73-74
第二节 双功能酶的多肽前体的合成和表征74-80
一、实验材料74-76
1、药品和试剂74-75
2、肽合成主要试剂的配制75-76
3、实验仪器76
二、实验方法76-78
1、多肽合成76-77
2、合成多肽的表征77-78
三、结果与讨论78-80
1、双功能酶多肽前体的构建78
2、多肽的合成与纯化78
3、多肽的 HPLC 分析78-79
4、多肽的质谱分析79-80
四、结论80
第三节 双功能模拟物的制备和性质研究80-88
一、实验材料80-81
1、药品和试剂80
2、实验仪器80-81
二、实验方法81-83
1、NaHSe的制备81
2、含硒多肽的制备81
3、含硒多肽与铜螯合81
4、硒含量的测定81-82
5、铜含量的测定82
6、双功能多肽的 GPX 活力测定82
7、双功能多肽的 SOD 活力测定82-83
8、双功能多肽的GPX活力的稳态动力学研究83
三、结果和讨论83-87
1、双功能多肽的合成83-84
2、Se-Cu-32P的表征84
3、双功能多肽的GPX 活力和SOD 活力84-85
4、双功能多肽 GPX 活力的稳态动力学85-87
四、讨论87-88
本章小节88-89
参考文献89-92
第五章 含硒多肽的抗氧化生物学效应研究92-109
第一节 序言92-93
第二节 GPX 模拟物的生物学效应93-98
一、实验材料93-94
1、主要试剂93
2、主要仪器93
3、试剂配制93-94
二、实验方法94-95
1、细胞培养94
2、H_2O_2对vero细胞的损伤94
3、MTT 法测细胞存活率94-95
4、LDH 含量测定95
5、统计学分析95
三、结果与讨论95-98
1、H_2O_2对vero细胞存活率的影响95-96
2、GPX模拟物对H_2O_2 损伤的vero细胞的保护作用96-97
3、GPX模拟物对H_2O_2泄漏vero细胞LDH的影响97-98
第三节 双功能多肽的生物学效应98-104
一、实验材料98-99
1、主要试剂98-99
2、主要仪器99
3、试剂配制99
二、实验方法99-101
1、细胞培养99-100
2、H_2O_2 对vero细胞的损伤100
3、XOD/Xanthine/Fe~(2+)对vero细胞的损伤100
4、MTT 法测细胞存活率100-101
5、统计学分析101
三、结果和讨论101-103
1、双功能酶对H_2O_2 损伤的培养vero 细胞的保护作用101-102
2、双功能酶对XOD/Xanthine/Fe~(2+)损伤的培养vero细胞的保护作用102-103
四、讨论103-104
本章小节104-105
参考文献105-109
作者简历109
博士期间已发表和待发表的文章109-111
致谢111-112
中文摘要112-116
ABSTRACT116-119
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摘要：血硒水平的高低与癌的发生有莫大的关系。大量的调查资料说明，一个地区食物和土壤中硒含量的高低与癌症的发病率有直接关系。同时科学界也认识到硒具有预防癌症作用，堪称人体微量元素的“防癌之王”。
　　硒是人体必需的微量元素，与人类健康密切相关，有很重要的生理功能。硒能预防和降低患癌的机率，延缓衰老、保证心系统的正常功能、降低动脉硬化和冠心病的患病率、降低肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌和直肠癌的发病率。由于的黏性、胶质性的物质，在人体内遇到重金属离子时，会自动与重金属离子结合，由排泄系统排出体外，起到解毒作用。同时白蛋白对胃壁还有保护作用。
　　富硒肽白为人体提供充足的维生素、蛋白质及微量元素，其中硒含量为众多蛋白粉中最高。富硒肽白蛋白粉工艺提炼完美，对人体吸收起着重要作用。
　　富硒肽白蛋白粉的功能作用：
　　1、改善微循环，提高新陈代谢的功能，维持人体各种机能的均衡。
　　2、增强维生素吸收的效果，提高抗病的能力。
　　3、改善癌症人群免疫功能，增强体质。
　　富硒肽白蛋白粉适宜人群：
　　1、癌症各阶段的康复。
　　2、免疫力低下者。
　　3、胃肠功能紊乱、，厌食消瘦等。
　　富硒肽白蛋白粉除具补硒功能外，可以补充癌症人群免疫系统的各种蛋白质，增进维生素吸收，调整免疫功能，增强体质。其含有大量能调整胃肠道功能的多肽，可以改善消化、吸收功能，提高抗病能力。富硒肽白蛋白粉的氨基酸序列和人血白蛋白极相似，能提高血液品质，改善微循环，增强新陈代谢。
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全国首个肽硒保健大米品牌落户盐城
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&&& 悦达农业发展公司是一个重点打造品牌农副产品的专营企业，也是目前我市惟一通过ISO质量管理体系认证的农副产品专业生产经营公司。日前，由江苏盐城悦达农业发展公司组织生产的全国首个肽硒功能性保健大米，获得江苏省科技厅立项，这一成果在国内处于领先地位。这也是悦达农业发展公司通过ISO质量管理体系认证后的又一创新成果。　　悦达农业发展公司在取得ISO质量管理体系认证后将其延伸至产业链条当中。该公司基地在水稻生产中推广质量管理体系，实行微量元素可控调节法，增施肽硒生长调节剂，独创了全国首个肽硒功能性保健大米。同时，还在养鸡基地推行“五个统一”的质量管理模式，即统一供应种（苗）鸡、统一饲料配方、统一防疫流程、统一技术指导、统一检测标准。鸡蛋已发展了富硒蛋、生态蛋等六大系，价格较推行标准前提高40%。（市粮食局）
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